35份綠豆種質資源萌發期耐鹽堿性綜合評價及耐鹽堿機制分析

關鍵詞：綠豆；萌發期；鹽堿脅迫；綜合評價；生理響應；核酸損傷修復

綠豆[Vigna radiata （L.）R．Wilczek]是豆科豇豆屬一年生直立草本植物。綠豆籽粒富含淀粉、蛋白質、礦物質和維生素等營養成分，可加工制成多種菜品，故有“食中佳品，濟世長谷”之稱。隨著人們生活水平提高和健康意識增強，綠豆的需求量顯著增加。

綠豆原產于中國，在中國已有兩千余年的栽培史。綠豆在全國各地均有種植，產區主要集中在黃淮流域及東北和華北地區。目前，我國現有鹽漬化及次生鹽漬化的耕地達4x107hm2以上，約占我國耕地面積的10%，主要分布在東北、西北、中北部、華北和濱海五大區域。其中，中國東北地區主要為蘇打鹽堿地，鹽堿地面積居世界蘇打鹽堿化土壤前三位。土壤鹽堿化嚴重影響綠豆生長和產量形成，因此，篩選適宜鹽堿地區種植的綠豆種質資源對其品種選育和產量提高意義重大。

與溫度、水分等非生物脅迫不同，鹽堿脅迫在植物生長初期就已經存在，并一直伴隨其整個生育期。因此，在種子萌發期進行耐鹽堿性篩選，能夠快速準確反映植株的抗逆水平。目前，關于綠豆種質資源耐鹽堿性篩選和評價體系建立的研究已有一些報道。于崧等對30個不同基因型綠豆萌發期和苗期的耐鹽堿性進行分析和評價表明，萌發期的活力指數、發芽率、根冠比、胚根長、胚芽長可以作為耐鹽堿性強弱評價的關鍵指標：苗期的葉片凈光合速率、相對電導率、最大光化學效率、可溶性糖含量、初始熒光及地上干重和地下鮮重可作為耐鹽堿性強弱評價的關鍵指標。胡亮亮等在苗期用150mmol·L-1NaCl溶液模擬鹽脅迫對346份國內外綠豆種質進行處理，通過主成分分析、隸屬函數分析、耐鹽性綜合評價分析、聚類分析等方法進行綜合評價和耐鹽性鑒定，結果表明根鮮重、根干重、根長、根分枝數、根體積和地上部鮮重是綠豆苗期耐鹽性評價的主要指標。李小雷等利用6個不同濃度NaCl溶液對19份綠豆資源進行萌發期的耐鹽性鑒定，篩選得到高耐鹽材料4份和耐鹽材料14份。

植物在遭遇逆境脅迫時，過量積累的活性氧（ROS）會引起膜脂過氧化、酶活性喪失、蛋白質降解、呼吸作用異常等現象。當植物體內的ROS產生和代謝發生紊亂時，植物會啟動多種抗氧化機制（包括酶促系統和非酶促系統）來應對ROS過量積累所帶來的傷害。酶促系統一般包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）和單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）等。綠豆在鹽脅迫下常表現為提高滲透調節物質含量和抗氧化酶活性。近年來的研究發現，過量積累的ROS能夠攻擊基因組DNA，破壞核酸的穩定性，最終導致DNA損傷。基因組核酸一旦受到不可逆的損傷，就會引起植物體一系列的變化，包括基因表達調控紊亂、生理生化進程受阻等，甚至引起生長發育異常，最終導致生物量和產量降低。對于植物中DNA損傷修復研究，在由UV-B、重金屬等引發的擬南芥基因組損傷中較為深入。近年來在菜豆、大豆、黑小麥、煙草等的研究中發現鹽脅迫等非生物脅迫也能夠引起基因組損傷。然而，目前關于鹽堿脅迫與綠豆DNA損傷的關系、不同耐鹽堿性綠豆資源抗氧化能力與基因組穩定性的聯系等問題還研究較少。

韓毅強等研究表明，大慶地區的鹽堿土壤類型屬于硫酸鹽型蘇打鹽堿土，土壤鹽堿成分含量比為NaCl：Na2 C03：Na2 S04：NaHC03=1：1：9：9，pH值8.9，Na+總量為80

mmol·L-1。本研究選擇上述類似混合鹽堿溶液進行綠豆資源篩選，更有利于大慶地區耐鹽堿資源的鑒定和品種選育。綠豆屬于低耐鹽作物，我們的預試驗（結果未列出）也表明在80mmol·L-1的上述鹽堿溶液中，大部分綠豆資源表現為發芽率及相關發芽指標受到嚴重抑制，故選用40 mmol·L-1的中等濃度混合鹽堿溶液進行綠豆資源篩選較為合適。

本試驗對35份綠豆種質材料進行萌發期鹽堿脅迫處理，對萌發相關的14個指標進行隸屬函數分析、主成分分析、相關分析、回歸分析和聚類分析，對不同綠豆種質資源的耐鹽堿性進行綜合鑒定和評價，對篩選出的耐鹽堿綠豆種質進行抗氧化酶活性和基因組DNA的隨機擴增多態性DNA標記（RAPD）分析，旨在建立耐鹽堿綠豆資源的篩選指標和評價方法，明確鹽堿脅迫與綠豆DNA損傷的關系以及不同耐鹽堿性綠豆資源抗氧化能力與基因組穩定性的關系，為鹽堿地區綠豆品種選育、耐鹽堿綠豆優異資源篩選以及綠豆耐鹽堿基因鑒定提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試35份綠豆種質材料均由黑龍江八一農墾大學作物種質資源創新實驗室提供，保存于國家雜糧工程技術研究中心種質資源庫。種質材料名稱見表1。

1.2試驗設計

試驗于2023年6月在國家雜糧工程技術研究中心進行。試驗以蒸餾水為對照，以40mmol·L-1鹽堿溶液（NaCl：Na- C03：Na2 S04： NaHC03=1：1：9：9， pH值8.9）進行鹽堿脅迫（SA）處理。選取大小均一、飽滿健康的綠豆籽粒，2.0%次氯酸鈉滅菌10min，蒸餾水洗滌2次，處理液（蒸餾水或40mmol.L-1鹽堿溶液）再次清洗2次。將沖洗后的種子均勻擺放在鋪有雙層濾紙的培養皿中，每皿15粒種子，種子表面覆蓋1層濾紙，加6mL處理液。培養皿置于恒溫人工氣候箱中，設置溫度（25±1）℃，黑暗培養7d。每天更換濾紙和處理液。每處理重復3次。

1.3測定指標及方法

當綠豆種子胚根長度大于種子長度時視為萌發。第5天時，按照《農作物種子檢驗規程發芽試驗》（GB/T 3543.4-1995），統計綠豆種子發芽勢（GE）；第7天時，統計種子發芽率（GR），選擇10粒有代表性的種子測定胚根長（RL）、總鮮重（TFW）、子葉鮮重（CFW）和胚根鮮重（RFW）。85℃烘干樣品至恒重，測定其總干重（TDW）、子葉干重（CDW）和胚根干重（RDW），并計算活力指數（VI）、子葉相對含水量（CWC）、胚根相對含水量（RWC）和根冠比（R/S）。

相關指標計算公式如下：

（1） GE（%）=第5天發芽種子粒數／供試種子粒數×100；

（2） GR（%）=第7天發芽種子粒數／供試種子粒數×100：

（3）發芽指數（GI）=∑Gt/Dt，其中，Gt為第t天的發芽種子粒數，Dt為相應的發芽天數；

（4）VI=發芽指數×胚根鮮重；

（5）CWC（%）=（CFW-CDW）/CFWx100;

（6）RWC（%）=（RFW-RDW）/RFWx100;

（7）R/S=胚根干重／子葉干重；

（8）綜合評價相關指標：

1.4胚根DNA提取與RAPD分析

利用CTAB法進行樣品DNA提取，Nanodrop 2000測定DNA質量和濃度。將DNA濃度稀釋至100ng·uL-1后，利用黑龍江八一農墾大學作物種質資源創新實驗室前期建立的方法進行基因組DNA的RAPD分析。試驗設置3次生物學重復和3次技術重復，每次試驗中至少出現2次RAPD片段的定義為有效多態性差異。隨機擴增多態性引物序列為Random Primer 1：5 7-CT-GCGCTGGA-3'; Random

Primer 2：5'-CT-GGGGCTGA-3'; Random Primer 3：5'-GGTG-GTGATG-3';Random Primer 4：5'-AAAGTGCGGC-3'.

1.5數據處理與分析

利用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析（Plt;0.05）、主成分分析、聚類分析和相關性分析并繪制聚類圖；用Origin 2021軟件繪制相關系數聚類熱圖；用GraphPad Prism 9軟件繪制柱形圖。

2結果與分析

2.1鹽堿脅迫下35份綠豆種質萌發期相關指標的差異分析

由表2可知，鹽堿脅迫處理下，35份綠豆種質的總鮮重、總干重、子葉鮮重、子葉干重、胚根鮮重、胚根干重、發芽勢、發芽率、根長、根冠比、胚根相對含水量、子葉相對含水量、發芽指數、活力指數共14項指標存在差異，其中胚根鮮重、活力指數、胚根干重和總鮮重的變異系數較大，分別為1.128、0.716、0.663和0.634，發芽率、胚根相對含水量和子葉相對含水量的較小，分別為0.137、0.169和0.090。

2.2 35份綠豆種質萌發期耐鹽堿性指標的主成分分析

如表3所示，對14個指標進行主成分分析共得到5個主成分，對應的特征根分別為4. 169、3.289、2.159、1.041和1.010，貢獻率分別為29.782%、23.492%、15.402%、7.438%和7.216%，累計貢獻率為83.330%。表明這5個主成分可以充分反映鹽堿脅迫下綠豆萌發期14個測量指標的變化趨勢。其中，第1主成分的貢獻率最高，是鹽堿脅迫高度敏感主成分，胚根鮮重的特征向量值最高，為0.899，總鮮重次之，為0.833，故選擇胚根鮮重和總鮮重作為綠豆萌發期耐鹽堿的主要評價指標。

2.3 35份綠豆種質萌發期耐鹽堿性的隸屬函數及聚類分析

根據5個主成分計算出35份綠豆種質的隸屬函數值和綜合評價值（D），見表4，并根據D值對不同綠豆資源萌發期的耐鹽堿性進行排序，D值越大表明該綠豆資源萌發期鹽堿耐性越好。可以看出，LSS-13的D值最大，為0.703：新育1號次之，為0.676;綠豐2號的D值最小，為0.054。

通過組間聯接法基于綜合指標對35份綠豆種質資源進行聚類分析，在平方歐氏距離為4處可將其劃分為5大類（圖1）。其中第1大類包含6個綠豆種質，分別為LSS-13、新育1號、黑綠豆（2020）、洮綠8號、赤綠6號和洮綠9號，綜合評價值高，為強耐鹽堿種質：第Ⅱ大類包含7個種質，綜合評價值較高，為耐鹽堿種質；第Ⅲ大類包含9個種質，綜合評價值中等，為中耐鹽堿種質；第Ⅳ大類包含7個綠豆種質，綜合評價值較低，為鹽堿敏感種質；第V大類包含6個種質，綜合評價值低，為鹽堿極敏感種質，分別為濰8×冀黑452020F8、綠珍珠遼寧鐵嶺、LD13-20、黑農院LD05-08、遼綠5號和綠豐2號。

2.4綠豆種質萌發期指標與D值的相關性分析及耐鹽性評價指標篩選

對鹽堿脅迫下14個綠豆萌發期指標進行相關性分析（圖2）可知，胚根鮮重、子葉鮮重和總鮮重與D值均呈顯著正相關，發芽率、胚根長、子葉干重、胚根干重、總干重和根冠比與D值呈正相關，但均未達顯著水平。綜合主成分分析和相關性分析結果表明，總鮮重、子葉鮮重、胚根鮮重、胚根干重和胚根長可作為綠豆萌發期耐鹽堿性評價的一級指標，發芽率、胚根長、子葉干重、胚根干重、總干重和根冠比可作為綠豆萌發期耐鹽堿性評價的二級指標。

2.5鹽堿脅迫對不同耐鹽堿性綠豆種質萌發期抗氧化相關酶活性的影響

綜合上述試驗結果，選擇強耐鹽堿種質LSS-13和鹽堿極敏感種質LD13-20作為材料，進一步分析其耐鹽堿的生理差異。由圖3可知，鹽堿脅迫處理下兩個綠豆種質子葉和胚根中抗氧化酶活性存在顯著差異。與對照相比，鹽堿脅迫顯著提高兩個綠豆種質子葉SOD、POD（LD13-20除外）、CAT、APX活性，其中LSS-13子葉APX活性增幅最大，達364.71%（Plt;0.05）；鹽堿脅迫處理下不同綠豆種質胚根中4種酶活性（LSS-13的SOD及LD13-20的POD除外）均顯著提高，其中LSS-13的POD活性增幅最大，達166.67%（Plt;0.05）。

2.6鹽堿脅迫下不同耐鹽堿性綠豆種質萌發期胚根基因組RAPD分析

為了明確鹽堿脅迫下綠豆基因組DNA損傷情況，利用RAPD對不同綠豆資源基因組的多態性進行分析，結果見圖4和表5。與對照相比較，鹽堿脅迫處理后兩個綠豆資源基因組的RAPD片段數均有明顯變化，LSS-13發生變化的條帶數為29條，LD13-20發生變化的條帶數為35條。與LD13-20相比較，強耐鹽堿資源LSS-13在鹽堿脅迫處理下表現出更強的基因組穩定性。

3討論

我國東北地區的鹽堿土壤類型為蘇打鹽堿土。一般認為，由Na+過量積累引起的鹽脅迫會對植物產生滲透脅迫和離子毒害，進而嚴重抑制植株生長和產量形成。然而，與單一Na+積累的鹽脅迫（如NaCl）相比較，鹽堿脅迫（如Na2C03和NaHCO，）還會對植物生長造成高pH脅迫，植物的耐鹽堿機制也與耐鹽機制存在差異。Wang等研究表明，相同Na+濃度下，堿性鹽（NaHC03、Na2C03）對大豆幼苗的危害程度大于中性鹽（NaCl、Na，S04）。

種子萌發期是作物生長的重要起始階段。與干旱、低溫等非生物脅迫不同，鹽堿脅迫下種子首先需要克服的就是萌發障礙。因此，在萌發期對綠豆種質資源進行鑒定和評價對選育耐鹽堿材料尤為重要。在對萌發期種質資源進行耐鹽（堿）篩選和鑒定評價時，前人多采用脅迫指數法、相對鹽害率、隸屬函數法等進行。脅迫指數法主要通過預先設定的標準，通過比較對照條件和脅迫條件下植株的生長差異進行絕對耐鹽堿性評價。隸屬函數法通過綜合評價群體的各個性狀指標，再設定劃分標準進行耐鹽堿能力差異評估。目前，大豆、玉米、小麥已經廣泛采用綜合評價方法對作物的耐逆性進行鑒定。本研究以14個萌發相關指標作為綠豆資源耐鹽堿性的鑒定指標，通過主成分分析、隸屬函數分析、聚類分析和相關性分析對其進行綜合評價。主成分分析能夠將數據維度降低，把多個指標轉為少數綜合指標來表征大部分目標性狀，每個主成分均是原始指標的線性組合。主成分分析結果表明，綠豆萌發期14個萌發相關指標可簡化為5個主成分，這5個主成分可代表萌發性狀83.330%的信息：通過隸屬函數和聚類分析將35份綠豆資源劃分為5類，I類為強耐鹽堿種質（6個），Ⅱ類為耐鹽堿種質（7個），Ⅲ類為中耐鹽堿種質（9個），Ⅳ類為鹽堿敏感種質（7個），V類為鹽堿極敏感種質（6個）。通過主成分分析和相關性分析綜合得出，總鮮重、子葉鮮重、胚根鮮重、胚根干重和胚根長可作為綠豆萌發期耐鹽堿性評價的主要指標。

在非生物脅迫下，激活SOD、POD、CAT和APX等抗氧化酶活性可有效降低ROS積累引起的氧化損傷。一般認為，植物體內抗氧化酶活性高低能夠直接反映其活性氧清除能力。本試驗結果表明，鹽堿脅迫顯著提高綠豆子葉和胚根中的抗氧化酶活性，這表明抗氧化系統參與了綠豆的鹽堿脅迫響應：比較兩個不同耐鹽堿性品種的酶活性表明，強耐鹽堿綠豆種質LSS-13較鹽堿極敏感種質LD13-20具有更強的ROS清除能力。這可能是兩類種質出現鹽堿耐性差異的主要原因，這與Zhao等在大豆中的研究結果一致。本研究對子葉和胚根中抗氧化系統的研究發現，子葉中APX活性差異幅度最大，而在胚根中POD活性差異幅度最大。APX和POD都具有清除過氧化氫的作用，但其反應過程存在差異。POD能夠將過氧化氫轉化為氧和水，同時氧化還原底物，而APX是將抗壞血酸還原為脫氫抗壞血酸，并將過氧化氫轉化為水，從而減少氧化損傷。這表明綠豆子葉和胚根在響應鹽堿脅迫時通過啟動不同的抗氧化調控系統來降低氧化損傷。

內源或外源因素造成的基因組DNA損傷及其修復失敗能夠直接影響遺傳信息的穩定傳遞，進而對植物的生長發育造成嚴重影響。在分子毒理學中，RAPD分析是一種比較常用的基于PCR技術的DNA指紋技術，用來檢測核酸損傷程度。利用此方法能夠準確、快速、高通量地檢測基因組DNA的變化情況，核酸片段數量變化越多，表示基因組損傷程度越嚴重。逆境脅迫產生的過量ROS能夠直接造成基因組DNA的損傷。本研究發現，鹽堿脅迫處理后綠豆基因組RAPD片段增加，表明鹽堿脅迫能夠造成綠豆DNA受損。這與我們課題組在大豆和蕓豆中的研究結果一致。與鹽堿極敏感種質LD13-20相比較，鹽堿脅迫處理后LSS-13基因組的RAPD片段變化程度更小，表明LSS-13的基因組DNA損傷程度較低，具有更強的活性氧清除能力，這可能是強耐鹽堿種質LSS-13基因組穩定性更強的重要原因。

4結論

本試驗結果表明，總鮮重、子葉鮮重、胚根鮮重、胚根干重和胚根長可作為綠豆萌發期耐鹽堿能力鑒定評價的主要指標。對35份綠豆種質進行萌發期耐鹽堿性鑒定及綜合評價，篩選出LSS-13、新育1號、黑綠豆（2020）、洮綠8號、赤綠6號和洮綠9號6個強耐鹽堿種質，濰8×冀黑45 2020F8．綠珍珠遼寧鐵嶺、LD13-20、黑農院LD05-08、遼綠5號和綠豐2號為鹽堿極敏感種質。鹽堿脅迫激活了綠豆萌發期子葉和胚根中的抗氧化酶系統，可有效提升綠豆種質的耐鹽堿水平。鹽堿脅迫能夠引起綠豆基因組DNA損傷，耐鹽堿綠豆種質（LSS-13等）可能通過維持較高的活性氧清除能力減少其DNA損傷。本研究結果可為綠豆耐鹽堿種質資源的利用及鹽堿地區綠豆育種和種質創新提供理論依據。