pre-S基因變異與乙型肝炎病毒感染患者肝功能和肝纖維化的相關性

馬苗苗,劉 媛

陜西省西安市第五醫院檢驗科,陜西西安 710082

HBV感染可致使機體肝臟炎癥損傷,不及時治療可導致HBV反復感染,導致患者的肝功能發生難以逆轉的損傷,增加肝硬化等不良預后的發生風險[1]。目前HBV感染患者預后的具體影響機制尚未清晰,明確其發生的相關機制對于患者病情的早期控制可能具有積極意義。研究發現,HBV由S區、X區等4個編碼區構成,其中S區包括pre-S基因和S基因區,而pre-S基因與HBV復制、侵襲、機體免疫等均具有明顯的關系[2]。有研究發現,機體中HBV-DNA極易由于宿主免疫、藥物等的影響,在反轉錄過程中發生變異,其中pre-S基因變異發生率較高[3]。研究認為,pre-S基因變異能夠促使HBV免疫逃逸,是導致HBV感染患者病情進展的重要因素[4]。但是目前關于pre-S基因變異與HBV感染患者肝功能和肝臟纖維化指標關系的研究較少。因此,本研究納入HBV感染患者178例,對此進行了分析,現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年12月至2022年6月本院收治的HBV感染者178例作為研究對象,其中無癥狀HBV攜帶患者65例作為對照組,慢性乙型肝炎(CHB)患者70例作為CHB組,乙型肝炎肝硬化患者43例作為肝硬化組。納入標準:各組均根據《慢性乙型肝炎防治指南:2019版》[5]進行診斷,并符合相關診斷標準;基因型均為HBV C型;HBV-DNA定量檢測均≥104IU/mL;均成功獲取pre-S基因序列。排除標準:合并丙型肝炎等其他肝臟疾病;有外科手術史;存在精神障礙;患惡性腫瘤;患血液系統疾病;有近6個月抗病毒等相關治療史;患其他感染性疾病;有藥物依賴史;有酗酒史。對照組中男41例、女24例,年齡31～54歲、平均(42.78±5.96)歲。CHB組中男45例、女25例,年齡29～57歲、平均(42.37±5.73)歲。肝硬化組中男27例、女16例,年齡32～56歲、平均(42.49±6.01)歲。3組基礎資料比較,差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究通過本院醫學倫理委員會審核(LIB-20230533)。所有患者對本研究均知情同意。

1.2方法 采集3組患者清晨空腹靜脈血10 mL,使用美國Beckman AU5821全自動生化分析儀測定肝功能,相關指標包括丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、清蛋白。使用放射免疫法測定肝臟纖維化指標,相關指標包括層粘連蛋白、透明質酸以及Ⅲ型前膠原肽,試劑盒購自上海透景生命科技股份有限公司,嚴格根據試劑盒說明書進行操作。

取3組患者血清,使用核酸提取試劑盒(寧波海爾施基因科技有限公司)進行HBV-DNA的提取。將待測HBV-DNA作為模板,使用巢式PCR法對HBV pre-S基因進行擴增。引物設計為IF:5′-ACCWTATWCYTGGGAACAA-3′;IR:5′-GAGAGAAGTCCACCACGAGT-3′;ⅠaF:5′-ACCWTATWCTGGGAACAA-3′;ⅠaR:5′-TTCCACTGCATGGCCTGAGGATGA-3′;ⅠbF:5′-GACTYGTGGACTTCTC-3′;ⅠbR:5′-GGGGTCCTAGGAATCCTGATG-3′。2輪PCR反應體系均為50 μL,其中首輪PCR擴增程序:94 ℃3 min預熱,94 ℃30 s變性,根據引物序列的不同使用差異化的退火溫度,退火 30 s,延伸72 ℃ 30 s,隨后95 ℃30 s開展30個循環,延伸72 ℃ 10 min。取首輪PCR產物作為第2輪PCR的模板,PCR擴增程序同首輪PCR。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳,確認產物質量,隨后使用PCR產物進行純化,并開展pre-S基因序列的測定。使用Lasergene軟件拼接序列,使用GenBank數據庫內已知基因型HBV毒株的參考序列與檢測序列進行核苷酸序列比對,檢測pre-S基因變異情況。其中pre-S基因變異包括缺失變異、T3116m變異、起始密碼子變異、T53m變異等,納入HBV感染患者中頻率超過10%的變異進行研究。根據是否發生基因缺失變異,將HBV感染患者分為變異組和非變異組。

1.3觀察指標 比較對照組、CHB組、肝硬化組患者的pre-S基因變異情況、肝功能和肝纖維化指標水平。比較變異組和非變異組的肝功能和肝纖維化指標水平。

2 結 果

2.1對照組、CHB組、肝硬化組患者的pre-S基因變異情況比較 對照組和CHB組pre-S基因缺失變異率明顯低于肝硬化組,CHB組pre-S基因缺失變異率明顯低于肝硬化組,差異均有統計學意義(P<0.05)。對照組、CHB組以及肝硬化組T3116m變異率、起始密碼子變異率、T53m變異率以及A3120m變異率比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 對照組、CHB組、肝硬化組患者的pre-S基因變異情況比較[n(%)]

2.2對照組、CHB組、肝硬化組患者的肝功能和肝纖維化指標水平比較 對照組和CHB組ALT、AST、層粘連蛋白、透明質酸以及Ⅲ型前膠原肽水平明顯低于肝硬化組,清蛋白水平明顯高于肝硬化組,差異均有統計學意義(P<0.05)。對照組ALT、AST、層粘連蛋白、透明質酸以及Ⅲ型前膠原肽水平明顯低于CHB組,清蛋白水平明顯高于CHB組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 對照組、CHB組、肝硬化組患者的肝功能和肝纖維化指標水平比較

2.3變異組和非變異組患者的肝功能和肝纖維化指標水平比較 將43例基因缺失變異患者納入變異組,135例非基因缺失變異患者納入非變異組。非變異組ALT、AST、層粘連蛋白、透明質酸以及Ⅲ型前膠原肽水平均明顯低于變異組,清蛋白水平明顯高于變異組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 變異組和非變異組患者的肝功能和肝纖維化指標水平比較

2.4pre-S基因變異類型與患者肝功能和肝纖維化指標的相關性 pre-S基因缺失變異與ALT、AST、層粘連蛋白、透明質酸、Ⅲ型前膠原肽水平均呈正相關(P<0.05),與清蛋白水平呈負相關(P<0.05)。T3116m變異、起始密碼子變異、T53m變異、A3120m變異與ALT、AST、清蛋白、層粘連蛋白、透明質酸、Ⅲ型前膠原肽水平均無相關性(P>0.05)。見表4。

表4 患者肝功能和肝纖維化指標與pre-S基因變異類型的相關性

3 討 論

HBV屬于DNA病毒,其中pre-S基因為HBV基因組中較易發生變異的區域,主要包括pre-S1、pre-S2基因,可通過編碼pre-S1、pre-S2等HBV外膜蛋白,參與HBV的復制、侵襲、機體免疫反應等過程[6-7]。pre-S基因變異主要包括缺失、起始密碼子突變等類型,能夠通過改變病毒復制、機體免疫應答等機制促進HBV感染疾病的進展[8-9]。目前認為,不同地區HBV感染患者的pre-S變異類型具有一定差異,關于pre-S變異類型與HBV感染患者病情的關系尚存在爭議[10]。其中pre-S基因缺失變異被認為是預測肝細胞癌發生和術后復發的有效生物標志物[11]。本研究發現,隨著HBV感染患者病情的進展,pre-S基因變異率明顯提高,尤其是pre-S缺失變異率,這可能是由于pre-S基因的缺失變異能夠影響病毒復制、與宿主的結合、免疫應答等生理過程,并可促使乙型肝炎表面抗原(HBsAg)水平增加以及在內質網的累積,使HBV顆粒的合成減少,導致毛玻璃樣肝細胞的發生,進而加重肝臟損傷,促使患者病情進展,增加了肝硬化等的發生風險[12]。此外,本研究發現,在HBV感染患者中,除了pre-S基因缺失發生頻率較高以外,常見的基因變異還包括起始密碼子變異。研究發現,pre-S基因起始密碼子變異能夠對啟動子活性產生抑制作用,使小S蛋白合成受阻,HBsAg合成異常,進而不利于病毒顆粒的裝配與釋放[13]。但是本研究發現,對照組、CHB組、肝硬化組間起始密碼子變異率比較,差異無統計學意義(P>0.05)。關于起始密碼子變異與HBV感染患者病情的關系需納入更多樣本進行深入分析。

ALT、AST、清蛋白是衡量機體肝功能的常用指標,層粘連蛋白、透明質酸以及Ⅲ型前膠原肽是評估機體肝臟纖維化嚴重程度的有效指標,在臨床中均應用廣泛。本研究發現,ALT、AST、層粘連蛋白、透明質酸、Ⅲ型前膠原肽水平在對照組、CHB組以及肝硬化組中逐漸增加,清蛋白在對照組、CHB組以及肝硬化組中逐漸降低,提示隨著HBV感染患者病情嚴重程度的增加,肝功能損傷和肝臟纖維化均逐漸加重。這可能是由于HBV感染對肝臟產生炎癥刺激,促使肝細胞損傷,進而導致肝功能異常;HBV感染能夠增強肝星狀細胞活性,導致細胞間基質在肝臟累積,進而促使肝臟纖維化的進展[14]。此外,有研究認為,T3116m為HBV感染患者發生肝硬化的獨立影響因素[15],但是本研究中并未見此關聯,可能是樣本差異所致。關于T3116m與乙型肝炎肝硬化的關系需深入分析。

本研究發現,變異組ALT、AST、清蛋白、層粘連蛋白、透明質酸、Ⅲ型前膠原肽水平與非變異組比較,均具有明顯差異,且HBV感染患者肝功能、肝硬化指標水平與pre-S基因缺失明顯相關,進一步提示pre-S基因缺失可能通過改變肝功能、加快肝臟纖維化進程,促進HBV感染病情的進展。這可能是由于pre-S1基因與病毒增殖周期有關,pre-S1基因的缺失可阻礙機體免疫系統對pre-S1蛋白的識別,抑制相應抗體的合成,進而不利于機體對病毒的清除[16-17]。pre-S2基因可通過pre-S2蛋白的表達,減少HBV所致炎癥損傷,pre-S2基因表達的缺失可抑制機體免疫反應,加重HBV感染;可阻礙HBV小蛋白等的分泌,促使大球形HBV顆粒表達增加[18-19]。也有研究發現,肝硬化失代償期患者pre-S基因缺失率明顯高于代償期[20]。關于pre-S基因缺失情況與肝硬化患者病情嚴重程度的關系仍需進一步分析。

綜上所述,pre-S基因缺失變異與HBV感染患者肝功能和肝纖維化指標明顯相關。臨床中對于pre-S基因缺失的HBV感染患者,應密切關注其肝功能和肝纖維化指標水平的變化,并及時進行對癥治療,以延緩病情進展,改善患者預后。