茶多酚-淀粉納米顆粒穩定Pickering乳液的特性

王 然

（1.長春職業技術學院食品與生物學院，吉林 長春 130033；2.吉林大學生物與農業工程學院，吉林 長春 130022）

乳液是一種膠體體系，由不相容的兩相（通常是油和水）組成，其中一相（分散相）以小液滴的形式分散在另一相（連續相）中[1]。乳液主要由3 部分構成：分散相、連續相以及油-水界面。根據分散相和連續相的構成不同，乳液分為水包油、油包水、水包油包水和油包水包油等類型。乳液具有較高的界面能，屬于熱力學不穩定體系，在乳液體系中，由于分散相與連續相之間存在極性和密度等差異，所以乳液易發生相分離而降低體系的界面能[2]。在食品工業中，普遍采用乳化劑維持乳液的穩定，常用的乳化劑主要為小分子表面活性劑，其能夠作用于油水界面，通過降低界面能，使分散相以微滴的形式分散在連續相中，保持乳液穩定[3]。乳化劑主要包括傳統乳化劑和顆粒乳化劑。傳統乳化劑一般是由兩親性分子組成，即分子的一端能連接親水基團，另一端能連接親油基團，兩親性分子能在油水界面形成吸附層，阻止分散相聚集，以維持乳液穩定[4]。顆粒乳化劑是一類具有界面活性的固體顆粒，具有較高的界面能，能夠快速地吸附到油水界面，降低界面張力，并在界面上形成一層緊密的物理屏障，抑制分散相聚集；由于吸附到界面上顆粒具有極高的解吸能，所以顆粒吸附幾乎為不可逆吸附，形成的乳液能夠保持長期穩定[5]，這種由顆粒穩定的乳液稱為Pickering乳液[6]。由于Pickering乳液具有良好的穩定性、應用范圍廣、后期可分離并且對環境友好等優點，受到不同領域研究者的廣泛關注。

淀粉因其來源廣、價格低廉、易于改性并且具有良好的生物相容性而被廣泛研究。不同生物源的淀粉顆粒如藜麥淀粉、大米淀粉、木薯淀粉、土豆淀粉、玉米淀粉等[7-9]均被改性作為顆粒乳化劑。對淀粉的改性主要包括2 個方面，一是減小淀粉顆粒的粒徑，因為粒徑較小的顆粒能夠快速吸附到油水界面并有助于形成小乳滴乳液；二是提高淀粉顆粒的表面潤濕性[10]，目前普遍采用化學改性的方式，利用酯化劑（例如辛烯基琥珀酸酐）為淀粉分子接枝親脂基團以提高其疏水性[11]。食品研究領域對具有疏水性的淀粉顆粒用于穩定Pickering乳液進行廣泛且深入的研究，但還需要認識到乳液是油水混合體系，易于發生油脂氧化，油脂氧化會產生羥自由基等，并導致脂溶性生物活性物質降解甚至功效喪失[12]。對于既能作為顆粒乳化劑穩定乳液，又能在界面上發揮抗氧化功能的生物源淀粉顆粒的報道還相對較少。

茶多酚（tea polyphenols，TP）是從茶葉中提取的一類多羥基酚類化合物，其具有多種生理功能[13]，是天然的抗氧化劑。目前，關于TP生理活性開發的研究主要集中在與蛋白質之間的相互作用[14]；然而，TP作為抗氧化劑與淀粉進行相互作用，同時賦予淀粉顆粒乳化性和抗氧化性的研究還鮮見報道。Zhang Die等[15]將TP與淀粉納米纖維交聯制備食品包裝膜，發現TP與淀粉分子的羥基能發生氫鍵相互作用，使淀粉分子表面的羥基減少，進而增強淀粉疏水性。本課題前期采用高直鏈玉米淀粉、普通玉米淀粉、蠟質玉米淀粉分別與TP結合，制備TP-高直鏈玉米淀粉納米顆粒（starch nanoparticles，SNP）、TP-普通玉米SNP、TP-蠟質玉米SNP，然后將3 種顆粒分別用于穩定Pickering乳液，研究發現，TP-蠟質玉米SNP制備的Pickering乳液的穩定效果明顯優于另外2 種顆粒，因此，本研究以蠟質玉米淀粉為原料，結合TP制備納米顆粒，考察TP對SNP結構性質和顆粒性質的影響，并研究TP-SNP對其穩定的Pickering乳液性質的影響，揭示TP與淀粉的相互作用，旨在為開發新型具有抗氧化功能的食品級淀粉基顆粒乳化劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠟質玉米淀粉 中糧生物科技股份有限公司；油茶籽油 玉山縣大成倉食品有限公司。

TP 杭州禾田生物技術有限公司；尼羅藍 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；尼羅紅 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；實驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Zetasizer Nano ZSE激光納米粒度儀、Mastersizer3000激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；FA25高剪切分散乳化機 上海弗魯克科技發展有限公司；Nexus670傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier transforminfrared spectroscopy，FT-IR）美國熱電集團尼高力儀器公司；JSM-6700冷場發射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）日本電子株式會社；UVmini-1240紫外-可見分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司；FV3000激光共聚焦熒光顯微鏡 奧林巴斯（中國）有限公司；SL200KS光學法接觸角儀 美國科諾工業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 TP-SNP制備

參考Peng Shanli等[16]和王然[17]的方法并稍作修改。用去離子水將蠟質玉米淀粉配制成質量分數為2%的懸浮液，并置于100 ℃恒溫水浴中連續攪拌加熱40 min，然后加入基于淀粉質量10%的TP，并置于95 ℃恒溫水浴中連續攪拌加熱20 min。加熱結束后，將淀粉與TP的混合液冷卻至25 ℃，然后逐滴滴入體積為混合液5 倍的無水乙醇溶液中進行沉淀。將混合液于3 500 r/min離心15 min，回收上清液，將沉淀物用無水乙醇溶液洗3 遍，并回收醇洗液，于-70 ℃進行真空干燥，制得TP與蠟質玉米SNP復合物（TP-SNP）。

采用相同方法制備蠟質玉米SNP作為對照組，淀粉懸浮液在100 ℃恒溫水浴中連續攪拌加熱60 min，不添加TP。

1.3.2 TP保留率的測定

參考Li Songnan等[7]方法，略有修改。在制備TP-SNP過程中，將TP-SNP經醇沉和醇洗處理后離心得到的上清液進行混合，并記錄上清液體積。根據TP質量濃度-吸光度標準曲線，利用紫外-可見分光光度計在274 nm波長處檢測上清液的吸光度，計算得到TP質量濃度。TP保留率按式（1）計算：

式中：mt為TP最初添加質量/mg；C為上清液中TP的質量濃度/（mg/mL）；V為上清液的體積/mL。

1.3.3 FT-IR測定

將樣品在真空條件下干燥至質量恒定，然后將其與KBr以1∶75（g/g）的比例混合并壓制成直徑5 mm、厚度1 mm的圓片，在4 000～400 cm-1范圍內進行光譜掃描，設置光譜分辨率4 cm-1，經32 次掃描獲得樣品FT-IR譜圖。

1.3.4 SEM觀察

將經過無水乙醇溶液沉淀后的SNP、TP-SNP樣品濕基滴加到硅片上，進行凍干處理。將樣品固定在樣品臺上，經過噴金處理后，置于掃描電子顯微鏡樣品室中，抽真空，當真空度達到5×10-3Pa時，對樣品的表面形態和尺寸進行觀察并拍照。

1.3.5 接觸角的測定

利用接觸角測定儀檢測SNP、TP-SNP樣品的界面接觸角。利用壓片機（設置壓強35 MPa，壓制時間3 min）將樣品壓成平整、致密的圓片（直徑2 cm，厚度2 mm），然后采用液滴法測定淀粉樣品的水相靜態接觸角，測量范圍為0°～180°。由儀器控制帶有毛細針頭的微量進樣器，將2 μL超純水滴在樣品圓片表面，待水滴在淀粉圓片表面平衡后進行拍攝，通過儀器自帶軟件采用Young’s方程分析接觸角。每個樣品至少在圓片表面取5 個點進行檢測，測量結果取5 個數值的平均值。

1.3.6 SNP粒度分布和Zeta電位的測定

將SNP與去離子水配制成質量分數為0.05%的懸浮液，超聲處理15 min，再將其置于納米粒度儀中，設置分散劑為水，顆粒折光率為1.530，在20 ℃條件下分別對樣品的粒度分布和Zeta電位進行檢測，檢測重復3 次，結果取平均值。

1.3.7 水包油Pickering乳液的制備

將SNP、TP-SNP樣品分別以不同的比例置于純凈水中，然后將油茶籽油以體積比1∶5的比例加入純凈水中，采用高速剪切乳化機在19 000 r/min剪切乳化3 min，制得SNP質量濃度分別為0.5、1、1.5、2 g/100 mL的Pickering乳液。將制備完成的Pickering乳液置于4 mL透明樣品瓶中，放置1 d，然后利用數碼相機記錄乳液樣品表觀。

1.3.8 乳化指數（emulsification index，EI）的測定

將新制備的乳液置于透明樣品瓶中，采用數碼相機分別記錄乳液靜置1 d和15 d的表觀，并測量乳液乳化層高度和乳液總高度。EI用于表征乳液樣品的乳化性能。EI按式（2）計算：

式中：He為乳液中乳化層的高度/cm；Ht為乳液的總高度/cm。

1.3.9 Pickering乳液粒度分布

利用激光粒度儀分別對不同濃度SNP、TP-SNP樣品制備的Pickering乳液進行粒度分布檢測，油相的折射指數和吸收指數分別設置為1.449和0.010，水相的折射指數設置為1.330。每個樣品檢測3 次，結果取平均值。

1.3.10 激光掃描共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）觀察

將10 μL 0.01%尼羅藍和尼羅紅依次加入到1 mL乳液樣品中，避光對乳液進行染色處理2 min，然后將乳液樣品注入玻底平皿中，再將玻底平皿置于CLSM載物臺上；設置尼羅藍的發射波長為488 nm，激發波長為513 nm，尼羅紅的發射波長為633 nm，激發波長為660 nm，對乳液的微觀結構進行觀察并拍照。

1.3.11 Pickering乳液脂質過氧化產物的測定及氧化穩定性

將制備的Pickering乳液樣品密閉存放于45 ℃恒溫箱中15 d，測定乳液中初級氧化產物的生成量，參考Kargar等[19]的測量方法，并略作修改。在1.5 mL混合溶液（異辛烷∶異丙醇=3∶1，V/V）中加入不同貯藏時間的Pickering乳液0.2 mL，并以4 000 r/min離心5 min。然后取0.2 mL上清液與2.8 mL混合溶液（甲醇∶正丁醇=2∶1，V/V）混合，再依次加入15 μL 3.94 mol/L硫氰酸銨溶液與15 μL 0.072 mol/L亞鐵離子溶液（0.132 mol/L BaCl2和0.144 mol/L FeSO4離心取上清液），避光靜置20 min，于510 nm波長處測量吸光度，利用過氧化氫異丙苯標準曲線計算Pickering乳液氫過氧化物的濃度，其中氫過氧化物的含量以過氧化值（peroxide value，POV）表示。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 TP-SNP性質分析

2.1.1 FT-IR分析

利用FT-IR對TP、SNP和TP-SNP的結構進行表征。如圖1a所示，3 600～3 200 cm-1處是羥基（—OH）伸縮振動形成的特征吸收峰，反映分子間或分子內氫鍵的形成[20]；1 700 cm-1處的吸收峰反映羰基（C＝O）的伸縮振動；1 236 cm-1處的吸收峰為醚鍵（C—O—C）的不對稱振動[21]。從圖1b可以看出，與SNP的紅外譜圖相比，TP-SNP在3 600～3 200 cm-1處羥基吸收峰的峰形發生明顯變化，同時吸收峰向波數減小的方向平移；與TP的紅外譜圖相比，TP-SNP在1 700 cm-1處也出現C＝O吸收峰，并在1 203 cm-1處出現向低波數方向平移的C—O吸收峰。Miao Zhikun等[22]將玉米淀粉與TP復合制備食品級包覆膜，發現淀粉與TP復合物在3 292 cm-1處的紅外特征峰向低波數方向平移，這是分子間羥基（—OH）發生相互作用。Lü Yaozhong等[21]將TP與土豆淀粉進行混合濕磨處理，其紅外譜圖中出現TP于1 695 cm-1處的C＝O吸收峰和1 242 cm-1處的C—O—C吸收峰，并發生輕微移動，說明TP和淀粉分子的羥基通過氫鍵進行相互作用，這與本研究的結果一致。

圖1 TP（a）、SNP和TP-SNP（b）的FT-IR圖Fig.1 Infrared spectra of TP (a),SNP and TP-SNP (b)

2.1.2 TP-SNP的微觀結構及顆粒性質

如圖2所示，與SNP的微觀形態相比，添加TP后，SNP的顆粒尺寸明顯增大，并且顆粒的尺寸變得不均勻，TP-SNP呈現不規則的形狀，并且顆粒之間有相連的跡象。

圖2 SNP（a）和TP-SNP（b）的SEM圖Fig.2 SEM images of SNP (a) and TP-SNP (b)

如圖3所示，與SNP相比，TP-SNP的平均粒徑相對較大，并且顆粒分散指數（particle dispersion index，PDI）也相對較大。PDI值表示顆粒的均勻程度，PDI值越小表明顆粒的粒度分布越均勻。SNP的粒度分布呈單峰分布，而TP-SNP粒度分布為雙峰分布，說明SNP的均勻程度明顯優于TP-SNP，這些結果均與顆粒微觀形態觀察（圖2）結果一致。此外，與SNP相比，TP-SNP與水相的界面接觸角較大，顆粒表面所帶負電荷數較多。與水相的接觸角反映顆粒能被水相的潤濕程度，TP-SNP與水相的界面接觸角增大，說明與SNP相比，TP-SNP疏水性增強[23-24]。有研究報道利用酶改性的淀粉制備顆粒乳化劑，顆粒的油水界面接觸角趨近90°，能長期保持Pickering乳液穩定[25]。顆粒表面所帶電荷也會對穩定Pickering乳液產生重要影響[26]，顆粒表面的同種電荷有助于在顆粒之間形成靜電斥力，抑制顆粒包裹的乳滴聚結，發揮穩定Pickering乳液的作用。

圖3 SNP（a）和TP-SNP（b）的接觸角、Zeta電位以及粒度分布Fig.3 Contact angle,zeta potential and particle size distribution of SNP (a) and TP-SNP (b)

2.2 不同顆粒質量濃度SNP和TP-SNP穩定的Pickering乳液

2.2.1 乳液的粒徑分布

乳滴粒徑分布是表征Pickering乳液性質的重要指標，而顆粒的尺寸和濃度是影響乳液粒徑分布的重要因素[27]。如圖4a所示，當SNP質量濃度從0.5 g/100 mL增加至2.0 g/100 mL時，Pickering乳液的乳滴粒徑分布曲線均呈單峰分布，并且隨著SNP質量濃度的增加，Pickering乳液的乳滴粒徑分布曲線峰向粒徑減小的方向平移。如圖4b所示，隨著TP-SNP質量濃度從0.5 g/100 mL增加至2.0 g/100 mL，Pickering乳液的乳滴粒徑分布曲線呈現多峰分布，并且隨著TP-SNP質量濃度的增加，Pickering乳液的乳滴粒徑分布主峰表現出先向大粒徑方向平移，而后又向小粒徑方向平移的趨勢；與SNP制備的乳液相比，TP-SNP穩定的乳液生成大量粒徑小于10 μm的乳滴，并且隨著TP-SNP質量濃度的增加，乳滴的粒徑減小。

圖4 不同顆粒質量濃度SNP（a）和TP-SNP（b）穩定的Pickering乳液的乳滴粒徑分布Fig.4 Droplet size distribution of Pickering emulsions stabilized by different concentrations of SNP (a) or TP-SNP (b)

如表1所示，與SNP相比，TP-SNP穩定的Pickering乳液的乳滴平均直徑明顯減小，并且，隨著TP-SNP質量濃度的增加，乳液的平均直徑D[4,3]、D（50）和D（90）明顯降低。通常，在乳液油水體積比確定的情況下，乳液中分散相乳滴的尺寸越小，油水之間的界面面積越大[28]，乳液的D[3,2]和比表面積也相應越大，因此，當乳液中有效的顆粒乳化劑濃度增加時，其所穩定的油水界面面積會增大。由SNP穩定的乳液，其乳滴粒徑分布D[4,3]、D（50）和D（90）均較大，但是D[3,2]和比表面積卻較小，這是由于SNP幾乎不具有界面活性，不能吸附在油水界面阻隔乳滴聚結，因此由SNP制備的乳液乳滴平均直徑較大。

表1 不同顆粒濃度的SNP和TP-SNP穩定的Pickering乳液的乳滴平均直徑Table 1 Mean droplet size of Pickering emulsions stabilized by different concentrations of SNP or TP-SNP

圖5為放置1 d不同質量濃度SNP和TP-SNP制備的Pickering乳液的表觀形態。如圖5a所示，由SNP制備的4 個乳液樣品，其最上層均出現明顯的油相層，即乳液發生油水分離，說明SNP不適用于穩定Pickering乳液。如圖5b所示，在TP-SNP質量濃度為0.5 g/100 mL時，乳液樣品上層出現油相層，這可能是因為當TP-SNP質量濃度較低時，其在乳滴表面覆蓋范圍較小，不能在油水界面上形成緊密的阻隔層，因此導致乳滴聚結并浮到乳液表面。當TP-SNP質量濃度不小于1.0 g/100 mL時，其穩定的Pickering乳液未出現油水分離現象，并且隨著TP-SNP質量濃度的增加，乳液質地愈加稠厚，乳化層（乳液白色部分）體積增加。當TP-SNP質量濃度從1.0 g/100 mL增加至2.0 g/100 mL時，乳液的EI值從50%增加至75%，這表明適宜濃度的TP-SNP能夠作為顆粒乳化劑用于穩定Pickering乳液。

圖5 不同顆粒質量濃度的SNP（a）和TP-SNP（b）穩定的Pickering乳液的表觀Fig.5 Appearance of Pickering emulsions stabilized by different concentrations of SNP (a) or TP-SNP (b)

2.2.2 乳液微觀結構觀察

利用CLSM觀察Pickering乳液的形貌以及SNP、TP-SNP在乳液體系中的分布情況。如圖6所示，由不同濃度的SNP和TP-SNP制備的Pickering乳液，其微觀結構形態呈現明顯差異。從圖6a、b可以看出，隨著SNP（標記為紅色）質量濃度從0.5 g/100 mL增加至2.0 g/100 mL，乳液中油滴（標記為綠色）的直徑減小，但是SNP在乳液中吸水膨脹并形成較大的膠塊結構，其沒有吸附到油水界面上，而是與油滴分離成各自獨立的體系，因此SNP沒有乳化能力，不適用于穩定Pickering乳液。如圖6c、d所示，隨著乳液中TP-SNP質量濃度從0.5 g/100 mL增加至2.0 g/100 mL，越來越多的TP-SNP吸附在油滴表面，致使油滴的尺寸減小，并且油滴的形態從橢圓形等不規則的形狀逐漸變為圓形，說明油滴的聚結得到有效抑制，表明質量濃度為2.0 g/100 mL的TP-SNP能吸附在油水界面上有效穩定Pickering乳液。

2.3 Pickering乳液的脂質氧化穩定性

油茶籽油中含有大量的不飽和脂肪酸，其在高溫條件下易發生氧化酸敗。通過對油脂的POV進行檢測，有助于了解乳液的氧化穩定性。圖7為不同質量濃度SNP和TP-SNP制備Pickering乳液的POV與貯藏時間的關系曲線。隨著貯藏時間的延長，不同質量濃度SNP和TP-SNP制備的Pickering乳液中氫過氧化物生成量均逐漸增加，這是由油脂的自動氧化導致。從圖7a可以看出，SNP質量濃度變化對乳液POV沒有產生明顯的影響。如圖7b所示，隨著TP-SNP質量濃度的增加，乳液的POV明顯降低，表明TP-SNP具有延緩油脂氧化的效果，這是因為TP-SNP可以吸附在油水界面并形成物理屏障，抑制氧化劑向油水界面傳遞氧，有效延緩油脂氧化；此外，TPSNP中TP的保留率為（18.10±0.62）%，TP賦予TP-SNP抗氧化活性，使其在油水界面阻斷油脂氧化反應，提高乳液的氧化穩定性[29]。Wu Hejun等[30]利用柚子皮粉復合TP制備可食生物復合膜，研究發現復合膜能顯著降低乳液中氫過氧化物的生成量，有效延緩油脂氧化，這與本研究結論相符。

圖7 不同顆粒質量濃度SNP和TP-SNP穩定的Pickering乳液貯藏15 d的POVFig.7 POV of Pickering emulsions stabilized by different concentrations of SNP or TP-SNP during 15-day storage

3 結論

在蠟質玉米淀粉中添加TP，然后利用乙醇沉淀法制備TP-SNP。通過FT-IR研究TP-SNP的結構性質，發現富含羥基的TP和蠟質玉米淀粉主要通過氫鍵連接；通過SEM觀察和粒徑分布檢測，研究TP-SNP的微觀形態變化和顆粒性質，發現添加TP導致SNP的顆粒形態變得不規則，并且導致其平均粒徑增加、粒度分布變得不均勻；通過接觸角測量儀和激光納米粒度儀研究TP-SNP的乳化性質，發現與SNP相比，TP-SNP和水相的接觸角增加，并且TP-SNP表面負電荷數增加，說明添加TP后，SNP的疏水性增強，較多的同種電荷有助于TP和SNP之間形成靜電斥力，這些因素均能促進TP-SNP在油水界面的吸附效果；通過激光粒度儀檢測乳液中油滴分布發現，與SNP穩定的乳液相比，TP-SNP穩定的Pickering乳液中產生大量的小乳滴，并且隨著TP-SNP質量濃度的增加，Pickering乳液中乳滴的尺寸明顯減小；利用CLSM觀察乳液的微觀結構發現，SNP在乳液中吸水形成膠塊，不能吸附到油水界面，因此不能用于穩定Pickering乳液，而TP-SNP則能緊密地吸附到油水界面，并且隨著TP-SNP質量濃度的增加，其在油滴表面的覆蓋面積增大，有助于穩定Pickering乳液。在乳液15 d貯藏期中，通過檢測乳液POV發現，與SNP制備的乳液相比，TP-SNP穩定的乳液POV明顯減小，并且乳液POV隨著TP-SNP質量濃度的增加而降低，說明TP-SNP具有延緩油脂氧化的作用。TP-SNP可以作為一種新型具有抗氧化功能的顆粒乳化劑用于穩定食品級Pickering乳液，其在構建食品級淀粉基Pickering乳液載體方面具有潛在應用價值。