心肌肥大中mmu_circRNA_009396的功能研究

摘要：

利用血管緊張素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，AngⅡ）體外構建新生小鼠心肌細胞（Neonatal Mouse Ventricular Cardiomyocytes，NMVCs）的肥大模型，通過RT-qPCR檢測肥大標志基因，采用鬼筆環肽染色心肌細胞骨架，探討circRNA009396在心肌肥大中的調控作用。研究結果顯示，1 000 nmol/L AngⅡ 刺激心肌細胞24 h后，circRNA009396表達水平下調，且在注射AngⅡ的小鼠心臟組織中下調。敲低circRNA009396會加重AngⅡ誘導的心肌肥大，過表達circRNA009396會抑制AngⅡ誘導的心肌肥大。這表明，circRNA009396是心肌特異性的環形RNA，能保護心臟，可能作為關鍵調節因子和下游信號通路共同參與調控心肌肥大過程。

關鍵詞：

心肌肥大；環形RNA；血管緊張素

中圖分類號：R542.2

文獻標志碼：A

文章編號：10061037（2024）03002106

doi：10.3969/j.issn.10061037.2024.03.04

收稿日期：2023-12-04

基金項目：

國家自然科學基金（批準號：81600244，82070314）資助。

通信作者：

劉翠云，女，博士，副教授，主要研究方向為心血管疾病的分子機制研究。E-mail： cyliu2008@sina.com

心肌肥大是一種針對血流動力學應激的適應性反應。運動刺激的生理性肥大可保護心臟，而病理性心肌肥大伴隨有心肌基因表達改變、纖維化和適應不良的心肌重塑，通常會發展為心力衰竭［1］。慢性心力衰竭的主要原因與心肌代償性肥大有關，調節心肌肥大過程是由多種信號通路構成［2］。部分非編碼RNA（Non-coding RNA，ncRNA）已被確定為心肌肥大的關鍵調節因子，通過基因轉錄或轉錄后沉默調控心肌肥大相關的分子網絡。環形RNA（circRNA）是由前體mRNA外顯子反向剪切形成的共價閉合環狀RNA分子，具有組織特異性表達和進化的保守性［3］。剪接circRNA的長度從小于100 nt至大于4 000 nt不等，其中人類細胞中平均長度為500 nt［4-5］。circRNA具有miRNA海綿作用，也可作為剪接或轉錄調節因子以及RNA結合蛋白的輔助因子［6-8］。研究發現，circRNA可延緩衰老、調節胰島素分泌、影響腫瘤細胞或平滑肌細胞的增殖及轉移［9］。更有證據表明，circRNA參與心血管發病機制。一種circRNA（circSlc8a1）干擾敲低后可減輕心臟壓力超負荷引起的心肌肥大［10］。circRNA_000203［11］過表達能增強心肌肥大反應，其作用機制是通過海綿狀miR-26b-5p，miR-140-3p加重心肌肥大和心功能損傷。然而，病理性心肌肥大中仍有大量circRNA的功能未闡明。本研究利用血管緊張素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，AngⅡ）構建新生小鼠心肌細胞（Neonatal Mouse Ventricular Cardiomyocytes，NMVCs）肥大模型，討論心肌肥大中mmu_circRNA_009396的功能，為預防病理性肥大提供新研究思路。

1" 材料與方法

1.1" 實驗材料

1～3 d新生乳鼠購買自山東省青島市大任富城有限公司；DMEM/F12培養基、青鏈霉素混合液；Ⅱ型膠原酶、胰液素、Brdu、胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）購自依科賽生物科技有限公司； AngⅡ（AbMole BioScience）；Trizol試劑（賽默飛）；Evo M-MLV反轉錄預混型試劑盒（艾科瑞）；MonAmpTM SYBR Green qPCR Mix（Monad）；Lipo 8000TM轉染試劑（碧云天）；DAPI熒光染料、鬼筆環肽（Yeasen Bio）。

1.2" 實驗方法

1.2.1" NMVCs的分離、培養" 取出生1～3 d的小鼠心臟組織切碎，加入5 mL消化液（1.2 mg/mL胰液素和0.14 mg/mL膠原酶Ⅱ），重復處理10～15次直至組織塊消失呈現絮狀，轉移上清液至含有FBS的錐形瓶以終止消化。所得細胞懸液于室溫下800 rpm離心5 min，棄上清，加入無血清的DMEM/F12培養基使沉淀，重懸后過濾倒入10 cm培養皿中，差速貼壁1.5 h，取上清液至新培養皿放置24 h后換液待用。

1.2.2" NMVCs肥大模型構建" 設置0 nmol/L、200 nmol/L、500 nmol/L、1 000 nmol/L AngⅡ濃度梯度均處理24 h，篩選小鼠心肌肥大模型的最適AngⅡ濃度。

1.2.3" 質粒DNA轉染NMVCs" 以六孔板為例，空白對照組不做處理，實驗組細胞加入2.5 μg質粒DNA和4 μL Lipo 8000的混合孵育液。6 h后換液，繼續培養24～48 h后，用于后續實驗。

1.2.4" 小干擾RNA轉染NMVCs" Lipo 8000與小干擾RNA（siRNA）混合孵育15" min后轉染NMVCs，6 h后換液，細胞轉染24～48 h，進行后續實驗操作。

1.2.5" 鬼筆環肽染色" NMVCs爬片處理48 h，PBS清洗細胞后用4%多聚甲醛固定10 min，每孔加200 μL鬼筆環肽（5 μg/mL）室溫染色30～60 min，DAPI染細胞核5～10 min，每次染色結束后均吸棄染料，用PBS浸洗3次，每次3 min。滴加抗熒光淬滅封片液，蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6" 統計學分析" 數據以平均數±標準差（Mean±SD）表示，取三次獨立實驗結果，使用軟件GraphPad Prism8.3.0做統計學分析。選擇t檢驗比較兩組獨立樣本，多組間比較采用單因素方差分析，Plt;0.05認為有統計學意義。

2" 結果

2.1" Ang Ⅱ體外誘導心肌肥大模型的構建

為確定體外誘導心肌肥大條件，分離培養NMVCs，設置0 nmol/L、200 nmol/L、500 nmol/L、1 000 nmol/L AngⅡ濃度梯度，提取NMVCs總RNA。利用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測心肌肥大標志基因心鈉素（BNP）、β肌球蛋白重鏈（β-MHC）的mRNA表達水平。1 000 nmol/L AngⅡ處理NMVCs 24 h時，BNP和β-MHC的mRNA表達水平明顯上調，最終選定構建心肌肥大模型條件為1 000 nmol/L AngⅡ處理24 h（圖1中ns、**、***、****分別表示無統計學意義、Plt;0.01、Plt;0.001、Plt;0.000 1）。

2.2" circRNA的篩選

通過RT-qPCR檢測心肌肥大中5個差異表達的circRNA，發現1 000 nmol/L AngⅡ誘導24 h的NMVCs中mmu_circRNA_009396下調明顯（圖2中**、***分別表示Plt;0.01、Plt;0.001）。因此，選擇此環形RNA作為研究對象完成后續實驗，為書寫簡便，測序編號為mmu_circRNA_009396的circRNA命名為circRNA009396。

2.3" 過表達circRNA009396對AngⅡ誘導的心肌肥大的影響

構建circRNA009396過表達質粒（oe-circRNA），轉染NMVCs。由圖3（*、***分別表示Plt;0.05、Plt;0.001）可知，通過RT-qPCR檢測NMVCs中質粒的過表達效率，circRNA009396的表達水平明顯上升；同時，轉染過表達circRNA009396質粒后，使用AngⅡ誘導的NMVCs中BNP、β-MHC mRNA表達水平較加藥組下降；經鬼筆環肽染色后，轉染過表達質粒的NMVCs骨架面積較肥大損傷組顯著減小。綜上，細胞水平上，過表達circRNA009396減緩了AngⅡ誘導的心肌肥大，減小了NMVCs骨架面積。

2.4" 敲低circRNA009396對AngⅡ誘導的NMVCs肥大的影響

用敲低circRNA009396的siRNA轉染NMVCs。檢測到轉染后NMVCs中circRNA009396表達水平降低；同時，轉染siRNA后，Ang Ⅱ誘導的心肌細胞中BNP和β-MHC表達水平上調；經鬼筆環肽熒光染色發現，AngⅡ刺激下NMVCs表面積增加，轉染siRNA導致NMVCs肥大面積增加（圖4中*、***分別表示Plt;0.05、Plt;0.001）。綜上，敲低circRNA009396會加重AngⅡ誘導的心肌肥大，轉染siRNA后肥大細胞的面積增加。

（a）siRNA轉染后的敲低效率；（b）BNP的表達水平；（c）β-MHC的表達水平；

（d）鬼筆環肽染色心肌細胞表面積；（e）具有代表性的心肌細胞共聚焦圖像（bar=20 μm）

3" 討論

心肌細胞不可再生，屬于終末分化細胞。因此，心肌細胞數量不會增加但尺寸會變大［12］，心臟通過發生代償性肥大以適應生理和病理的刺激性，但持續病理性肥大往往發展為心力衰竭和猝死［13］。AngⅡ通過激活肥厚不同的信號通路引起心肌肥大反應［14］。心肌肥大常伴隨BNP、 β-MHC表達量增加。本文利用1 000 nmol/L AngⅡ構建體外心肌肥大模型，24 h后BNP和β-MHC mRNA表達量上調明顯。

circRNA是廣泛存在于真核細胞中一類豐富且穩定的RNA分子［15］，是心血管疾病生理和病理過程的重要參與者［16］。本文通過AngⅡ刺激NMVCs肥大篩選出差異表達的circRNA。實驗數據表明，構建心肌肥大模型后，過表達circRNA009396降低了肥大標志物的表達量，減少了NMVCs表面積；敲低circRNA009396會加重心肌肥大，細胞水平層面驗證了circRNA009396調控心肌肥大。

circRNA可充當miRNA海綿來調節靶基因的表達，一種circRNA HRCR［17］作為內源性miR-223海綿能抑制miR-223活性，通過靶向調控ARC基因的表達以減弱心臟肥大和心力衰竭。心肌細胞中高度富集的circSlc8a1作為內源性miR-133a海綿靶向血清反應因子（SRF）、結締組織生長因子（CTGF）、腎上腺素能受體β1（Adrb1）和腺苷酸環化酶6（ADCY6）來調節心肌肥大［10］，可能作為治療心臟肥大的潛在靶點。通過AngⅡ誘導肥大后上調的circ_00010066［18］與miR-214-3p結合，阻斷miR-214-3p與PAK6基因的3′UTR相互作用。此外，circRNA上有部分與RNA結合蛋白相互作用的位點至關重要，這類RNA結合蛋白可調節circRNA合成和降解［19］。本研究結果初步研究了circRNA009396對體外心肌肥大的影響，后續將通過RNA下拉實驗尋找與circRNA009396特異性結合的蛋白，驗證環形RNA-蛋白之間的調控方式，深入探索AngⅡ誘導的心肌肥大過程中環形RNA的信號通路。

4"" 結論

本文利用AngⅡ刺激NMVCs肥大，發現肥大細胞中circRNA009396呈下調趨勢。通過體外實驗，驗證了circRNA009396可減緩AngⅡ誘導的心肌肥大。該環形RNA可能與某個RNA結合蛋白組成調控系統共同影響心肌肥大的發生過程，今后將研究circRNA009396與下游蛋白的調控機制，為預防病理性心肌肥大提供新靶點。

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Functional Study of mmu_circRNA_009396 in Cardiac Hypertrophy

XIA Qian-qian， CAO Rui-qi， LIU Cui-yun

（Institute for Translation Medicine， Qingdao University， Qingdao 266021， China）

Abstract：

To investigate the regulatory role of circRNA009396 in cardiac hypertrophy， angiotensin Ⅱ（AngⅡ） was used to construct the hypertrophy model of neonatal mouse ventricular cardiomyocytes（NMVCs） in vitro. Hypertrophy marker genes were detected by RT-qPCR， and myocardial cytoskeleton was staining with phalloidin. The results show that the expression levels of circRNA009396 are down-regulated after 1 000 nmol/L AngⅡ stimulation for 24 h， and down-regulated in the heart tissue of mice injected with AngⅡ. Knockdown of circRNA009396 increases AngⅡ-induced cardiac hypertrophy， and overexpression of circRNA009396 inhibits AngⅡ-induced cardiac hypertrophy. This suggests that circRNA009396 is a cardio-specific circular RNA with cardioprotective effects， and may act as a key regulator to co-regulate the process of myocardial hypertrophy with downstream signaling pathways.

Keywords：

cardiac hypertrophy; circular RNA; angiotensin