草莓枯萎病病原菌分離及13種殺菌劑對(duì)其室內(nèi)毒力測(cè)定

摘 要：從香野草莓發(fā)病根莖部分離得到枯萎病菌株，經(jīng)鑒定屬于尖孢鐮刀菌。采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定13種殺菌劑對(duì)該菌株的室內(nèi)毒力。結(jié)果表明，咪鮮胺和葉菌唑?qū)Σ葺菸〔≡囊种苹钚宰罡撸珽C₅₀值分別為0.051 mg/L和0.060 mg/L。氟硅唑和丙硫菌唑次之，EC₅₀值分別為0.304 mg/L和0.382 mg/L。氟環(huán)唑、吡唑醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑、己唑醇、嘧菌酯、啶酰菌胺、肟菌酯、腈菌唑和氟吡菌胺對(duì)其EC₅₀值分別為0.535 mg/L、0.622 mg/L、0.725 mg/L、1.206 mg/L、1.239 mg/L、1.378 mg/L、1.462 mg/L、1.651 mg/L和2.024 mg/L。上述藥劑均可作為草莓生產(chǎn)中防控枯萎病的高效藥劑。

關(guān)鍵詞：草莓；枯萎病；尖孢鐮刀菌；室內(nèi)毒力

中圖分類號(hào)： S668.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 1002-2910（2024）04-0016-05

收稿日期：2024-04-15

基金項(xiàng)目：山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2023TZXD057、2022CXPT017）；中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專項(xiàng)（YDZX2023031）。

*通信作者：武沖（1983-），男，山東泰安人，副研究員，從事草莓育種與栽培研究。E-mail： wuchongge@163.com

作者簡(jiǎn)介：張榮（1984-），女，山東泰安人，高級(jí)工程師，從事草莓植保研究。E-mail： zrzw5251@163.com

Pathogen isolation of strawberry wilt and the indoor toxicity of 13 fungicides

ZHANG Rong¹， JIANG Lili²， JIANG Wenpeng³， WANG Fengchao⁴， WU Chong^2*

（1.Tai’an Daiyue District Forestry Protection and Development Center， Tai’an，Shandong 271000， China;2.Shandong Institute of Pomology/Shandong Technology Innovation Center of Modern Protected Fruit Trees， Tai’an，Shandong 271000， China; 3.Yantai Shuntai Plant Protection Technology Co. LTD， Yantai， Shandong 265509， China; 4.Plant Protection College， Shandong Agricultural University， Tai’an， Shandong 271018， China）

Abstract：In this study， a pathogenic strain of Fusarium oxysporum was isolated from the diseased rhizome of strawberry wilt. Growth rate method was used to determine the indoor toxicity of 13 fungicides against this strain. The results showed that prochloraz and metconazole had the highest inhibitory activities against Fusarium wilt， with EC₅₀ values of 0.051 mg/L and 0.060 mg/L， respectively. Flusiazole and prothioconazole followed， with EC₅₀ values 0.304 mg/L and 0.382 mg/L， respectively. The EC₅₀ values of epoxiconazole， pyraclostrobin， difenoconazole， hexaconazole， azoxystrobin， boscalid， trifloxystrobin， myclobutanil and fluopicolide against F. oxysporum were 0.535 mg/L， 0.622 mg/L， 0.725 mg/L， 1.206 mg/L， 1.239 mg/L， 1.378 mg/L， 1.462 mg/L， 1.651 mg/L and 2.024 mg/L， respectively. All the above agents could be used as effective agents to control Fusarium wilt in strawberry production.

Key words：strawberry; wilt; Fusarium oxysporum; indoor toxicity

中國(guó)已成為世界第一草莓生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，栽培面積和產(chǎn)量增幅名列前茅^［1］。目前中國(guó)草莓以設(shè)施栽培為主，環(huán)境相對(duì)封閉。加之常年連作、有機(jī)肥料施用不足，導(dǎo)致土壤微生態(tài)環(huán)境惡化，土傳性病害日趨嚴(yán)重^［2］。有報(bào)道稱，草莓在連作區(qū)域種植，土傳病害的發(fā)生率高達(dá)55.0%～91.6%^［3］。草莓枯萎病主要侵染草莓根部，堵塞木質(zhì)部，引起木質(zhì)部褐化、根系壞死，植株枯死，在草莓育苗期和生產(chǎn)期均可發(fā)生^［4］，病原菌在0～20 cm土層內(nèi)的密度最高，其休眠孢子可在土壤中存活數(shù)年。

山東省草莓年栽培面積3.6萬(wàn)hm²（54萬(wàn)畝），位居全國(guó)首位^［5］。近年來(lái)因枯萎病造成的減產(chǎn)現(xiàn)象頻發(fā)。筆者以山東省濰坊市草莓主產(chǎn)區(qū)發(fā)生的枯萎病為研究對(duì)象，進(jìn)行病原菌的分離、鑒定，通過(guò)室內(nèi)毒力試驗(yàn)篩選高效防治藥劑，為草莓枯萎病的科學(xué)防控提供技術(shù)支撐，保障草莓產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑

供試原藥13種：95%丙硫菌唑（山東海利爾化工有限公司）；97%氟環(huán)唑、96%啶酰菌胺、96%葉菌唑、95%己唑醇、95%氟硅唑（山東濰坊潤(rùn)豐化工股份有限公司）；97%咪鮮胺（山東華陽(yáng)農(nóng)藥化工集團(tuán)有限公司）；97%氟吡菌胺（德州綠霸精細(xì)化工有限公司）；98%吡唑醚菌酯、97%苯醚甲環(huán)唑、98%腈菌唑、98%肟菌酯（山東省聯(lián)合農(nóng)藥工業(yè)有限公司）；98%嘧菌酯（山東京博農(nóng)化科技股份有限公司）。

1.2 草莓枯萎病病原菌分離

從山東省濰坊市壽光市草莓基地采集香野草莓的枯萎病株，以滅菌濕報(bào)紙保濕帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

將病株以流水沖洗干凈，用吸水紙吸干水分后放于超凈工作臺(tái)上，以滅菌刀片切取病健交界組織，用2%次氯酸鈉溶液消毒10 min，無(wú)菌水沖洗3次，無(wú)菌濾紙吸干水分，接種于PDA培養(yǎng)基平板中央，25 ℃黑暗培養(yǎng)3～4 d。待菌落長(zhǎng)成后，觀察形態(tài)特征，從數(shù)量最大的菌落邊緣挑取菌絲重新接種于新的PDA平板中央進(jìn)一步分離純化。

根據(jù)柯赫氏法則^［6］，將純化得到菌株制備直徑7 mm的菌餅，回接到香野草莓幼苗莖基部，常規(guī)栽培管理，觀察回接幼苗的發(fā)病癥狀與原癥狀是否一致。

1.3 病原菌鑒定

采用CTAB法提取菌絲基因組DNA，以ITS序列通用引物（ITS1/ITS4）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收、純化后，連接載體并轉(zhuǎn)化、克隆、測(cè)序。將測(cè)得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)后，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 室內(nèi)藥劑毒力測(cè)定

1.4.1 藥劑配制 將供試的13種原藥中，95%氟硅唑原藥以環(huán)己酮配制1%母液外，其余原藥均以丙酮配制1%的母液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)預(yù)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)調(diào)整試驗(yàn)濃度，確定各供試原藥的5個(gè)配制濃度（表1）。

1.4.2 藥劑毒力試驗(yàn) 采用菌絲生長(zhǎng)速率法^［6］，在超凈工作臺(tái)上，以無(wú)菌水對(duì)供試藥劑原液進(jìn)行梯度稀釋。分別移取1 mL各濃度藥液，加入49 mL滅菌冷卻至50～60 ℃的PDA培養(yǎng)基中，充分混勻后制備3個(gè)含藥PDA平板。平板凝固后，以內(nèi)徑7 mm的滅菌打孔器，從活化好的草莓枯萎病菌菌落邊緣打取菌餅，接種于含藥PDA平板中央，以滅菌水代替藥液為對(duì)照。25 ℃黑暗培養(yǎng)，待對(duì)照組菌落長(zhǎng)至培養(yǎng)皿2/3左右時(shí)，以十字交叉法^［7］測(cè)定各處理的菌落直徑。計(jì)算各濃度藥液處理的抑制率。

抑制率（%）=（對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）×100

1.4.3數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 18.0軟件，將抑制率轉(zhuǎn)換成概率值，以藥劑濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)、抑制率概率值為縱坐標(biāo)，計(jì)算線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。根據(jù)回歸方程計(jì)算抑制中濃度（EC₅₀）值和95%置信限^［8］。以活性最低藥劑的EC₅₀值為基準(zhǔn)值，計(jì)算其他藥劑的相對(duì)毒力指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓枯萎病病原菌分離

通過(guò)分離培養(yǎng)得到菌落11個(gè)，根據(jù)形態(tài)合并為3類，數(shù)量分別為7個(gè)、3個(gè)和1個(gè)。將其中數(shù)量最大的菌株進(jìn)行純化，純化后如圖1所示，菌落圓形，整體生長(zhǎng)速度較慢，菌絲淺紫色，較密實(shí)，呈棉絮狀，培養(yǎng)后期可見(jiàn)白色孢子囊。菌落背面有紫色同心圓，與劉植鑫等^［9］報(bào)道的草莓枯萎病病原菌生物學(xué)特征一致。

將分離得到的草莓枯萎病菌株菌餅回接至草莓幼苗莖基部，10 d后發(fā)病癥狀與原枯萎病癥狀一致。

2.2 病原菌鑒定

對(duì)分離得到的草莓枯萎病菌株進(jìn)行ITS測(cè)序得到1段長(zhǎng)度517 bp的序列，通過(guò)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）相似度為100%。進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，該菌株與尖孢鐮刀菌的親緣關(guān)系最近（圖2），結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將其鑒定為尖孢鐮刀菌。

2.3 13種殺菌劑對(duì)草莓枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率

由表2可知，4種藥劑對(duì)草莓枯萎病的抑制活性高：咪鮮胺和葉菌唑在濃度為0.025～0.500 mg/L時(shí)，抑制率為33.56%～93.61%和29.30%～92.17%；氟硅唑和丙硫菌唑，濃度為0.100～2.500 mg/L時(shí)，抑制率分別為27.73%～88.85%和23.73%～87.23%；氟環(huán)唑、吡唑醚菌酯和苯醚甲環(huán)唑在濃度為0.250～5.000 mg/L時(shí)，抑制率分別為31.68%～93.42%、27.23%～91.36%和22.85%～88.73%；另9種藥劑對(duì)草莓枯萎病的抑制活性較低：己唑醇在濃度為0.500～10.000 mg/L時(shí)的抑制率為29.99%～89.92%，與此同樣濃度梯度下，嘧菌酯的抑制率為31.74%～88.35%，啶酰菌胺的抑制率為27.23%～89.73%，肟菌酯的抑制率為29.18%～84.16%，腈菌唑的抑制率為23.73%～87.16%，氟吡菌胺的抑制率為20.22%～85.03%。

2.4 13種殺菌劑對(duì)草莓枯萎病菌的室內(nèi)毒力

由表3可知，供試13種殺菌劑對(duì)草莓枯萎病菌均表現(xiàn)出較高的室內(nèi)毒力。其中，氟吡菌胺的最低，抑制中濃度EC₅₀值為2.024 mg/L。以此EC₅₀值為基準(zhǔn)值，計(jì)算其他藥劑的相對(duì)毒力指數(shù)。咪鮮胺和葉菌唑?qū)Σ葺菸【z生長(zhǎng)的室內(nèi)毒力最高，EC₅₀值分別為0.051 mg/L和0.060 mg/L，相對(duì)毒力指數(shù)分別為39.69和33.73。氟硅唑和丙硫菌唑次之，EC₅₀值分別為0.304 mg/L和0.382 mg/L，相對(duì)毒力指數(shù)分別為6.66和5.30。氟環(huán)唑、吡唑醚菌酯和苯醚甲環(huán)唑的對(duì)草莓枯萎病菌的室內(nèi)毒力也較高，EC₅₀值分別為0.535 mg/L、0.622 mg/L和 0.725 mg/L，相對(duì)毒力指數(shù)分別為3.78、3.25和2.79。己唑醇、嘧菌酯、啶酰菌胺、肟菌酯和腈菌唑的EC₅₀值分別為1.206 mg/L、1.239 mg/L、1.378 mg/L、1.462 mg/L和1.651 mg/L，相對(duì)毒力指數(shù)分別為1.68、1.63、1.47、1.38和1.23。

3 小結(jié)與討論

在濰坊市草莓主產(chǎn)區(qū)分離得到1株草莓枯萎病致病菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確認(rèn)是尖孢鐮刀菌。此菌可以以厚垣孢子或分生孢子的形式在病殘?bào)w上或土壤中休眠、越冬。條件適宜時(shí)，孢子萌發(fā)，從草莓根部傷口或根尖處侵入，在維管束內(nèi)增殖，分泌毒素，堵塞植株輸導(dǎo)組織，導(dǎo)致植株水分供應(yīng)不足，蒸騰作用受阻，引起萎蔫死亡^［10］。 由于病菌侵染部位較為隱蔽，潛伏期較長(zhǎng)，對(duì)草莓枯萎病的防治需以預(yù)防為主。《中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)》顯示，登記用于草莓枯萎病的藥劑產(chǎn)品僅7個(gè)，且以木霉菌、枯草芽孢桿菌等生防菌劑為主，缺乏高活性殺菌劑。

本研究對(duì)13種殺菌劑原藥通過(guò)室內(nèi)毒力測(cè)定發(fā)現(xiàn)，咪鮮胺和葉菌唑?qū)Σ葺菸【氖覂?nèi)毒力最高，EC₅₀值分別為0.051 mg/L和0.060 mg/L，相較于氟吡菌胺的相對(duì)毒力倍數(shù)分別為39.69和33.73。氟硅唑和丙硫菌唑次之，EC₅₀值分別為0.304 mg/L和0.382 mg/L。上述藥劑均可作為草莓生產(chǎn)中防控枯萎病的高效藥劑。

咪鮮胺屬于咪唑類殺菌劑，通過(guò)抑制真菌體內(nèi)麥角甾醇合成、破壞菌體細(xì)胞膜功能而達(dá)到殺菌作用，是防治瓜果蔬菜的炭疽病、根腐病等高效藥劑^［11］。嚴(yán)蕾艷^［12］等報(bào)道，咪鮮胺對(duì)引起瓜類根腐病的多種鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)均表現(xiàn)出較高的抑制作用，平均EC₅₀值0.135 mg/L。藺秀婷^［13］等報(bào)道了一種引起甜瓜枯萎病的新致病菌—擬輪枝鐮刀菌，室內(nèi)毒力測(cè)定發(fā)現(xiàn)，咪鮮胺和氟硅唑?qū)ζ湟种苹钚愿撸珽C₅₀值分別為0.0295 μg/mL和0.1901 μg/mL。

葉菌唑是日本吳羽化學(xué)工業(yè)公司在對(duì)三唑類殺菌劑結(jié)構(gòu)剖析的基礎(chǔ)上，通過(guò)定量構(gòu)效關(guān)系合成的高性能三唑類殺菌劑，對(duì)鐮刀菌引起的病害具有極高活性^［14］，殺菌譜廣、有內(nèi)吸性，兼具保護(hù)和治療作用，目前主要登記用于谷類作物病害防治，尚未在草莓上獲得登記。赫丹等^［15］報(bào)道，葉菌唑?qū)τ衩姿敫≈虏【喼︾牭毒囊种苹钚暂^高，菌絲生長(zhǎng)EC₅₀值在0.005～0.029 μg/mL之間。

氟硅唑?qū)儆谌蝾悮⒕鷦瑢?duì)子囊菌、擔(dān)子菌及部分半知菌引起的病害防治高效^［16］。田鳳鳴^［17］等報(bào)道，氟硅唑?qū)ń犯〔≡迅犳呔氖覂?nèi)毒力較高，EC₅₀值為2.08 mg/L。

丙硫菌唑是拜耳公司開發(fā)的新型三唑硫酮類殺菌劑，通過(guò)抑制真菌體內(nèi)甾醇前體羊毛甾醇脫甲基化而起到殺菌作用，殺菌譜廣，對(duì)多種作物土傳和葉部病害高效^［18］。項(xiàng)丹丹^［19］等報(bào)道，丙硫菌唑?qū)σ鹣憬犊菸〉牟≡怄哏牭毒虐蛯；途哂休^高的抑制活性，EC₅₀值為0.79 μg/mL。

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