核型分析與基因組拷貝數(shù)測(cè)序在NT值異常產(chǎn)前遺傳診斷中的價(jià)值

呂向坤 張堃 焦艾麗 劉洋 劉雪靜

頸項(xiàng)透明層(nuchal translucency,NT)是指超聲檢查在孕婦孕早期(11～13+6周)所測(cè)得的胎兒頸椎矢狀切面最大厚度,大量研究已經(jīng)證實(shí)NT增厚與胎兒染色體異常之間存在密切聯(lián)系,因此常將NT值作為早孕期產(chǎn)前超聲篩查的一種重要指標(biāo)[1]。目前臨床上一般認(rèn)為NT≥2.5 mm或NT≥3.0 mm者即屬于NT值增厚,但針對(duì)NT增厚具體截?cái)嘀等源嬖谝欢?zhēng)議[2]。細(xì)胞G顯帶染色體核型分析是目前臨床上評(píng)估孕期高危孕婦胎兒染色體異常的金標(biāo)準(zhǔn),已經(jīng)在產(chǎn)前診斷中廣泛使用,但由于以往普通G顯帶核型分析技術(shù)具有細(xì)胞培養(yǎng)周期長(zhǎng)、污染風(fēng)險(xiǎn)大且分辨率不高等眾多缺陷,使其應(yīng)用逐漸受限[3]。染色體拷貝數(shù)異常作為導(dǎo)致胎兒結(jié)構(gòu)畸形、先天性生長(zhǎng)發(fā)育遲緩以及其他各類遺傳綜合征的發(fā)病基礎(chǔ),對(duì)染色體異常部分進(jìn)行測(cè)序的產(chǎn)前診斷模式已經(jīng)成為近年來研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[4]。隨著產(chǎn)前診斷技術(shù)不斷進(jìn)步,染色體拷貝數(shù)變異測(cè)序(copy number variation sequencing,CNV-seq) 已成功應(yīng)用于臨床,該技術(shù)以大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)為測(cè)定基礎(chǔ),并表現(xiàn)出良好的檢測(cè)性能,可以實(shí)現(xiàn)染色體測(cè)序分辨率精確至0.1 Mb,有助于提高出生缺陷胎兒的產(chǎn)前篩查準(zhǔn)確率,且最新指南已將CNV-seq作為產(chǎn)前診斷一線檢查方案[5]。本研究對(duì)我院128例產(chǎn)前超聲篩查顯示為NT增厚的胎兒基因進(jìn)行核型分析以及CNV-seq分析,旨在探討核型分析與CNV-seq在NT值異常胎兒的產(chǎn)前遺傳診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2020年12月在醫(yī)院就診的128例早孕期(孕11～13+6周)超聲篩查提示胎兒NT≥2.5 mm的孕婦為研究對(duì)象,孕婦年齡20～42歲,平均(31.47±3.25)歲,孕周17+2～22+6周;平均(20.1±1.21)周;均為單胎妊娠。所有孕婦夫妻雙方在知情同意書上簽字,該研究方案已得到我院倫理委員會(huì)準(zhǔn)許。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①早孕期(孕11～13+6周)超聲篩查提示胎兒NT≥2.5 mm;②均為單胎妊娠;③患者均無高血壓、糖尿病等嚴(yán)重妊娠期合并疾病;④無惡性腫瘤或病史;⑤符合羊膜腔穿刺手術(shù)指征;⑥患者均簽署知情同意書。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：患者合并其他嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病或嚴(yán)重心、肝、腎功能不全者。

1.3 方法 對(duì)孕婦進(jìn)行羊膜腔穿刺手術(shù)并抽取適量羊水,并開展CNV-seq及核型分析。(1)取5 ml羊水外送至深圳華大基因公司進(jìn)行CNV-seq,主要檢測(cè)>100 kb的CNV、染色體非整倍體變異,評(píng)估致病性。(2)20 ml羊水離心后接種于獨(dú)立的培養(yǎng)體系中,培養(yǎng)條件為5% CO2、37℃,培養(yǎng)第7天換液,于第8天加入50 μl秋水仙素(200 μg/ml),培養(yǎng)30 min后獲取細(xì)胞,按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行G顯帶染色法顯帶。

2 結(jié)果

2.1 NT增厚胎兒核型異常類型 入組的128例NT增厚胎兒中共檢出異常22例(17.19%),其中21三體14例,21三體嵌合1例,性染色體異常3例,18三體2例,其他染色體異常2例。見表1。

表1 NT增厚胎兒核型異常類型及占比

2.2 不同 NT值胎兒核型異常情況比較 2.5 mm≤NT<3.5 mm76例,3.5 mm≤NT<4.5 mm23例,NT≥4.5 mm組15例,核型異常檢出率分別為10.53%、21.21%和36.84%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同 NT值胎兒核型異常情況比較 例(%)

2.3 不同指征胎兒核型異常情況比較 入組的128例NT增厚胎兒中單純NT增厚98例,NT增厚合并其他指征(包括血清學(xué)篩查異常、其他超聲異常、夫妻雙方染色體異常、不良孕產(chǎn)史)30例。2組核型異常檢出率分別為12.24%、33.33%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同指征胎兒核型異常情況比較 例(%)

2.4 核型聯(lián)合CNV-seq染色體異常結(jié)果分析 128例NT增厚胎兒均進(jìn)行羊水CNV-seq檢測(cè),25例(19.53%)檢測(cè)出可疑致病性或已知致病性CNVs。其中核型正常的NT增厚胎兒中有4例為可疑致病性或已知致病性CNVs,存在微缺失/微重復(fù)片段位置以及關(guān)鍵基因臨床表型,2例核型檢測(cè)出平衡易位、羅氏易位等,而CNV-seq未檢出。見表4、5。

表5 CNV-seq無法檢測(cè)羅氏易位、平衡易位等胎兒情況及隨訪結(jié)果

3 討論

產(chǎn)前篩查和診斷作為優(yōu)生優(yōu)育的重要手段,對(duì)于有效預(yù)防先天缺陷患兒出生具有重要意義。影像學(xué)和分子生物學(xué)是目前臨床上產(chǎn)前篩查胎兒染色體異常和結(jié)構(gòu)畸形的關(guān)鍵技術(shù)手段,孕11～13+6周的NT超聲測(cè)量即為早孕期篩查和評(píng)估胎兒染色體異常的重要指標(biāo)[7]。既往研究結(jié)果證實(shí),75%左右21三體綜合征胎兒伴有孕早期NT增厚[8]。但近年來有研究發(fā)現(xiàn)18三體綜合征、Turner綜合征等先天性缺陷性疾病的發(fā)生也與NT增厚存在密切聯(lián)系。本研究納入的128例產(chǎn)前超聲提示NT≥2.5 mm孕婦,G顯帶核型分析結(jié)果表明,21三體綜合征在胎兒染色體異常中的占比為10.94%,其他類型的染色體異常占比為6.25%,主要包括18三體綜合征、性染色體異常等。提示NT增厚不僅可導(dǎo)致胎兒出現(xiàn)21三體綜合征,也可能出現(xiàn)其他染色體異常。另外薛淑雅等[9,10]通過對(duì)NT增厚胎兒的染色體核型進(jìn)行分析,證實(shí)胎兒染色體異常檢出率與NT厚度之間存在顯著正相關(guān),即NT厚度越大,染色體異常檢出率風(fēng)險(xiǎn)明顯上升。本研究結(jié)果顯示,不同NT厚度組胎兒的核型異常檢出率差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且隨著NT厚度增加,染色體異常檢出率逐漸增高,與前人研究結(jié)果具有可比性。彭亞琴等[11]研究結(jié)果顯示相較于單純性NT增厚,當(dāng)其他產(chǎn)前異常產(chǎn)前診斷指征如高齡、不良生育史、夫妻雙方染色體異常以及血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)等與NT增厚同時(shí)合并存在時(shí),胎兒致病性染色體異常的檢出率將大大提高。本研究發(fā)現(xiàn)NT增厚合并其他指征的核型異常檢出率33.33%,明顯高于單純NT增厚(12.24%),表明NT增厚合并高齡、夫妻雙方染色體異常、不良孕產(chǎn)史等病例時(shí),可能增加核型異常風(fēng)險(xiǎn),提高致病性染色體異常檢出率,同時(shí)黎昱等[12]研究也證實(shí)NT 增厚合并其他異常的致病性染色體異常檢出率高于單純性NT增厚。

染色體微重復(fù)/微缺失綜合征是指患者存在染色體的微小片段重復(fù)或者缺失,導(dǎo)致正?；蚪M部分的片段拷貝數(shù)發(fā)生異常,進(jìn)而產(chǎn)生具有復(fù)雜臨床表現(xiàn)的遺傳性疾病[13,14]。該類疾病一般為散發(fā),且重復(fù)或者缺失的片段基本低于5 Mb,因此常規(guī)G顯帶核型分析檢測(cè)準(zhǔn)確率較低。CNV-seq技術(shù)可用于大片段缺失/重復(fù)、覆蓋全染色體非整倍體及全基因組的基因組拷貝數(shù)測(cè)序。特別是高通量CNV-seq可以對(duì)全基因組進(jìn)行均勻覆蓋,致病性CNVs檢出率可高達(dá)100%,有助于提高臨床意義未明的CNVs陽(yáng)性率[15]。魏友華等[16]采用核型分析及CNV-seq檢測(cè)分析NT增厚胎兒染色體,發(fā)現(xiàn)在核型分析基礎(chǔ)上l聯(lián)合CNV-seq法可多發(fā)現(xiàn)1.11%的明確致病性CNVs,降低核型分析時(shí)無法檢出的染色體微重復(fù)/微缺失綜合征,利于產(chǎn)前遺傳咨詢。本研究128例NT增厚胎兒中,傳統(tǒng)核型分析檢出22例核型異常(17.19%),而CNV-seq檢出24(18.75%)例已知致病性及可疑致病性CNVs,其中核型正常的NT增厚胎兒中有3例為可疑致病性或已知致病性CNVs,存在微缺失/微重復(fù)片段位置以及關(guān)鍵基因臨床表型。1例核型為46,XY,t(14;21)(q10;q10),+21的患者,CNV-seq檢測(cè)顯示47,XN,+21．(21)×3,46,XX,t(9;17)(q12;p11.2)的患者,CNV-seq并未檢測(cè)出平衡易位,提示為疑似致病,表明CNV-seq無法檢測(cè)平衡易位、羅氏易位,目前仍需以染色體核型分析作為金標(biāo)準(zhǔn)。

綜上所述,當(dāng)NT增厚特別是合并其他風(fēng)險(xiǎn)指征時(shí),胎兒發(fā)生染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)明顯升高。將G顯帶核型聯(lián)合CNV-seq分析應(yīng)用于NT增厚胎兒產(chǎn)前診斷,可以有效提高胎兒染色體異常檢出率和準(zhǔn)確率,減少染色體微缺失/微重復(fù)綜合征缺陷兒的出生,更有利于產(chǎn)前遺傳咨詢。