CA2、CA9蛋白在舌鱗狀細胞癌的表達及預后價值

肖巧玲　祖木熱提古麗?阿不來提　趙格　徐江　黎昌學

摘要：目的 探討CA2、CA9蛋白在舌鱗狀細胞癌（TSCC）中的表達及生存意義，并分析兩者表達相關性及在癌癥中的潛在機制。方法 UCSC Xena在線分析CA2、CA9 mRNA在TSCC和對應正常組織中的表達，免疫組化驗證CA2、CA9蛋白在89例TSCC及29例癌旁正常組織中的表達，并分析CA2、CA9蛋白表達相關性及其與臨床因素相關性，同時研究了CA2、CA9對TSCC的診斷及生存意義。最后用STRING和Metascape數據庫進一步探索了CA2和CA9蛋白潛在作用機制。結果 與癌旁正常組織相比，UCSC Xena數據庫顯示CA2、CA9 mRNA在TSCC中均高表達（均P<0.05），同時免疫組化實驗表明CA2、CA9蛋白在TSCC中也顯著高表達（均P<0.05）。其中，CA2蛋白在TSCC中高表達率為21.35%，CA9高表達率達61.80%。CA2蛋白高表達與TSCC更好的分化程度相關（P<0.05），CA9過度表達與更差的T分期明顯相關（P<0.05），且CA2與CA9蛋白表達呈正相關（r=0.240， P<0.05）。CA2、CA9蛋白在TSCC中的ROC曲線下面積分別為83.9%、85.8%，且兩者過度表達均與患者的不良預后相關（均P<0.05）。COX多因素模型提示CA9過度表達可能是TSCC預后不良的獨立因素（HR：2.748， P<0.05）。CA2、CA9可能參與了調節pH、缺氧反應等生物過程。結論 CA2、CA9蛋白高表達提示TSCC患者的預后不良。

關鍵詞：舌鱗狀細胞癌；CA2；CA9；診斷；預后

中圖分類號：R739.86中圖分類號文獻標志碼：A文獻標識碼

Expression and prognostic value of CA2 and CA9 proteins in tongue squamous

cell carcinoma

XIAO? Qiaoling1，ABULAITI·Zumuretiguli1，ZHAO? Ge2，XU? Jiang3，LI? Changxue3*

（1 School of Medicine， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832000，China; 2 Yantai Stomatological Hospital， Yantai，Shandong

264008， China; 3 The First Affiliated Hospital， School of Medicine， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832000， China）

Abstract： Objective To investigate the expression and survival significance of CA2 and CA9 protein in TSCC （tongue squamous cell carcinoma， TSCC）， and to analyze the correlation between the expression of CA2 and CA9 proteins and their potential mechanisms in cancer. Methods UCSC Xena analyzed the expression of CA2 and CA9 mRNA in TSCC and corresponding normal tissues. Then we detected the expression of CA2 and CA9 proteins in 89 cases of TSCC and 29 cases of normal tissues adjacent to cancer by immunohistochemistry and analyzed the correlation between CA2 and CA9 protein expression and clinical factors. Meanwhile， we studied the significance of CA2 and CA9 in the diagnosis and survival of TSCC. Finally， the potential mechanisms of CA2 and CA9 proteins were further explored using STRING and Metascape databases.Results Compared with normal adjacent tissues， CA2 and CA9 mRNA were highly expressed in TSCC by UCSC Xena database （both P<0.05）， and immunohistochemical experiments indicated that CA2 and CA9 protein were also significantly higher in TSCC （both P<0.05）. The high expression rate of CA2 and CA9 protein in TSCC was 21.35% and 61.80%， respectively. In TSCC， the high expression of CA2 protein was correlated with the better differentiation （P<0.05）， the overexpression of CA9 was significantly related to the worse T-stage （P<0.05）. The results showed the expression of CA2 was positively correlated with CA9 in TSCC （r=0.240， P<0.05）. The area under ROC curved of CA2 and CA9 of TSCC was 83.9%and 85.8%， respectively. And the overexpression of CA2 and CA9 was correlated with poor prognosis of patients （both P<0.05） in TSCC.COX multivariate model suggested that CA9 overexpression might be an independent factor of poor prognosis of TSCC （HR：2.748， P<0.05）. Furthermore， CA2 and CA9 might be involved in biological processes such as pH regulation and hypoxia response.Conclusion High expression of CA2 and CA9 protein suggested poor prognosis of TSCC patients.

Key words： tongue squamous cell carcinoma;CA2;CA9;diagnosis;prognosis

口腔癌約占惡性腫瘤的3%［1］，其中90%是鱗狀細胞癌，而舌鱗狀細胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）高達50%～60%［2］。TSCC的發病率和死亡率較高，5年生存率僅為50%［2］，因此尋求有效的生物標記物改善TSCC患者的預后和治療很有必要性。

碳酸酐酶（carbonic anhydrases，CAs）是一種鋅蛋白酶家族，目前在人類中已經發現15種亞型，它們具有不同的序列，卻有相似的3D結構［3］。根據細胞定位主要分為胞質、膜結合、線粒體及分泌相關同工酶，其中，CA2屬于胞質型，CA9屬于膜結合型。碳酸酐酶主要參與人體二氧化碳與碳酸氫根之間的轉化、pH調節、糖異生、鈣化等生理過程，同樣也在青光眼、肥胖、溶血性貧血及腫瘤等病理過程中發揮重要作用［4］。研究發現CA2表達與結直腸癌的侵襲性相關［3］，也會影響腦膜瘤的增殖［5］。CA9促進多種癌癥發生發展，可能通過調控上皮間質轉化相關分子表達來增加肝癌惡性并影響預后［6］，同時也是腎透明細胞癌、乳腺癌的治療靶點［4，7］。

目前，關于CA9在口腔鱗狀細胞癌中的表達已有初步研究，但CA2的表達水平仍缺乏探索。本研究擬通過免疫組化實驗和生物信息學數據分析CA2、CA9在TSCC中的潛在表達機制與臨床應用價值，并初步探索兩者之間的相關性，以期為TSCC新的診斷治療靶點提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 患者和樣本

收集來自2004年至2020年石河子大學醫學院第一附屬醫院口腔頜面外科手術切除的89例原發TSCC患者的石蠟標本，并選取29例對應的癌旁正常組織作為對照組。整理所有病例的臨床病理資料，并參照第8版AJCC（the American Joint Committee on Cancer，AJCC）TNM分期標準進行臨床分期。通過病歷、電話和其他方法對患者進行隨訪，截止日期為2021年07月31日或死亡日期。

1.2 免疫組化

免疫組化采用EnVision兩步法，切片在二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各脫蠟5 min，然后在90%、80%、70%無水乙醇中再水合，加入一抗（稀釋比例：CA2∶1∶200;CA9∶1∶200）在4℃下孵育過夜，然后用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌切片組織，并使用EnVision TM 37℃溫箱孵育30 min，用二氨基聯苯胺（DAB）顯色觀察，樣本用蘇木精復染，再用酒精和二甲苯脫水封片。

1.3 評分標準

兩名病理學家采用獨立雙盲法完成免疫組化染色評分，CA2、CA9染色結果分別以胞漿、胞膜出現棕黃色顆粒為陽性，并通過陽性細胞所占面積和染色強度兩者計分乘積來判斷。（1）陽性細胞面積百分比：＜5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。（2）細胞著色強度：無著色、黃色、棕黃色、棕色分別為0、1、2、3分。≤7分為低表達，8～12分為高表達。

1.4 生物信息學數據

UCSC Xena（https：//xenabrowser.net/）是由TCGA數據庫衍生的一個非常直觀的在線網站。本研究篩選條件：數據來源：TCGA Head and Neck Cancer（HNSC）數據集；基因表達RNAseq：llluminaHiSeq；解剖部位：舌和舌根；組織學類型：鱗狀細胞癌；樣本類型：原發腫瘤。最終篩選出155例原發TSCC組織和對應的15例正常組織。

SRTING數據庫（https：//cn.string-db.org/）是一個可以基于單個或多個蛋白預測其可能蛋白網絡的在線網站。本研究篩選條件：最低置信度得分：中等可信度（0.400）。

Metascape（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）是一個專注于基因功能注釋和富集通路分析的網站。分析條件：個性化分析；最小重疊區域：3；最小富集：1.5；P值截點：0.01；富集分析：分子功能、生物功能和細胞成分GO分析及KEGG通路分析。

1.5 統計

使用SPSS軟件23.0版進行統計學分析。用χ2檢驗評估CA2、CA9在TSCC中的表達及其與臨床病理因素的相關性。Spearman分析CA2與CA9表達的相關性并繪制散點圖。ROC曲線評估CA2、CA9對TSCC的免疫診斷價值，Kaplan-Meier分析繪制存活曲線，COX單因素及多因素模型評估CA2、CA9對TSCC的生存影響。生物信息學數據均采用在線統計分析，P＜0.05認為差異有統計學意義（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000）。

2 結果

2.1 CA2、CA9 mRNA和蛋白在TSCC中的表達

利用UCSC Xena在線數據庫的TCGA數據集篩選出TSCC樣本后分析CA2、CA9 mRNA的表達。結果顯示，與正常組織相比，CA2、CA9 mRNA在TSCC中均表現出高表達（P<0.001;P<0.000），結果見圖1。

免疫組化結果表明，CA2、CA9蛋白在TSCC中的表達水平都高于癌旁正常組織（P=0.015，P<0.000），CA2主要定位于細胞漿，CA9定位于細胞膜（圖2）。其中，CA2在TSCC中高表達率為21.35%，CA9在TSCC中高表達率占61.80%，結果見表1。

2.2 CA2、CA9蛋白與TSCC臨床因素相關性

TSCC中，CA2蛋白過度表達與較好的分化程度顯著相關（P=0.027），結果見圖3，與患者年齡、性別、淋巴轉移、T及TNM分期無明顯相關；CA9蛋白高表達與更差的T分期明顯相關（P=0.018），而與年齡、性別、淋巴轉移、TNM分期和分化程度無相關性，結果見表2。

2.3 TSCC中，CA2與CA9蛋白表達的相關性分析

同時，根據免疫組織化學評分結果，Spearman分析表明，CA2與CA9蛋白表達水平在TSCC中呈正相關，且有統計學意義（r=0.240，P=0.023），結果見圖4。

2.4 CA2、CA9蛋白與TSCC的ROC曲線

接著，利用ROC曲線評估CA2、CA9蛋白對TSCC患者的免疫組化診斷價值。CA2、CA9蛋白在TSCC中的ROC曲線下面積分別為83.9%、85.8%。同時根據約登指數最大值得出CA2的敏感度為77.5%，特異性為79.3%，CA9的敏感度和特異性分別為87.6%和75.9%，結果見圖5。

2.5 CA2、CA9蛋白與TSCC患者的預后分析

進一步研究CA2、CA9蛋白表達對TSCC患者的預后影響。89例TSCC患者中，71例獲得隨訪信息。對71例TSCC患者進行Kaplan-Meier分析，結果表明CA2高表達預測了TSCC患者更低的生存率（P=0.023），同時，CA9蛋白過度表達也與TSCC更短的生存率顯著相關（P=0.005），結果見圖6。

建立CA2、CA9蛋白及TSCC臨床病理因素的COX單因素、多因素模型，如圖7所示。

COX單因素回歸模型顯示CA2、CA9蛋白表達及T分期的增加均是TSCC患者預后差的重要影響因素（風險比（hazard ratio，HR）：2.353，P= 0.027;HR：2.866，P=0.008；HR：5.139，P=0.000）。COX多因素分析表明CA9蛋白過度表達及T分期增加是TSCC患者預后不良的獨立影響因素（HR：2.748，P=0.030;HR：13.682，P=0.001）。

2.6 CA2和CA9蛋白網絡圖

基于STRING網站在線分析CA2、CA9人類相關蛋白網絡圖，篩選出前50個相關蛋白，CA2和CA9蛋白通過實驗測定及文本數據挖掘表明兩者存在關聯，提示CA2、CA9存在蛋白同源性，并預測兩者之間存在基因共表達，也再次驗證了免疫組化分析的CA2與CA9蛋白之間明顯相關的結論（圖8）。

2.7 CA2、CA9富集通路分析

最后，Metascape數據庫根據CA2、CA9和前50個相關蛋白進行通路富集分析。前20個GO分析表明，CA2和CA9主要位于外側質膜中，兩者主要參與了調節PH值和缺氧反應等生物過程，可能具備碳酸鹽脫水酶活性等分子功能。前10個KEGG通路顯示CA2和CA9主要參與了腎細胞癌、粘合連接等信號通路（圖9）。

3 討論

CAs可通過調節pH參與人類多種癌癥的發生發展，且是多種疾病的標記物［3］。最近研究表明CA2在非小細胞肺癌中低表達［4］，在膠質母細胞瘤［8］、脊索瘤［9］中高表達，CA9在頭頸部鱗癌、肝癌、乳腺癌等多種癌癥中上調［4］。然而，鮮少有關于CA2、CA9在TSCC中的表達及預后意義的研究。本研究發現CA2、CA9蛋白在TSCC中的表達均高于正常組織，且兩者蛋白表達水平呈正相關關系，提示CA2和CA9可能作為促癌基因共同參與TSCC的發展。

CA2位于染色體8q21.2上，是一種極其活躍的胞質相關同工酶，對CO2的周轉率可接近擴散極限，并廣泛分布于人體的大腦、肝、結直腸、肺、生殖器官等多種組織。Korhonen等［5］發現CA2高表達增加腦膜瘤的惡性程度，并與腫瘤分化程度相關。CA2在腹膜假性黏液瘤中高表達，且預示著患者的不良預后［10］，而Zhang等［11］學者提出相反的結論，認為高表達的CA2預示著肝癌患者較好的總體生存率。本研究發現CA2蛋白與TSCC分化程度相關，且CA2高表達是TSCC預后差的重要影響因素。浸潤深度、腫瘤分級、侵入方式等都影響口腔鱗癌患者的預后，提示CA2過度表達是TSCC患者預后差的潛在標記物，CA2在不同組織來源的惡性腫瘤中發揮不同作用。此外，ROC曲線被廣泛應用于評價醫學診斷相關標記物，其中，AUC是評估診斷價值的重要指標［12］，CA2對TSCC的ROC曲線下面積為83.9%，提示CA2對TSCC免疫組化診斷存在一定價值，可作為潛在標記物。Becker等學者在爪蟾卵母細胞中發現CA2具有催化MCT1和MCT4等轉運體的作用［13］，單羧酸轉運體（monocarboxylate transporters，MCTs）可通過運輸腫瘤微環境的代謝物發揮促瘤作用，高表達的MCT1和MCT4是頭頸部鱗癌的功能性生物標記物［14］，CA2可能作為中介為MCT1、MCT4等多種轉運體提供底物，從而導致微環境酸化［4］，而細胞外較低的pH與惡性腫瘤的侵襲與預后不良相關［3］。同時，基因譜分析表明CA2與結直腸癌的轉移相關，可能機制是缺乏CA2可以保護腫瘤細胞免受pH值波動，保持細胞穩態［15］。本研究通過生物信息學預測CA2和CA9可能共同參與了調節pH值、缺氧反應等生物過程，因此，我們推測CA2在惡性腫瘤中通過調節pH發揮作用。

CA9位于染色體9p12-13上，是一種多結構域的膜結合同工酶，也是頭頸部鱗癌、乳腺癌、前列腺等多種癌癥的潛在標記物，目前已有有力證據表明CA9在缺氧條件下表達，調節腫瘤微環境的pH，從而促進腫瘤的發生、增殖、侵襲等惡性行為［4］。CA9在胰腺癌中與腫瘤大小呈正相關［16］，也有學者提出CA9與TSCC的T分期顯著相關［17］，這與我們的研究結果一致。同時，本研究發現過度表達的CA9是影響患者預后不良的獨立因素，一致的是，Smith等［18］也提出高表達的CA9與前列腺癌較差的預后有關，而Gu等［19］認為CA9的高表達預示膽管癌更好的預后。此外，CA9對TSCC的ROC曲線下面積為85.8%，提示CA9可作為TSCC免疫組化診斷的潛在標記物。低表達的E-cadherin是增加口腔鱗癌侵襲性的可靠指標，CA9可調節E-cadherin介導的細胞粘附能力從而增加惡性腫瘤細胞的侵襲性，提示CA9可能通過E-cadherin從而增加TSCC的侵襲能力［20］。酸化的微環境不利于免疫細胞和正常細胞的存活與發揮功能，但能促進癌細胞的生長。CA9可與Na+/HCO3-共轉運體和陰離子交換器直接作用，催化細胞外環境中的CO2可逆水合作用，促使形成pH過低的腫瘤微環境，同時，CO2水化作用會導致酸擠壓增強，進而增強癌細胞的pH緩沖活性與抗凋亡特征，并形成堿化的細胞內環境，此外，缺氧也會存在進而激活CA9，加重腫瘤微環境的酸化程度［21］。提示CA9可能通過參與調節pH、缺氧反應、增加細胞粘附促進惡性腫瘤的發展，這與我們通過生物信息學預測的一致。CA2和CA9在結構上具有相同的質子穿梭殘基和鋅配體，同源性約33%，兩者之間可能通過陰離子交換蛋白致使腫瘤外環境酸中毒［22］。也有研究報道，CA2和CA9可能通過調節pH值促使細胞酸化而產生適合腫瘤生長的微環境［22］。提示CA2與CA9之間可能通過共同調節pH促進TSCC的發生發展。但是關于CA2和CA9在TSCC中的具體機制仍待進一步探索和實驗驗證。

綜上所述，CA2、CA9蛋白在TSCC中明顯高表達，且兩者表達呈正相關。CA2和CA9對TSCC具有良好的診斷價值，且與預后不良顯著相關，提示CA2、CA9可能是TSCC患者潛在的預后標記物。CA2和CA9可能通過共同調節pH酸化腫瘤微環境發揮促癌作用，但目前仍需更多的樣本驗證其臨床研究價值及潛在表達機制。

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（責任編輯：編輯唐慧）

收稿日期：中文收稿日期2022-05-27

基金項目：國家自然科學基金項目（82160572）;新疆維吾爾自治區研究生科研創新項目（XJ2020G102）

作者簡介：肖巧玲（1996—），女，碩士研究生，專業方向為口腔頜面外科。

*通信作者：黎昌學（1969—），男，主任醫師，從事口腔頜面部腫瘤治療研究，e-mail：lichangxue100@163.com。