肺泡灌洗液結核桿菌RNA、T-SPOT在菌陰肺結核診斷中的應用

張帆 林健 林芬

肺結核是一種由結核分枝桿菌引起的慢性呼吸道傳染病，是全球公共衛生問題之一[1]。根據世界衛生組織的《結核病》報告，2019 年全球有1 000 萬人患有肺結核，其中150 萬人死亡。根據痰涂片和培養的結果，肺結核可分為菌陽性和菌陰性兩種。菌陰肺結核是指3次痰涂片及1次培養陰性的肺結核，其發生率占肺結核的30%～40%。菌陰肺結核的診斷主要依靠臨床表現、影像學和組織病理學，但這些方法存在局限性和不確定性，導致診斷困難和誤診率高[2]。因此，探討菌陰肺結核的診斷標準和方法，對于提高診斷準確性、降低傳播風險、指導合理治療具有重要意義。肺泡灌洗液是一種從肺泡中獲取的液體樣本，可以反映肺部炎癥和感染的情況。肺泡灌洗液可以檢測到結核分枝桿菌的RNA、培養、涂片和結核感染T 細胞斑點試驗（T cell spot test，T-SPOT）等指標，可能對菌陰肺結核的診斷有幫助。本文旨在探討肺泡灌洗液中結核桿菌RNA、X-pert、涂片檢查及T-SPOT 在菌陰肺結核診斷中的價值，為臨床提供參考依據。本研究的方法和結果均基于中華人民共和國衛生行業標準的《肺結核診斷》。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究選取2022 年7 月1 日—2022 年9 月26 日在某醫院呼吸科就診的診斷為肺結核患者202 例。根據痰涂片和培養的結果，分析菌陰肺結核患者的基本資料，其中涉及患者的性別、年齡、身體質量指數（body mass index，BMI）、吸煙史、飲酒史、接觸史等基線資料。其中診斷為菌陰肺結核病例134 例，其中男性75 例，女性59 例，年齡18 ～75 歲，平均（45.61±2.32）歲，BMI（21.46±3.40） kg/m2；41 例有吸煙史，93 例無吸煙史；36 例有飲酒史，98 例無飲酒史；22 例有接觸史，112 例無接觸史。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，同意參與本研究并簽署知情同意書。

納入標準：（1）有肺結核臨床癥狀，如咳嗽、咳痰、咯血、發熱、盜汗、消瘦等。（2）胸部X 線或CT 檢查有肺結核特征性改變，如空洞、纖維化、鈣化、粟粒結節等。排除標準：（1）入院后痰結核菌涂片陽性患者。（2）有免疫缺陷或使用免疫抑制劑等影響免疫功能的情況。（3）有嚴重的心、肝、腎等器官功能不全或血液系統疾病。（4）拒絕接受肺泡灌洗液檢查或無法獲取足夠的肺泡灌洗液樣本。（5）有其他肺部感染或腫瘤等并發癥。

1.2 方法

1.2.1 肺泡灌洗液檢查

所有患者在空腹、清醒狀態下，經纖維支氣管鏡插入病變部位，用生理鹽水（37 ℃）以20 ～40 mL/次，共100 ～200 mL 進行肺泡灌洗，回收率≥50%。將肺泡灌洗液用于涂片、培養、X-pert（X-pert MTB/RIF system）、X-pertR（X-pert MTB/RIF ultra）耐藥[3]、結核脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、結核RNA、菌種鑒定、位點檢出和位點突變、以及T-SPOT 檢測，即11 種檢測方法。

1.2.2 涂片檢查

將肺泡灌洗液離心后，取沉淀物制作玻片，進行抗酸染色和熒光染色，用顯微鏡觀察是否有結核分枝桿菌。每張玻片至少觀察100 個高倍視野，按照國際防治結核病和肺部疾病聯盟（The International Union Against Tuberculosis and Lung Disease，IUATLD）的標準進行評價[4]。

1.2.3 培養檢查

將肺泡灌洗液離心后，使用MGIT960 儀器，取沉淀物接種于Lowenstein-Jensen 培養基和BACTEC MGIT 960 液體培養系統中，分別在37 ℃下培養4 ～8 周和6 ～8 周，觀察是否有結核分枝桿菌生長。對于生長出的結核菌株，采用比例法進行培養耐藥試驗，測試異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素等藥物的敏感性。

1.2.4 X-pert 檢測

將肺泡灌洗液離心后，取沉淀物加入樣本試劑管中，振蕩混勻后放入賽沛儀器中，按照廠家說明書進行操作。該儀器可以同時檢測結核分枝桿菌的DNA 和利福平耐藥基因突變（rpoB 基因），結果在2 h 內出現。

1.2.5 X-pertR 耐藥檢測

將肺泡灌洗液離心后，取沉淀物加入樣本試劑管中，振蕩混勻后放入Gene X-pert MTB/RIF Ultra 儀器中（美國Cepheid 公司生產），按照廠家說明書進行操作。該儀器可以同時檢測結核分枝桿菌的DNA 和利福平耐藥基因突變（rpoB 基因），并且比X-pert 更敏感和特異，結果在80 min內出現。

1.2.6 結核DNA 檢測

將肺泡灌洗液離心后，使用ABI7500 儀器平臺取沉淀物提取DNA，采用實時熒光PCR 法擴增結核分枝桿菌特異性基因片段整合子序列6110（insertion sequence 6110，IS6110） 和16S 核 糖 體RNA（16S ribosomal RNA，16S rRNA），并用SYBR Green I 染料進行熒光定量。根據擴增曲線和閾值循環數（cycle threshold，Ct）判斷是否陽性。

1.2.7 結核RNA 檢測

將肺泡灌洗液離心后，取沉淀物提取RNA，采用逆轉錄實時熒光PCR 法擴增結核分枝桿菌特異性基因片段16S核糖體RNA（16S ribosomal RNA，16S rRNA），并用SYBR Green I 染料進行熒光定量。根據擴增曲線和閾值循環數（Ct值）判斷是否陽性。

1.2.8 菌種鑒定

對于培養陽性的結核菌株，在博奧晶典儀器平臺下，采用PCR- 限制性片段長度多態性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCRRFLP）法進行菌種鑒定。提取菌種的DNA，擴增hsp65基因，并用BstEII 酶切割產生不同長度的片段。將切割產物進行電泳分離，并與已知的參考菌株進行比較，確定菌種。

1.2.9 位點檢出

對于培養陽性的結核菌株，同樣使用博奧晶典儀器平臺，采用PCR-單鏈構象多態性（polymerase chain reactionsingle strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）法進行位點檢出。提取菌株的DNA，擴增katG、inhA、rpoB 等與耐藥相關的基因，并用變性凝膠電泳分離產生不同構象的單鏈DNA。將電泳圖像與已知的正常或突變型進行比較，確定是否有位點突變。

1.2.10 位點突變

對于位點檢出陽性的結核菌株，采用PCR- 直接測序法進行位點突變分析。提取菌株的DNA，擴增與位點檢出相同的基因，并用自動測序儀進行雙向測序。將測序結果與已知的正常或突變型進行比較，確定突變類型和位置。

1.2.11 T-SPOT 檢測

將血液離心后，取細胞懸液加入T-SPOT 試劑盒中（由英國Oxford Immunotec Ltd 生產），按照廠家說明書進行操作。該試劑盒可以檢測患者外周血單個核細胞對結核特異性抗原早期分泌抗原目標-6（early secretory antigenic target-6，ESAT-6）和培養濾液蛋白-10（culture filtrate protein-10，CFP-10）刺激后釋放的干擾素-γ 水平。根據斑點數判斷是否陽性。

1.3 觀察指標

本研究的主要評估指標為各種檢測方法計算出菌陰肺結核患者的陽性率、陽性預測值、陰性預測值；陽性率是指檢測出陽性結果的比例，反映了檢測方法的敏感性，即能夠發現患者的能力。陽性預測值是指陽性結果者中患者的比例，反映了檢測方法在特定人群中陽性結果的可信度，與患病率有關。陰性預測值是指陰性結果者中非患者的比例，反映了檢測方法在特定人群中陰性結果的可信度，也與患病率有關[5]。

1.4 統計學方法

采用SPSS 25.0 軟件進行數據處理和分析。單變量統計分析各種檢測方法的陽性率、陽性預測值、陰性預測值。

2 結果

不同的結核病檢測方法在不同指標上的表現存在很大的差異。比如，T-SPOT 方法的陽性率最高（82.8%），表明該方法最敏感，能夠檢測出大部分患者。同樣，其陽性預測值也最高（82.8%），說明在陽性結果者中患者的比例最高，也就是說假陽性率最低。這意味著T-SPOT 方法雖然能夠發現大多數患者，但也會漏診一些患者。其次，涂片方法的陽性率最低（11.9%），說明它最不敏感，只能檢測出少數患者。其他方法的陽性率、陽性預測值和陰性預測值都較低，說明它們在診斷方面的效果都不理想。因此，選擇合適的結核病檢測方法需要綜合考慮多個指標，并根據具體情況進行權衡，見表1。

表1 不同檢測方法的比較（%）

3 討論

肺泡灌洗液結核桿菌RNA、培養、涂片檢查及結核感染T-SPOT 是目前用于診斷菌陰肺結核的常用方法[6-7]。菌陰肺結核是指在臨床上有結核病癥狀和體征，但在痰涂片或培養中未能檢出結核分枝桿菌的患者[8]。菌陰肺結核的診斷難度較大，容易漏診或誤診，影響患者的治療效果和預后，也增加了結核病的傳播風險[9]。因此，探討肺泡灌洗液結核桿菌RNA、X-pert、涂片檢查及T-SPOT 在菌陰肺結核診斷中的價值具有重要的臨床意義和研究價值。

結果顯示，T-SPOT 方法是最能檢測菌陰肺結核患者的方法，其陽性率和陽性預測值都是最高的，但也有最高的假陰性率，可能會漏掉一些患者。涂片方法的陽性率和陽性預測值都是最低的，但也有最低的假陽性率，可能會多診斷一些患者。X-pert 方法和菌種鑒定方法的陽性率都比較中等，但其在識別患者方面稍微好一點，其陽性預測值和陰性預測值都比菌種鑒定方法高一點。其他方法在診斷方面都不太好，陽性率、陽性預測值和陰性預測值的值也驗證了這一點。這一結果與世衛組織的《結核病》報告中推薦的檢測方法相一致，也與國內外其他相關研究基本一致[10-12]，也顯示了本文方法在菌陰肺結核診斷中的創新性。如果要選擇一個檢測方法來指導臨床工作，建議選擇T-SPOT 方法或X-pert方法[13-14]，因為它們具有較高的陽性率和陽性預測值，能夠準確地識別出大部分患者，并且避免不必要的干預。還需要考慮其他因素，如檢測成本、可用性、時間等，進行綜合評定[15]。

未來階段的工作重點主要有以下幾點：（1）進一步優化肺泡灌洗液結核桿菌RNA 檢測法的操作流程和技術參數，提高其穩定性和可重復性。（2）進一步擴大樣本量，增加對照組和隨訪時間，評估肺泡灌洗液結核桿菌RNA 檢測法在不同類型和程度的菌陰肺結核患者中的應用價值和準確度。同時，也需要探討肺泡灌洗液結核桿菌RNA 檢測法與其他方法（如X-pert MTB/RIF、LAMP 等）的聯合應用效果，以提高菌陰肺結核診斷的敏感性和特異性。開展多中心、大樣本、前瞻性的臨床試驗，驗證肺泡灌洗液結核桿菌RNA 檢測法在不同人群和地區的適用性和準確性。（3）探索肺泡灌洗液結核桿菌RNA 檢測法在監測治療效果、預測復發風險、指導用藥方案等方面的作用和意義。以及探討肺泡灌洗液結核桿菌RNA 檢測法在耐藥結核分枝桿菌和位點突變分析方面的作用和意義。

綜上所述，本文探討了肺泡灌洗液結核桿菌RNA、X-pert、涂片檢查及T-SPOT 在菌陰肺結核診斷中的價值，發現T-SPOT 方法和X-pert 方法具有較高的陽性率和陽性預測值，能夠準確地識別出大部分患者，是較為可靠的診斷方法。本文的結果與最新的研究文獻基本一致，也顯示了本文方法在菌陰肺結核診斷中的創新性。但是，本文也存在一些局限性，如樣本量較小、沒有進行受試者工作特征曲線分析和成本效益評估等，需要在未來的工作中進行改進和完善。同時，也需要進一步探索肺泡灌洗液結核桿菌RNA 檢測法在監測治療效果、預測復發風險、指導用藥方案等方面的應用價值和意義，以及在耐藥結核分枝桿菌和位點突變分析方面的作用和意義。本文為菌陰肺結核的診斷提供了一種新的思路和方法，為臨床工作和科學研究提供了一定的參考和借鑒。