3733例雙胎無創產前篩查結果及其與年齡等相關因素的分析

屠豪炎，江 元，盧寨娥

寧波市婦女兒童醫院產科，浙江寧波 315012

染色體非整倍性是引起嬰兒出生缺陷、導致先天性殘疾甚至死亡的一個重要因素。根據2009年國家出生缺陷監測中心數據顯示，我國的出生缺陷患病率較世界平均水平高，達4%～6%[1]。近年來，隨著輔助生殖技術的不斷應用，高齡孕婦率增加，多胎發生率尤其是雙胎率明顯增加，從而導致相關并發癥的增加，數據表明雙胎的染色體非整倍性發生率較單胎高，其篩查也受諸多因素干擾[2-3]。傳統的產前血清學篩查效果雙胎不如單胎，其存在檢出率低及假陽性率高的問題[4]；而羊水穿刺雖是金標準，但流產、早產及宮內感染等風險高于單胎，是許多孕婦不能接受的。因此，需要一種高效、安全、無創的雙胎篩查方案。無創產前篩查技術(non-invasive prenatal testing，NIPT)已經在單胎妊娠中得到廣泛應用，對T21、18、13具有較高的準確性和靈敏度[5]。國際產前診斷及美國婦產科醫師學會初步通過了NIPT在雙胎妊娠的應用，我國雙胎妊娠產前篩查與診斷技術(2017)指出，有經驗的產前診斷機構，雙胎T21綜合征的篩查可以選擇NIPT，其檢出率目前可達93.7%以上，假陰性率為0.23%，而對于T18、13、性染色體及染色體微缺失/重復的數據有限，需要更多的研究[6-8]。本研究通過回顧性分析3733例NIPT檢測結果，初步探討NIPT在雙胎染色體異常中的臨床價值及其對年齡等相關因素的影響。

對象和方法

對象選取2018年1月至2022年12月在寧波市婦女兒童醫院接受NIPT檢查的雙胎孕婦3733例，所有孕婦均簽署知情同意書。納入標準：(1)12～26+6周在超聲提示下宮內雙胎孕婦；(2)所有受檢者均符合2016年《孕婦外周血胎兒游離DNA產前篩查與診斷技術規范》，在1年內未接受過異體輸血、細胞治療、器官移植等；(3)所有孕婦均自愿接受檢查。對所有NIPT提示高風險的孕婦均記錄羊水穿刺核型結果、超聲結果等。本研究獲寧波市婦女兒童醫院醫學倫理委員會批準(倫理審查編號：2016倫審字第5號)。

NIPT檢測采集孕12～26+6周雙胎孕婦外周血樣10 ml于EDTA抗凝管中，4℃保存，并在6 h內分離血漿，按照核酸提取試劑盒操作說明書從中提取游離DNA，通過末端修復、接頭連接、PCR擴增和文庫定量等，依托Ion Proton平臺，使用BioelectronSeq4000高通量測序儀進行高通量基因測序，測序結束后，用無創產前管理軟件分析數據計算Z值。結果采用Z值進行風險評分，正常區間(低風險)為-3

產前診斷經NIPT提示高風險的孕婦，建議通過羊水穿刺術進一步檢查，取20 ml羊水或1 ml臍帶血樣本對每例病例進行細胞培養和染色體核型分析，根據國際人類細胞遺傳學命名體系(ISCN2016)染色體核型描述及診斷，如發現染色體微缺失或微重復，建議行染色體核型分析加染色體微陣列。以上均經寧波市婦女兒童醫院產前診斷門診診斷及知情同意后操作。另部分孕婦至外院產前診斷中心行產前診斷。產后新生兒未見異常者為陰性。

隨訪對納入信息的所有孕婦均進行追蹤隨訪，寧波市婦女兒童醫院產檢和分娩孕婦經電子病歷系統查閱，外院產檢孕婦進行電話隨訪，隨訪內容有孕期超聲檢查、產前診斷結果、胎兒妊娠結局、出生缺陷等信息，隨訪至產后3個月。

統計學處理采用IBM SPSS 25.0軟件進行統計分析，計數資料以例數及百分數(%)表示，年齡、孕周等計量資料結果先確定是否符合正態分布，符合正態分布的計量資料用均數±標準差表示，非正態分布的計量資料用中位數(最大值～最小值)表示；組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗，雙側P<0.05為差異有統計學意義，其中多重組間比較采用Bonferroni法校正檢驗水準(本研究α校正值為0.0083)。

結 果

NIPT人群特征對2018年1月至2022年12月在寧波市婦女兒童醫院接受NIPT檢查的3733例雙胎孕婦進行統計分析，并按年齡、孕周、絨毛膜性及受孕類型進行分組歸納。其中年齡組分為<30歲、30～34歲、35～39歲及≥40歲組，孕周組分為≤13+6周、14～17+6周、18～21+6周及22～26+6周組，絨毛膜性組分為雙絨毛膜雙羊膜囊(dichorionic diamniotic，DCDA)、單絨毛膜雙羊膜囊(monochorionic diamniotic，MCDA)及單絨毛膜單羊膜囊(monochorionic monoamniotic，MCMA)組，受孕類型分為輔助妊娠及自然受孕組。結果顯示NIPT陰性<30歲1780例、30～34歲1591例、35～39歲284例、≥40歲7例，NIPT陽性<30歲30例、30～34歲23例、35～39歲9例、≥40歲9例；NIPT陰性≤13+6周1029例、14～17+6周2183例、18～21+6周387例、22～26+6周63例，NIPT陽性≤13+6周8例、14～17+6周39例、18～21+6周18例、22～26+6周6例；NIPT陰性DCDA 2348例、MCDA 1285例、MCMA 29例，NIPT陽性DCDA 55例、MCDA 16例、MCMA 0例；NIPT陰性輔助妊娠1893例、自然受孕1769例，NIPT陽性輔助妊娠40例、自然受孕31例。失訪53例均為NIPT陰性：其中年齡<30歲21例、30～34歲13例、35～39歲19例，孕周≤13+6周8例、14～17+6周21例、18～21+6周18例、22～26+6周6例，絨毛膜DCDA 32例、MCDA 11例、MCMA 10例，輔助生殖29例、自然受孕24例。納入NIPT高風險71例、低風險3609例。納入產婦的平均年齡為(29.5±4.1)歲，平均孕周為(15.3±2.2)周；雙胎妊娠大多數為DCDA，達64.38%；自然妊娠的孕婦占48.22%，因不孕而行輔助妊娠的孕婦占51.78%。

胎兒染色體高風險篩查結果納入統計的3680例孕婦中，NIPT提示高風險者共71例，包括13例T21高風險、19例T18高風險、5例T13高風險、18例性染色體異常及16例染色體微缺失/重復。50例孕婦接受羊水穿刺診斷，21例拒絕羊水穿刺。羊水穿刺提示29例異常，其中10例T21(8例DCDA、2例MCDA)，11例T18(9例DCDA、2例MCDA)，3例T13(均為DCDA)，3例性染色體異常(2例DCDA、1例MCDA)，2例染色體微缺失/微重復(均為MCDA)，21例未見異常(表1)。經隨訪，21例拒絕羊水穿刺的孕婦確診3例為T18(3例均為DCDA)，2例為T21(1例MCDA、1例DCDA)，所有低風險孕婦經隨訪確定新生兒健康。

表1 71例無創產前篩查技術高風險孕婦染色體異常篩查結果及妊娠結局

NIPT總體靈敏度為100%，特異度為98.99%，陽性預測值(positive predictive value，PPV)為47.89%(34/71)，其中T21、18、13的總PPV為78.38%(29/37)。其中T21的PPV最高，達92.30%，其次為T18，為73.68%，T13僅為60%；性染色體異常的PPV為16.67%，染色體微缺失/重復的PPV為12.50%。NIPT對T21、T18、T13、性染色體及微缺失/重復的靈敏度均為100%，特異度分別為99.97%、99.95%、99.95%、99.59%、99.64%，誤診率分別為0.03%、0.05%、0.05%、0.41%、0.36%，漏診率均為0。

NIPT結果與雙胎孕婦年齡及孕周的相關性根據年齡及孕周，將3733例雙胎孕婦分為≥40歲(16例)、35～39歲(274例)、30～34歲(1601例)及<30歲(1789例)4個年齡組以及≤13+6(1029例)、14～17+6(2201例)、18～21+6(387例)、22～26+6(63例)4個孕周組，初步探討不同年齡、孕周的靈敏度、特異度、陽性預測值、誤診率及漏診率。對于總染色體異常，在不同年齡段(≥40歲中真陽性數6例、假陽性數3例，35～39歲中真陽性數5例、假陽性數4例，30～34歲中真陽性數13例、假陽性數10例，<30歲中真陽性數10例、假陽性數20例)，NIPT在真陽性數的檢出上差異有統計學意義(P<0.001)，≥40歲組與其他3組比較差異均有統計學意義(Bonferroni校正，P均<0.001)，而35～39歲、30～34歲、<30歲組之間兩兩比較差異均無統計學意義(Bonferroni校正，P均>0.0083)；孕周方面(≤13+6周中真陽性數3例、假陽性數5例，14～17+6周中真陽性數20例、假陽性數19例，18～21+6周中真陽性數8例、假陽性數10例，22～26+6周中真陽性數3例、假陽性數3例)，在不同孕周階段中，NIPT在真陽性數的檢出上差異有統計學意義(P<0.001)，但14～17+6周與18～21+6周差異無統計學意義(Bonferroni校正，P=0.078)。NIPT在各年齡段的靈敏度均為100%，特異度依次為70.00%、98.51%、99.37%、98.88%，PPV依次為66.67%，55.56%，56.52%，33.33%，誤診率依次為30.00%、1.49%、0.63%、1.12%，漏診率均為0；在不同孕周的靈敏度均為100%，特異度依次為99.51%、99.13%、97.36%、95.00%，PPV依次為37.50%、51.28%、44.44%、50.00%，誤診率依次為0.49%、0.87%、2.64%、5.00%，漏診率均為0。單獨對不同年齡段T21、18、13的NIPT結果進行分析(≥40歲中真陽性數6例、假陽性數0例，35～39歲中真陽性數5例、假陽性數1例，30～34歲中真陽性數10例、假陽性數2例，<30歲中真陽性數8例、假陽性數5例)，結果顯示≥40歲組與其他3組比較差異均有統計學意義(Bonferroni校正，P均<0.001)，而35～39歲、30～34歲、<30歲組之間兩兩比較差異均無統計學意義(Bonferroni校正，P均>0.0083)，不同年齡段的靈敏度均為100%，特異度依次為100%、99.63%、99.87%、99.72%，PPV依次為100%、83.33%、83.33%、61.54%，誤診率依次為0、0.37%、0.17%、0.29%，漏診率均為0；單獨對不同孕周階段T21、18、13的NIPT結果進行分析(≤13+6周中真陽性數3例、假陽性數3例，14～17+6周中真陽性數18例、假陽性數1例，18～21+6周中真陽性數5例、假陽性數1例，22～26+6周中真陽性數3例、假陽性數3例)，4組不同孕周真陽性數的檢出差異有統計學意義(P=0.004)，其中≤13+6、14～17+6及18～21+6孕周之間兩兩比較差異均無統計學意義(Bonferroni校正，P均>0.0083)，各組靈敏度均為100%，特異度依次為99.70%、99.95%、99.74%、95.24%，PPV依次為50.00%、94.74%、83.33%、50.00%，誤診率依次為0.30%、0.05%、0.26%、4.76%，漏診率均為0。

NIPT對不同絨毛膜性染色體異常的初步分析結果71例高風險雙胎孕婦中，55例為DCDA雙胎(10例T21，9例真陽性；14例T18，12例真陽性；3例T13，均為真陽性；15例性染色體異常，2例真陽性；13例染色體微缺失/重復，無真陽性)，16例為MCDA雙胎(3例T21，均為真陽性；5例T18，2例真陽性；2例T13，無真陽性；3例性染色體異常，1例真陽性；3例染色體微缺失/重復，2例真陽性)。NIPT顯示DCDA和MCDA的染色體高風險率分別為2.32%和1.24%，但對真陽性數的檢出差異無統計學意義(P=0.256)。在DCDA雙胎組中，高風險最多的是性染色體異常，MCDA雙胎組中為T18，但在真陽性數上，T21和T18分別為兩組最多。DCDA雙胎篩查高風險孕婦平均年齡為(32.0±5.6)歲，平均孕周為(16.4±2.3)周，其中真陽性孕婦平均年齡為(33.5±4.9)歲，平均孕周為(16.7±3.0)周；MCDA雙胎篩查高風險組孕婦平均年齡為(30.3±6.0)歲，平均孕周為(16.7±3.4)周，其中真陽性孕婦平均年齡為(30.4±6.7)歲，平均孕周為(16.7±1.8)周。兩組年齡及孕周差異均無統計學意義(P均>0.05)。

NIPT對不同受孕類型染色體異常的初步分析結果71例高風險雙胎孕婦中，40例為輔助妊娠(10例T21，9例真陽性；11例T18，7例真陽性；3例T13，均為真陽性；5例性染色體異常，2例真陽性；11例染色體微缺失/重復，2例真陽性)，31例為自然受孕(3例T21，均為真陽性；8例T18，7例真陽性；2例T13，無真陽性；13例性染色體異常，1例真陽性；5例染色體微缺失/重復，無真陽性)。NIPT顯示輔助妊娠和自然妊娠的染色體高風險率分別為2.10%和1.80%，但對真陽性數的檢出差異無統計學意義(P=0.114)。在輔助妊娠雙胎組中，高風險最多的是T18及染色體微缺失/重復，其次是T21；自然受孕中高風險最多的是性染色體異常，其次是T18。但在真陽性數上，T21與T18均為兩組最多。輔助妊娠雙胎篩查高風險孕婦平均年齡為(32.4±5.3)歲，平均孕周為(16.5±2.5)周，其中真陽性孕婦平均年齡為(33.3±5.0)歲，平均孕周為(16.4±2.7)周；自然妊娠雙胎篩查高風險孕婦平均年齡為(30.6±6.1)歲，平均孕周為(16.5±2.7)周，其中真陽性孕婦平均年齡為(31.8±6.5)歲，平均孕周為(17.2±3.1)周。兩組年齡及孕周差異均無統計學意義(P均>0.05)。

討 論

近年來，NIPT在單胎中已被廣為研究，尤其是在T21、18、13的篩查中具有高靈敏度、高特異度及低假陽性率的特點，且美國醫學遺傳和基因組學會指出，NIPT能夠在不同年齡人群中替代傳統的非整倍體篩查方法[9-10]，但其在雙胎的檢測應用中缺乏大量研究。2012年Canick等[11]對25例雙胎進行了NIPT篩查，高風險中7例T21、1例T13靈敏度及特異度均為100%，無假陽性結果。2013年Lau等[12]及2017年Fosler等[13]分別對12、115例雙胎進行NIPT篩查，T21的靈敏度及特異度均為100%，均提示NIPT在雙胎中的準確性。此外，比較歷年國內已發表的研究，NIPT檢測雙胎T21、18、13的靈敏度分別為97.3%～100%、90.9%～100%、100%[14-16]。2019年薛淑文等[17]對625例雙胎行NIPT篩查，T21、18的檢出率分別為66.7%和100%，總檢出率為83.3%，陽性預測值為100%，假陽性率為0，首次檢測成功率97.92%，與同期單胎比較差異無統計學意義，提議將NIPT作為雙胎妊娠孕婦拒絕產前診斷時首選的胎兒染色體非整倍體篩查的方式。本研究顯示NIPT對雙胎孕婦的T21、18的靈敏度均為100%，PPV為92.3%、73.68%。本研究T13的靈敏度為100%，PPV僅為60%，這可能與T13常早期累及顱腦、顏面部、頸部、心臟等全身諸多部位異常相關，寧波市婦女兒童醫院產前診斷中心在納入NIPT檢查時，常規行胎兒B超檢查，部分異常情況已被超聲發現，直接行羊水穿刺而未行NIPT檢查。

染色體微缺失/微重復是除非整倍體異常的另一類致新生兒出生缺陷的因素，結合國內外文獻提示NIPT在單胎中對常染色體微缺失、微重復的檢測中有一定的可行性，但總體的PPV較低[18-20]，在雙胎中的研究更少有報道。陳邵寧等[21]對2473例雙胎研究顯示，31例高風險中14例為微缺失/微重復，其中8例經產前診斷只確診2例，PPV為25%；Cheng等[22]在1048例雙胎中發現13例高風險中微缺失1例，微重復2例，經產前診斷微缺失1例。本研究71例高風險中16例為微缺失/微重復，經產前診斷確診2例，靈敏度為100%，PPV為12.50%，較上述研究更低。結合以上研究，提示NIPT對雙胎兒染色體微缺失/微重復的陽性預測值較低，臨床上應用需謹慎。

絕大多數的性染色體非整倍體異常(sex chromosome aneuploidy，SCA)在孕期超聲檢查中不會有明顯表型異常，往往伴隨其他異常的篩查而偶然發現[23]。美國醫學遺傳和基因組學會指出NIPT可擴展至SCA中的篩查，且較多的研究顯示NIPT對檢測胎兒SCA具有不錯的潛能[9，23-25]。而在雙胎中，NIPT對SCA的篩查并不穩定。Yang等[26]報道432例雙胎NIPT檢測結果，性染色體方面僅1例為高風險，且產前診斷證實為假陽性，Cheng等[22]在1048例雙胎中發現7例SCA高風險，但產檢診斷證實均為假陽性。本研究納入的3733例雙胎產婦中，18例為SCA高風險，經產前診斷確診3例，15例假陽性，PPV僅16.67%。因此，NIPT對雙胎SCA的篩查效果并不令人滿意，但不失為一種警示作用。

在單胎中，NIPT對年齡因素的檢測能效已得到諸多證實，其檢出35歲以下孕婦胎兒非整倍體的靈敏度和特異度可達100%；對于高齡單胎產婦，有研究顯示NIPT對于T21、18、13同樣具有極低的漏診率[27-29]。因此，NIPT能夠顯著減少非高齡和高齡孕婦的侵入性產前診斷。然而，目前國內單就年齡因素對NIPT在雙胎中檢測能效的影響鮮有報道，僅李珊珊等[30]發現不同篩查年齡組孕婦外周游離DNA(cell-free DNA，cfDNA)濃度與單胎比較差異無統計學意義。本研究顯示NIPT在不同年齡段雙胎胎兒染色體異常的檢出上，≥40歲組與其他3組比較差異有統計學意義，其PPV達66.67%，但誤診率也較高，達30%，進一步對T21、18、13分析顯示，≥40歲組與其他3組比較差異有統計學意義，其PPV為100%，這可能與此次高齡(≥40歲)孕婦總數少相關，但提示NIPT在雙胎高齡(≥40歲)中有一定的檢出能效。此外，在T21、18、13中，NIPT在35～39歲、30～34歲、<30歲組之間對真陽性數的檢出上差異無統計學意義，各組PPV依次為83.33%、83.33%、61.54%，誤診率依次為0.37%、0.17%、0.29%，漏診率均為0，靈敏度均為100%，一定程度上提示在不同年齡段(<40歲)雙胎中，NIPT有相同的檢出能效，具有極低的誤診率和漏診率。由于本研究≥40歲及35～39歲組樣本量較少，存在一定的偶然性，臨床上還需進一步大樣本的研究來明確。

孕婦外周血中的游離cfDNA比例與孕周呈正相關，在雙胎中也不例外[31]。孕周過早可能會導致外周血中游離cfDNA含量不足，從而產生假陰性結果。本研究NIPT顯示總染色體異常在不同孕周組間差異有統計學意義，但14～17+6周與18～21+6周之間差異無統計學意義，提示NIPT檢查需要合適的孕周，具體結果為孕14～17+6周組的PPV最高(51.28%)，依次為孕22～25+6周(50.00%)、孕18～21+6周組(44.44%)。孕22～25+6周的PPV高于孕18～21+6周，可能是一部分陽性病例無法繼續妊娠或者早期超聲等發現已終止干預，導致22～25+6周受檢人數下降，從而影響PPV。單對T21、18、13異常檢出的分析中，孕14～17+6周組的PPV達94.74%，其次為18～21+6周(83.33%)，且發現≤13+6、14～17+6及18～21+6孕周之間差異無統計學意義，這可能與雙胎孕婦早期外周血中的游離cfDNA含量較同期單胎孕婦高相關。雖然本研究在孕周分組上未細分DCDA雙胎及MCDA雙胎，但發現孕14～17+6周及18～21+6周組的PPV值均較高，在一定程度上驗證了最新《雙胎妊娠產前篩查與診斷技術規范》中MCDA雙胎取樣時間為14～18周，DCDA雙胎取樣時間為16～22周。因此，在恰當的孕周行NIPT檢查，可以給患者更多的決策時間。

通過NIPT的篩查，本研究顯示輔助妊娠中DCDA雙胎的比率高于自然妊娠，染色體異常在DCDA雙胎為2.32%，高于MCDA雙胎的1.24%，但對真陽性數的檢出差異無統計學意義。同時，結果顯示T21、18是兩組中最常見的非整倍體，大部分異常結果發生在DCDA雙胎中的1個胎兒，這與之前的研究報道[16，31]一致。但多數染色體異常發生在DCDA雙胎中可能和本研究的總體樣本量少相關，多種因素無法統計分析，如人群中存在選擇偏倚，多數輔助受孕為DCDA雙胎。

目前，關于雙胎輔助妊娠中NIPT檢測效能的報道較少，部分研究顯示雙胎中T21的PPV在輔助妊娠中高于自然受孕，T18、T13及性染色體異常的PPV與自然妊娠相比差異無統計學意義[32-33]。本研究T21的PPV在輔助妊娠中略低于自然妊娠，但對T21的檢出上兩組比較差異無統計學意義；T13、性染色體及染色體微缺失/重復的PPV輔助妊娠中高于自然妊娠。NIPT對自然妊娠及輔助妊娠總染色體異常檢出方面差異無統計學意義，這與Yu等[31]的報道相一致。雖然本研究的染色體高風險病例較少，但仍提示NIPT在雙胎輔助妊娠具有一定的檢出效能，對輔助生殖類雙胎進行更大、更全面陽性樣本的臨床研究將是進一步的研究方向。

綜上，本研究顯示NIPT在雙胎中具有較高的準確性，對不同年齡、孕周都具有高敏感性和高特異性的優點，尤其是對T21、18、13。雖然NIPT對單絨雙胎及雙絨雙胎的染色體異常檢出效率差異無統計學意義，但染色體異常多發生于雙絨雙胎中。不論輔助妊娠還是自然受孕，都可行NIPT篩查，對T21異常的檢出率最高。因此，將NIPT作為雙胎妊娠孕婦篩查染色體異常的首選方式有一定的可行性，但廣泛應用還需大人群基數研究。