DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)與早發(fā)結(jié)直腸癌的相關(guān)性研究

摘要：

為探討DNA錯配修復(fù)（MMR）系統(tǒng)與早發(fā)性結(jié)直腸癌（EO-CRC）病理特征及其預(yù)后關(guān)系，收集189例EO-CRC腫瘤組織。通過免疫組化方法分為完整型組（pMMR）和缺陷型組（dMMR）；基于Kaplan-Meier方法分析兩組預(yù)后現(xiàn)狀。研究結(jié)果顯示，37例樣本為dMMR，152例樣本為pMMR。dMMR組中，MLH1和PMS2同時缺失最多（32.43%）；dMMR組腫瘤位置大多發(fā)生于右半結(jié)腸（48.65%），pMMR組大多發(fā)生于直腸（58.55%）；兩組腫瘤尺寸大小和TNM分期均具有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）；兩組整體生存率具有統(tǒng)計學(xué)意義（Log-rank" χ2=4.19， Plt;0.05）。這表明，EO-CRC患者中dMMR組具有特殊的病理特征且預(yù)后更好，為EO-CRC患者的早期診斷和精準(zhǔn)治療提供參考。

關(guān)鍵詞：

錯配修復(fù)蛋白；早發(fā)性結(jié)直腸癌；微衛(wèi)星不穩(wěn)定；免疫組織化學(xué)

中圖分類號：R735.3+7

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：10061037（2024）03002705

doi：10.3969/j.issn.10061037.2024.03.05

收稿日期：2024-03-26

基金項目：

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目（批準(zhǔn)號：202103030190）資助。

通信作者：

劉福國，男，博士，主任醫(yī)師，主要研究方向為消化道早癌內(nèi)鏡診治等。E-mail： liufg@qdu.edu.cn

結(jié)直腸癌（Colorectal Cancer， CRC）是常見消化道惡性腫瘤之一。數(shù)據(jù)顯示，CRC新發(fā)病例為全球癌癥第三位，死亡病例為全球第二位［1-2］。現(xiàn)代診療技術(shù)的進步和一級的預(yù)防實施降低了全球CRC整體新發(fā)率［3］。近期統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，50歲之前的早發(fā)性結(jié)直腸癌（Early-onset Colorectal Cancer， EO-CRC）發(fā)病率和病死率呈現(xiàn)上升趨勢［4］。DNA錯配修復(fù)（Mismatch Repair， MMR）通常包括MLH1、MSH2、MSH6和PMS2［5］，其基因突變是造成微衛(wèi)星不穩(wěn)定（Microsatellite Instability， MSI）發(fā)生原因之一。MSI作為CRC發(fā)病原因之一，病例占比約為10%～20%［6-7］。目前，MSI與EO-CRC間關(guān)系尚未見相關(guān)報道。因此，本文收集了189例50歲以下CRC患者資料及病理標(biāo)本，采用免疫組化檢測MMR表達，通過患者相似病理特征和分子遺傳學(xué)表征，針對EO-CRC患者制定、優(yōu)化治療方案，為EO-CRC患者個性化治療和預(yù)后提供新參考。

1" 研究設(shè)計

1.1" 患者招募

選取2014年6月—2023年3月期間就診于臨沂市腫瘤醫(yī)院且實施結(jié)直腸癌根治手術(shù)的患者189例。其中，男性90例，女性99例；年齡11～49歲，平均年齡（42.41

SymbolqB@ 6.45）歲；患者診斷為結(jié)腸或直腸癌，能提供福爾馬林固定石蠟包埋標(biāo)本即可。本研究通過了臨沂市腫瘤醫(yī)院倫理委員會審批（批號：KY2347）。

1.2" IHC標(biāo)本收集和準(zhǔn)備

標(biāo)本取自手術(shù)切除的原發(fā)性腫瘤。臨沂市腫瘤醫(yī)院病理學(xué)實驗室完成標(biāo)本制備標(biāo)準(zhǔn)程序。針對蘇木精-伊紅染色切片完成組織學(xué)確診：石蠟塊中取3

SymbolmA@ m厚的組織切片，置于Dako硅化玻片完成免疫組化（Immunohistochemistry，IHC），該組織置于60℃的烤箱中，加熱1 h。

1.3" MMR蛋白的IHC染色

染色MLH1、MSH2、MSH6和PMS2這4種MMR蛋白；IHC過程使用Dako自動染色劑Link 48。染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察切片。腫瘤細胞中棕色核染色時為陽性結(jié)果。

1.4" 結(jié)果判定

光學(xué)顯微鏡下檢測、判定染色結(jié)果：陽性為鏡檢發(fā)現(xiàn)細胞核著色，陰性為無細胞核著色。其中，4種抗體染色結(jié)果均為陽性時，即判定為完整型錯配修復(fù)蛋白（pMMR），表示為微衛(wèi)星穩(wěn)定（Microsatellite Stability，MSS）；1種或1種以上染色結(jié)果為陰性時，即判定為缺陷型錯配修復(fù)蛋白（dMMR），即判斷為MSI［8］。

1.5" 統(tǒng)計學(xué)分析

采用 SPSS 21.0數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用均數(shù)

SymbolqB@ 標(biāo)準(zhǔn)差描述，組間比較使用卡方檢驗，使用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線。P＜0.05表示為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2" 結(jié)果

2.1" EO-CRC人群資料統(tǒng)計

189例合格樣本中，女性（52.38%）略多于男性（47.62%）；平均年齡為（42.41

SymbolqB@ 6.45）歲；右半結(jié)腸腫瘤患者占比22.22%，左半結(jié)腸腫瘤患者占比24.34%，直腸癌患者占比53.44%，腫瘤部位具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.01）。腫瘤尺寸中，3cm～6 cm占比最大（65.08%）。腫瘤形態(tài)結(jié)果顯示，潰瘍性最多（149份），且有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.01）。組織類型中，非黏液細胞腺癌占比88.36%。腫瘤分化程度中，最多為中分化腫瘤（78.84%）。所有樣本中，脈管侵犯和神經(jīng)侵犯均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.01），淋巴結(jié)侵犯則無統(tǒng)計學(xué)差異（Pgt;0.05）。

2.2" MMR蛋白表達情況

光學(xué)顯微鏡下觀察MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白表達，4種抗體著色于細胞核判定為陽性表達，無核著色為陰性表達（圖1）。189例標(biāo)本中，dMMR標(biāo)本37例，pMMR標(biāo)本152例。dMMR標(biāo)本中，MLH1與PMS2同時缺失12例（32.43%），MSH6與MSH2同時缺失8例（21.62%），PMS2單缺失5例（13.52%），MSH2陰性10例（27.03%），MSH6單缺失2例（5.40%），沒有發(fā)生MLH1單缺失。

2.3" EO-CRC患者中pMMR和dMMR腫瘤特征

由表1可知，dMMR組平均年齡（41.43

SymbolqB@ 5.74）歲，pMMR組平均年齡（42.65

SymbolqB@ 6.60）歲，兩組年齡無統(tǒng)計學(xué)差異（Pgt;0.05），多發(fā)于40～49歲間，建議年齡40歲以上者可做結(jié)直腸早癌篩查。pMMR組患者中，女性是男性的1.17倍；dMMR組患者中，男性是女性的1.18倍。兩組腫瘤部位統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，均具有顯著性差異（Plt;0.01），dMMR組多發(fā)生于右半結(jié)腸（48.65%），pMMR組多發(fā)生于直腸（58.55%）。腫瘤尺寸結(jié)果顯示，兩組具有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），兩組集中于（3～6） cm。兩組TNM分期相比，具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.01），pMMR組Ⅲ+Ⅳ期患者較多（56.58%），dMMR組I+Ⅱ期患者較多（67.57%），說明dMMR組預(yù)后較好。兩組患者中均未發(fā)現(xiàn)高分化腫瘤且分化程度亦沒有差異（Pgt;0.05），中分化腫瘤更為常見（分別為78.95%和78.38%）。兩組患者的組織類型無差異（Pgt;0.05），dMMR組中黏液細胞腺癌占比（16.22%）要高于pMMR組（10.53%）。所有樣本中，脈管侵犯和神經(jīng)侵犯均無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.01）。

2.4" MMR蛋白表達與患者預(yù)后生存間關(guān)系

所有EO-CRC患者均完成隨訪，隨訪時間為（0.5～3） a。圖2中，dMMR組患者整體生存率為78.4%（29/37），高于pMMR組患者整體生存率60.5%（92/152），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Log-rank" χ2=4.19，P=0.041）。

3" 討論

EO-CRC占CRC發(fā)病率約10%［9-10］，由于常規(guī)篩查和精準(zhǔn)治療的改善，全球CRC發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)下降趨勢，但EO-CRC發(fā)病率卻逐年上升，給社會和家庭造成重大負(fù)擔(dān)［11-12］。研究發(fā)現(xiàn)，73例結(jié)直腸癌患者（≤40歲）中，32人患有結(jié)腸癌，41人患有直腸癌，且大多數(shù)患者處于低分化程度，病理分期大多為Ⅱ/Ⅲ期患者［13］；270名（≤40歲）CRC患者中，平均年齡為35.4歲，其中女性略多于男性，直腸是最常見的原發(fā)部位，79%的腫瘤出現(xiàn)在左側(cè)，211例患者為腺癌，185例腫瘤分化良好，85%的患者表現(xiàn)為晚期［14］。本研究中，所有患者平均年齡為（42.41

SymbolqB@ 6.45）歲，女性略多男性，左側(cè)腫瘤多于右側(cè)腫瘤，直腸是患病率最高的原發(fā)部位（53.44%），腫瘤尺寸多為3～6 cm（65.08%），患者晚期階段稍多，但無統(tǒng)計學(xué)意義，沒有發(fā)現(xiàn)高分化腫瘤，中分化腫瘤占比為78.84%。本研究與以往結(jié)果一致，上述特征均與不良預(yù)后相關(guān)。

MSI是由MMR 基因發(fā)生功能障礙引起的DNA 復(fù)制錯誤和累積。大樣本分析中發(fā)現(xiàn)［15-16］，使用IHC 檢測 MMR 蛋白（MLH1、PMS2、MSH2、MSH6）表達情況可反映 DNA MMR 功能狀態(tài)。已有研究發(fā)現(xiàn)，124例EO-CRC患者中，MLH1和PMS2表達缺失是最常見dMMR類型［17］。本研究所有dMMR患者中，MLH1和PMS2表達缺失最多（32.43%），其次是MSH2 表達缺失（27.03%），再則是MSH6 與 MSH2 表達缺失（21.62%）。DNA 復(fù)制過程中MLH1 與PMS2 蛋白形成二聚體，參與MMR過程，MSH2與MSH6結(jié)合也形成二聚體，參與識別、修復(fù)及維持穩(wěn)定的過程［15］。本研究中，MLH1和PMS2表達缺失極大可能是由MLH1基因甲基化引起。

MSI針對結(jié)直腸癌中發(fā)生和患者預(yù)后［18］具有指導(dǎo)意義。dMMR組中Ⅲ期患者較多（43.75%），腫瘤常見于升結(jié)腸（40%）［17］。菲律賓EO-CRC人群中，dMMR組中左側(cè)腫瘤（9例）多于右側(cè)腫瘤（6例）。pMMR組中只有3例低分化腫瘤，而dMMR腫瘤中只有1例。雖然pMMR組和dMMR組患者均表現(xiàn)為侵襲性組織學(xué)變異，但dMMR組多由具有粘液性特征的腫瘤引起（50.0%）［14］。本研究結(jié)果顯示，dMMR組Ⅰ/Ⅱ期患者最多，大多為中低分化腫瘤，但與pMMR組相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異，右側(cè)腫瘤比左側(cè)腫瘤多，相較于pMMR組，很少發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。上述數(shù)據(jù)表明dMMR組的惡性程度要低。因此，本研究數(shù)據(jù)可為dMMR的早檢和預(yù)后提供參考，但僅限于臨沂市人群中年輕發(fā)病的結(jié)直腸癌患者。

MMR蛋白表達缺失與結(jié)直腸癌的預(yù)后關(guān)系密切。研究顯示，整體結(jié)直腸癌患者中，dMMR患者預(yù)后更好［19］。本研究EO-CRC患者的生存分析中，dMMR組患者相較于pMMR組，整體生存率要高，兩者具有統(tǒng)計學(xué)差異（Log-rank" χ2=4.19， Plt;0.05），提示dMMR與結(jié)直腸癌患者預(yù)后關(guān)系密切。因此，可根據(jù)dMMR表達情況預(yù)測EO-CRC患者預(yù)后。

4" 結(jié)論

本研究通過收集189例EO-CRC患者樣本，采用免疫組化和KM分析了DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)與早發(fā)結(jié)直腸癌病理特征及預(yù)后間關(guān)系。研究結(jié)果表明，與pMMR患者相比，dMMR患者的病理特征不同，且預(yù)后較好，說明MSI檢查針對40～49歲人群具有識別意義。今后將聚焦EO-CRC獨特病理特征，探究EO-CRC具體分子圖譜及其發(fā)展的分子機制。

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Study" on the Correlation Between the DNA Mismatch Repair System and Early-onset Colorectal Cancer

WANG Yu-e1，2， SUN Yun-jun2， YANG Gui-li3， ZHANG Xiao-hong2， ZHANG Min2， GAO Min-min2， LIU Fu-guo1

（1. Department of Gastroenterology， Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266071， China;

2. Department of Endoscopy Room， Linyi" Cancer Hospital， Linyi 276000， China;

3. Department of Internal Medicine，Mudan District Traditional Chinese Medicine Hospital in Heze City， Heze 274000， China）

Abstract：

To investigate the relationship between DNA mismatch repair （MMR） system and the pathological features and prognosis of early-onset colorectal cancer （EO-CRC）， 189 EO-CRC tumor tissues were collected and divided into proficient group （pMMR） and defective group （dMMR） by immunohistochemistry. The prognosis status of the two groups was analyzed by Kaplan-Meier method. The results show that 37 samples are dMMR and 152 samples are pMMR. MLH1 and PMS2 are most missing （32.43%） in the dMMR group. The tumor location in the dMMR group is mostly in the right half of the colon （48.65%）， while the tumor location in the pMMR group is mostly in the rectum （58.55%）. The data of tumor size and TNM stage are statistically different （Plt;0.05）， and the overall survival is statistically different （Log-rank" χ2=4.19， Plt;0.05） between the two groups. This indicates that the dMMR group among EO-CRC patients has special pathological characteristics and a better prognosis， providing references for the early diagnosis and precise treatment of EO-CRC patients.

Keywords： mismatch repair protein; early-onset colorectal cancer; microsatellite instability; immunohistochemistry