Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7與宮頸癌復(fù)發(fā)相關(guān)性臨床研究

張繼屏，范鍶絲，江潔麗，鄭建瑩，閔燕飛

（1.廣東醫(yī)科大學研究生院第一臨床學院；2.佛山市婦幼保健院婦科；3.佛山市第一人民醫(yī)院泌尿生殖腫瘤科，廣東 佛山 528000）

相關(guān)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示我國每年宮頸癌新發(fā)病率超過9.8萬例，已發(fā)展成為一種嚴重的社會公共衛(wèi)生問題[1]。通過積極有效的外科手術(shù)、輔助放化療等措施可達到根治宮頸癌、遏制病情進展、改善預(yù)后的目的，但宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)仍是不可避免的問題，同時也是影響宮頸癌患者遠期生存率與生活質(zhì)量的重要因素，因此宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的準確預(yù)測一直是近年來臨床研究熱點與難點[2-3]。免疫組化是一種應(yīng)用免疫學抗原抗體反應(yīng)原理顯色特定組織細胞內(nèi)抗原的技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)定位、定性、相對定量的研究；免疫組化技術(shù)在胃腸道多種腫瘤疾病的診斷、治療、預(yù)后等多方面具有廣泛應(yīng)用[4]。Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7為宮頸癌患者相對較為常用的免疫組化檢測指標，但Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7與宮頸癌患者預(yù)后關(guān)系的報道則相對較少。本組研究是回顧分析Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7免疫組化因素與宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)性的臨床研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月至2022年1月在佛山市婦幼保健院和佛山市第一人民醫(yī)院收治的符合條件的120例宮頸癌患者臨床資料進行回顧性分析，根據(jù)患者復(fù)發(fā)預(yù)后情況及收治時間將其分為復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組各60例。復(fù)發(fā)組年齡：27～73歲，平均年齡（56.91±12.48）歲；腫瘤直徑：0.5～8.5 cm，平均直徑（5.12±2.43）cm；病理類型：鱗癌35例，腺癌11例，小細胞癌等其他類型癌14例；病理分期[5]：Ⅰa1期2例，Ⅰa2期2例，Ⅰb1期8例，Ⅰb2期15例，Ⅰb3期12例，Ⅱa2期1例，Ⅱb期1例，Ⅲc1p期17例，Ⅲc2p期2例；明確宮旁浸潤8例，明確淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例。未復(fù)發(fā)組年齡25～76歲，平均年齡（55.14±13.19）歲；腫瘤直徑0.2～8.5 cm，平均腫瘤直徑（5.28±1.97）cm；病理類型：鱗癌52例，腺癌6例，小細胞等其他類型癌2例；病理分期：Ⅰa1期2例，Ⅰa2期4例，Ⅰb1期21例，Ⅰb2期8例，Ⅰb3期11例，Ⅱa1期11例，Ⅲc1p期3例；明確宮旁浸潤0例，明確淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移4例。本研究已通過佛山市婦幼保健院和佛山市第一人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。納入標準：①宮頸癌初診患者，經(jīng)組織病理學確診，并接受規(guī)范手術(shù)治療[6]；②術(shù)前、術(shù)后臨床資料完整；③均進行Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7免疫組化病理檢測。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②嚴重心、肝、腎功能不全；③妊娠期患者；④精神疾病；⑤新輔助化療患者。

1.2 研究方法 回顧性采集宮頸癌患者Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7免疫組化表達情況，收集臨床相關(guān)資料進行分析，根據(jù)患者宮頸癌復(fù)發(fā)情況將其分為復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組，通過單因素、多因素Logistic回歸分析宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的風險因素。以組織病理學結(jié)果作為診斷金標準，分析Ki67聯(lián)合突變型P53、突變型P16、CK7表達情況對宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)警價值，并據(jù)此建立宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)風險模型。

1.3 檢測方法 檢查患者術(shù)后病理切片組織中Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7表達情況，采用免疫組化PV-9000法進行檢測，所有抗體均由北京中杉金橋生物技術(shù)提供。常規(guī)石蠟包埋并制成4 μm切片，脫蠟水化組織切片并應(yīng)用高壓鍋抗原熱修復(fù)，應(yīng)用3%H2O2去離子水孵育阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加一抗后4 ℃過夜。PBS沖洗后滴加聚合物酶輔助劑，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗后滴加酶標山羊抗小鼠IgG多聚體，37 ℃孵育30 min后應(yīng)用DAB溶液顯色。最后用自來水沖洗、復(fù)燃、脫水、透明、封片。每例患者選擇2張切片進行觀察，以腫瘤細胞平均值作為細胞陽性率，其中突變型P16陽性反應(yīng)為P16蛋白缺失率≥50%，細胞核呈少部分著色棕黃色，陽性定位處于細胞質(zhì)與細胞核，陽性細胞百分率為陽性細胞數(shù)/計數(shù)細胞總數(shù)，占比≥10%表示陰性（-）；突變型P53陽性表現(xiàn)為異常細胞核過度表達，反應(yīng)為腫瘤細胞中-強彌漫性核染色≥80%，細胞核呈強棕黃色，腫瘤細胞任何強度的非彌漫性核染色＜80%或者異常完全缺失表示陰性（-）；Ki67陽性反應(yīng)是胞核棕黃色，僅在基底層細胞中有表達為陰性（-）；CK7陽性定義為≥1%細胞細胞質(zhì)彌漫性染色。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用 SPSS 19統(tǒng)計學軟件。計量資料以()表示，組內(nèi)采用配對t檢驗，組間采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以[例(%)]表示，采用χ2檢驗；使用多因素Logistic回歸分析篩選出影響宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的危險因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的單因素分析 回顧性收治的120例宮頸癌患者按復(fù)發(fā)預(yù)后情況分為宮頸癌復(fù)發(fā)組(n=60)與未復(fù)發(fā)組(n=60)。單因素分析結(jié)果顯示：復(fù)發(fā)組腫瘤直徑≥4 cm、中或低分化、病理分期（Ⅱa～Ⅲ期）、淋巴轉(zhuǎn)移、脈管陽性、殘端陽性及Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7表達陽性的患者占比均高于未復(fù)發(fā)組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05)，見表1。

表1 宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的單因素分析[例(%)]

2.2 宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的多因素Logistic回歸分析 以宮頸癌術(shù)后是否復(fù)發(fā)作為因變量，將單因素分析中差異有統(tǒng)計學意義的數(shù)據(jù)作為自變量，并對其進行賦值；將腫瘤直徑＜4 cm賦值為0，腫瘤直徑≥4 cm賦值為1；分化程度：未分化賦值2，中低分化賦值為1，高分化賦值為0；病理分期：Ⅰa1～Ib3賦值為0，Ⅱa1～Ⅲ賦值為1；無淋巴轉(zhuǎn)移賦值為0，淋巴轉(zhuǎn)移為1；Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7表達陰性均為0，表達陽性均為1。納入Logistic回歸模型，結(jié)果顯示：腫瘤直徑≥4 cm、中或低分化、病理分期（Ⅱa～Ⅲ期）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、殘端陽性、脈管陽性及Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7表達陽性是宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的危險因素，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05)，見表2。

表2 宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的多因素Logistic回歸分析

2.3 Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7對宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)警價值 以組織病理學診斷結(jié)果作為金標準，對比宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)、未復(fù)發(fā)組Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7檢測結(jié)果，結(jié)果顯示：Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7陽性檢出對宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值均較高，見表3、表4。

表3 Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7檢測結(jié)果（例）

表4 Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7檢測結(jié)果對宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價值（%）

2.4 模型建立 根據(jù)多因素Logistic回歸分析結(jié)果明確聯(lián)合預(yù)測因子，模型建立為LogitP =-9.543+腫瘤直徑×2.623+分化程度×2.764+病理分期×2.052+淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移×2.046+殘端陽性×2.439+脈管陽性×2.413+Ki67表達×2.177+突變型P53表達×2.039+突變型P16表達×1.883+CK7表達性×2.098，上述公式直接代入數(shù)據(jù)，若LogitP＞0.496，即預(yù)警宮頸癌復(fù)發(fā)風險高。

3 討論

Ki67是一種半衰期相對較短的核抗原，細胞活性檢查中Ki67的水平可直接反映組織細胞的增殖活性，其與細胞增殖的數(shù)目具有直接關(guān)系，并且Ki67作為反映增殖活性時的穩(wěn)定性極高，在臨床檢驗中通常用于評估細胞合成代謝狀態(tài)與代謝功能等，是一項可靠而準確、方便的檢測指標，通常在惡性腫瘤組織內(nèi)呈高表達狀態(tài)[7-8]，既往臨床研究已證實Ki67的表達水平與多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、預(yù)后等具有密切聯(lián)系，并在宮頸癌的診治與預(yù)后預(yù)測方面亦具有重要地位[9-10]。P53為一種抑癌基因，通常在上皮組織基底層中變動，可在鱗狀上皮細胞中檢測出P53基因表達陽性，而一旦P53基因發(fā)生基因突變而失去其原有的抑癌效果時，則可導(dǎo)致細胞組織失去相應(yīng)的周期性調(diào)節(jié)功能，導(dǎo)致細胞異常增殖與異常突變、分化等現(xiàn)象的發(fā)生，對腫瘤細胞的抑制作用喪失，P53基因突變在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[11]，既往臨床可通過對突變型P53基因表達的檢測實現(xiàn)宮頸癌的早期篩查與診斷，并能夠作為宮頸癌進展與預(yù)后評價的客觀依據(jù)。P16與P53均為抑癌基因，但不同的是P16能夠直接參與進細胞周期調(diào)控活動中，一般在炎癥組織中可有微量表達，并且伴隨著炎癥的加重而逐漸表達上升，使細胞周期滯留于第一階段[12]，而當P16基因發(fā)生失活、缺失、突變等異常行為時，會極大程度上增加惡性腫瘤細胞的發(fā)生與增殖，在宮頸癌患者中可檢出突變型P16基因甲基化與患者病情進展具有密切聯(lián)系[13]。CK7是一種堿性Ⅱ型細胞角蛋白，在多數(shù)腺上皮、異性上皮中表達，可發(fā)揮維持上皮細胞完整的作用，一般情況下CK7主要在上皮腫瘤中表達，在宮頸鱗癌中表達呈陽性，但在其他部位鱗狀細胞癌CK7多呈陰性表達狀態(tài)[14-15]，這便導(dǎo)致其與宮頸癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后具有更為密切且對應(yīng)的聯(lián)系。

本組研究結(jié)果顯示而復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組年齡是否小于50歲、有無吸煙、成年前是否性生活、有無宮頸癌家族史、病理類型、術(shù)后放化療比例比較無顯著差異。將宮頸癌術(shù)后是否復(fù)發(fā)作為因變量，將影響術(shù)后復(fù)發(fā)的差異有統(tǒng)計學意義的指標作為自變量，納入多因素Logistic回顧分析模型，結(jié)果顯示：復(fù)發(fā)組腫瘤直徑≥4 cm、中或低分化、病理分期（Ⅱa～Ⅲ期）、淋巴轉(zhuǎn)移、殘端陽性、脈管陽性及Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7表達陽性是宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的主要風險因素結(jié)合本組研究結(jié)果分析認為，Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7表達水平與宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系可建立風險模型評估。Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7免疫組化檢測方法與過程相對較為簡單，檢測費用不昂貴，可在各級醫(yī)院中開展。

綜上所述，Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7表達陽性是宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的危險因素；Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7免疫組化因素與宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)性模型研究具有一定的研究價值及預(yù)警作用。