橡膠樹雜交F1代抗病種質(zhì)鑒選及其抗病性分析

李博勛 黃貴修 和麗崗 蔡吉苗 馮艷麗 余文才 劉忠亮

關(guān)鍵詞：橡膠樹；棒孢霉落葉病；雜交F1代；鑒選；抗病性

橡膠樹（Heveabrasiliensis）原產(chǎn)于南美洲亞馬遜河流域，是典型的多年生熱帶高大喬木，主要種植在22?0150N，100?7811E，海拔549m的熱帶地區(qū)，我國橡膠樹種植突破了傳統(tǒng)的植膠區(qū)，主要分布在海南省、云南省南部和廣東省雷州半島等區(qū)域[1]。橡膠樹棒孢霉落葉病是繼南美葉疫病之后的第二個威脅世界天然橡膠產(chǎn)業(yè)的重要葉部病害，在南亞、東南亞以及中非等植膠國的成齡膠園暴發(fā)流行，嚴重發(fā)生時可導致干膠產(chǎn)量損失20%～25%，并且種苗芽接成活率不足20%[2]。該病主要為害橡膠樹葉片、嫩梢、嫩枝，并形成最具代表性的“魚骨狀”病斑，其病原多主棒孢病菌（Corynesporacassiicola）釋放的寄主專化性毒素能延葉脈傳導，導致葉片大量脫落，只剩光禿禿的樹枝，嚴重影響膠樹的長勢和產(chǎn)量[3]。該病于2006年首次在我國報道發(fā)生[4]，目前已經(jīng)在云南、海南、廣東等植膠區(qū)的實生苗、幼齡膠樹及部分開割成齡膠樹上普遍發(fā)生，潛在威脅巨大[5]。國際上，對于棒孢霉落葉病的防治主要采取抗病種質(zhì)選育。20世紀80年代，斯里蘭卡遭受棒孢霉落葉病的為害，致使許多高產(chǎn)的橡膠品種（系）大面積停割和死亡，通過9年時間，該國選育出RRIC100、RRIC102、RRIC121、RRISL203、RRISL205、RRISL211等18個抗病品種（系），并逐漸替代當時主栽的感病品種（系），挽救了斯里蘭卡的天然橡膠產(chǎn)業(yè)。隨著棒孢霉落葉病在亞洲植膠國大面積暴發(fā)流行，馬來西亞篩選出PB86、PB213、RRIM712、RRIM628；泰國篩選出PB260、RRIC101、KRS156；印度尼西亞篩選出IRR100和IRR200，印度篩選出IAN873、GT1、IIRR208等一系列的品種（系）在田間都表現(xiàn)出較好的抗病性，并在一定程度上控制了病害所造成的產(chǎn)量損失[6-7]。之后由于多主棒孢病菌優(yōu)勢種群和生理小種的變異，一些表現(xiàn)為抗病的品種（系），在種植過程中也變得感病，許多國家也嘗試著采用化學防治和生物防治等措施來控制該病的發(fā)生與流行，但防治效果均不理想[8-10]。為此，對于橡膠樹這種多年生的高大喬木來說，抗病種質(zhì)資源的收集、評價與創(chuàng)制利用是防治該病最為經(jīng)濟有效且綠色環(huán)保的途徑。

長期以來，我國一直把高產(chǎn)、耐寒、抗風、幼態(tài)性狀良好、膠木兼優(yōu)等農(nóng)藝性狀作為橡膠樹育種的目標[11]，卻忽略了抗病種質(zhì)的鑒選與創(chuàng)制利用。先后引進和選育的近80個品種（系），以及生產(chǎn)上大面積種植的PR107、RRIM600、GT1、熱研7-33-97等主栽橡膠品種（系）對棒孢霉落葉病的抗病性明顯不足[12]。目前，我國收集保存有6185份橡膠樹種質(zhì)資源，其中野生種質(zhì)資源5710份[13]，如何利用這些豐富的種質(zhì)資源，在保證上述選育種目標的同時還兼具抗病性，將為優(yōu)質(zhì)橡膠樹選育以及抗病種質(zhì)的鑒選與創(chuàng)制利用提供有力支撐。2009—2013年，云南省熱帶作物科學研究所利用國內(nèi)外高產(chǎn)、速生的魏克漢種質(zhì)與1981IRRDB種質(zhì)作為父母本，采用人工授粉方式獲得28個組合的5616株雜交F1代群體（內(nèi)部資料未發(fā)表）。本研究從這28個組合中，根據(jù)父母本的抗病性水平，挑選了其中3個雜交組合云研277-5×IAN873、云研277-5×熱墾525、RRIC103×熱研8-79共821份F1代群體，采取初篩和復篩2輪評價，利用3個類群的多主棒孢病菌，對這些F1代群體進行抗病性早期鑒定，最終獲得5份F1代抗病新種質(zhì)。本研究旨在分析不同雜交組合選育出的橡膠樹新種質(zhì)的抗病性水平，以期獲得一批具有抗病性潛力的種質(zhì)材料，為橡膠樹抗病種質(zhì)的鑒選、早期抗病性診斷以及創(chuàng)制利用提供良好的種質(zhì)材料。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1橡膠樹種質(zhì)材料供試親本為橡膠樹優(yōu)良品種無性系IAN873、RRIC103、云研277-5、熱墾525、熱研8-79，橡膠樹雜交組合是由云南省熱帶作物科學研究所于2009—2011年春花期進行人工雜交授粉，同年8—9月采種并播種于沙床催芽，待小苗古銅期移栽至營養(yǎng)袋培育。供試的3個雜交組合及其F1代種質(zhì)材料均由云南省熱帶作物科學研究所和麗崗研究員團隊提供。親本信息、品種特性和雜交后代株數(shù)詳見表1。

1.1.2供試病原菌供試的多主棒孢病原菌為不同遺傳類群的代表性菌株HCcYN49（Cas5亞型）、CC01（Cas2亞型）和HCcJPZ01（Cas0亞型）均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所黃貴修研究團隊分離、鑒定和保存。

1.1.3培養(yǎng)基和試劑用于培養(yǎng)病原菌的PDA培養(yǎng)基和用于多主棒孢粗毒素發(fā)酵的Fries3號改良的培養(yǎng)液參照李博勛等[12]的研究方法配制。用于實施熒光定量分析的HbNPR1和HbGLP01基因引物（表2）均由深圳華大基因科技有限公司合成；PCR擴增反應所需的Buffer、TaqDNA聚合酶、dNTP、DNAMarker等購自天根生化科技（北京）有限公司。植物總RNA提取試劑盒（DP441）、FastQuantcDNA第一鏈合成試劑盒（KR106）、SYBRGreenSuperReal熒光定量預混試劑（FP205）均購自天根生化（北京）科技有限公司。過氧化物酶（POD）測試盒（ml092949）、超氧化物歧化酶（SOD）測試盒（mlsh0386）均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。其他化學試劑、藥品等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4儀器設(shè)備Bio-RadT100型梯度PCR儀，美國伯樂公司；UVIFireReader凝膠成像系統(tǒng)，英國UVItec公司；ABI實時熒光定量PCR儀7500型，美國ABI公司。

1.2方法

1.2.1橡膠樹F1代種質(zhì)抗病性評價本研究采用病原菌菌餅接種、粗毒素生物萎蔫和田間活體接種3種方法，以及抗病性方案設(shè)計、評價方法和病情分級標準均參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T3195—2018《熱帶作物種質(zhì)資源抗病蟲鑒定技術(shù)規(guī)程橡膠樹棒孢霉落葉病》[18]，抗病性評價分級標準參見表3。

1.2.2防御酶活性測定為分析抗、感F1代種質(zhì)防御酶活性的變化情況，選取淡綠期的抗、感種質(zhì)葉片，采用濃度為1×106個孢子/mL的HCcYN-49菌株孢子懸浮液噴霧接種到橡膠樹葉片背面，每個種質(zhì)接種3片復葉，每片復葉為1個重復，以接種無菌水的作為空白對照。分別于接種后0、12、24、48、72h取樣。過氧化物酶（peroxidase，POD）和超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）提取方法及注意事項參照試劑盒說明書。

1.2.3RNA提取及反轉(zhuǎn)錄參照RNA提取試劑盒說明書，對抗、感橡膠葉片的總RNA進行提取，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，紫外分光光度計下測定其260、280nm處的吸光值，確保RNA樣品的純度。參照FastQuantcDNA第一鏈合成試劑盒說明書對RNA進行反轉(zhuǎn)錄第一鏈。

1.2.4實時熒光定量分析參照SYBRGreenSuperReal熒光定量試劑盒說明書，以組成型表達基因18srRNA做為內(nèi)參基因，分析HbNPR1和HbGLP01基因在橡膠樹抗、感F1代葉片受多主棒孢病菌（HCcYN49）接種不同時間段（0、12、24、48、72h）的差異表達情況。每個樣品均重復3次，在ABI7500實時PCR儀上進行，采用2–ΔΔCT法計算分析。2–ΔΔCT＝2–[（CtE-CtF）-（CtA-CtB）]=2（CtF-CtB）-（CtE-CtA），其中CtA為處理前待測基因Ct值；CtB為處理前參照基因Ct值；CtE為處理后待測基因Ct值；CtF為處理后參照基因Ct值。

1.3數(shù)據(jù)處理

橡膠樹雜交F1代群體的抗病性評價數(shù)據(jù)采用WPSOfficeExcel軟件統(tǒng)計病斑直徑和萎蔫指數(shù)，采用SPSSStatistics20軟件中的Kolmogorov-Smirmovtest進行變量分布形態(tài)檢測與分析。實時熒光定量的數(shù)據(jù)利用SPSSStatistics20軟件中的單因素方差分析（One-wayANOVA）和Duncans多重比較進行分析。

2結(jié)果與分析

2.1橡膠樹3個雜交組合F1代群體的抗病性評價

基于前期對我國橡膠樹多主棒孢病菌遺傳類群的劃分依據(jù)[19]，先選用國內(nèi)橡膠樹多主棒孢優(yōu)勢種群Cas5亞型的代表性菌株HCcYN49對3個雜交組合的821份F1代群體進行抗病性評價，并對平均病斑直徑進行了正態(tài)分布檢驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，親本的抗病性水平依次表現(xiàn)為：IAN873>云研277-5>RRIC103>熱研8-79>熱墾525，對于父母本均表現(xiàn)出較高抗病水平的雜交組合IAN873×云研277-5，其268份F1代群體中抗病的植株數(shù)占87.68%，高抗植株70份，顯著高于其他2個雜交組合的后代群體，群體的平均抗病級次為中抗（MR）（表4）。雜交組合IAN873×云研277-5F1代群體中病斑直徑最大值為1.33cm，最小值為0.11cm，平均值0.68cm，變異系數(shù)38.23%（表5），抗病性呈現(xiàn)正偏態(tài)分布（圖1、圖2），說明該雜交組合的F1代群體表現(xiàn)出較高抗病性，群體樣本趨于抗病遺傳趨勢。

雜交組合RRIC103×熱研8-79的210份F1代群體中抗病植株樹占56.19%，高抗植株7份，群體平均抗病級次為輕感（S）（表4）。F1代群體中病斑直徑最大值為2.30cm，最小值為0.33cm，平均值1.02cm，變異系數(shù)32.35%（表5、圖3），群體的抗病性符合標準正態(tài)分布（圖4、圖5），總體分布趨勢及平均抗病級次在3個雜交組合中最平穩(wěn)，在一定程度上代表了總體的抗病期望值，說明當群體數(shù)量足夠大時，其抗病分布應符合正態(tài)分布。

雜交組合云研277-5×熱墾525的343份F1代群體中抗病植株數(shù)占20.69%，高抗植株6份，群體平均抗病級次為輕感（S）（表4），F(xiàn)1代群體中病斑直徑最大值為2.23cm，最小值為0.40cm，平均值1.29cm，變異系數(shù)28.68%（表5），群體的抗病性同樣符合正態(tài)分布（圖6、圖7），該組合的F1代群體可作為候選抗病種質(zhì)進入到無性系的高級系比。

2.2候選抗病F1代種質(zhì)的鑒定

橡膠樹雜交F1代種質(zhì)早期抗病性鑒定是根據(jù)目標性狀評價篩選出抗病性較好的優(yōu)良單株，再將優(yōu)良單株繁殖成無性系進入高一級系比試驗。因此，根據(jù)3個雜交組合共821份F1代群體的抗病性評價結(jié)果，選擇符合正態(tài)分布的RRIC103×熱研8-793和云研277-5×熱墾525兩個雜交組合中病斑直徑小于對照IAN873的32份優(yōu)良單株為候選抗病F1代種質(zhì)，并將其進行芽接，每個單株編號芽接不少于10株，共獲得297株F1代無性系種苗（表6）。利用多主棒孢病菌3個亞型的代表性菌株HCcYN49（Cas5亞型）、CC01（Cas2亞型）和HCcJPZ01（Cas0亞型），致病力強弱依次為：HCcYN49>CC01>HCcJPZ01，對32份候選F1代無性系種苗進行抗病性復篩。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雜交組合RRIC103×熱研8-79中的265、129、134三個F1代單株（表7），以及雜交組合云研277-5×熱墾525中的3162、3528兩個F1代單株（表8）不管是采用粗毒素生物萎蔫法還是田間活體接種法，在3個亞型多主棒孢病菌的接種下均表現(xiàn)出較好的抗病性水平。其中265和129這2個F1代種質(zhì)在田間活體接種后，其病斑出現(xiàn)的時間較晚，病情指數(shù)也顯著低于其他種質(zhì)（表7）。在這些F1代種質(zhì)中，對3個亞型多主棒孢的抗病性也存在明顯差異，如167和3262等種質(zhì)表現(xiàn)出對Cas2亞型的高度感病性，對Cas0亞型較為免疫；而125和3303等種質(zhì)表現(xiàn)出對Cas5亞型的高度感病性，不同的種質(zhì)對不同亞型的病原菌敏感性不同（表7、表8）。

2.3抗病F1代種質(zhì)的抗病關(guān)聯(lián)性分析

2.3.1防御酶活性測定已有研究表明，POD、SOD等酶活作用能迅速降低體內(nèi)活性氧積累給植物帶來的損傷，從而提高植物對病原菌的防御能力[20]。為了進一步分析復篩結(jié)果得到的5個高抗F1代種質(zhì)其防御酶活性變化與病原菌侵染之間的關(guān)系，本研究對265、129、134、3162、3528五個抗病F1代種質(zhì)和對照種質(zhì)PR107的POD和SOD活性變化進行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5個F1代抗病種質(zhì)以及對照品種PR107在多主棒孢病菌（HCcYN49）接種后均能引起POD和SOD防御酶活性的升高，在接種24h時POD防御酶活性達到峰值，134種質(zhì)的峰值最高，48h后呈逐漸下降的趨勢，相對于對照PR107，5個抗病F1代種質(zhì)的防御酶活性普遍較高，72h后活性整體下降（圖8），而SOD防御酶活性的峰值在5個抗病種質(zhì)中均不相同，129和134在接種12h時SOD活性達到峰值，265、3162和3528在接種24h達到峰值，48h后整體均呈下降趨勢，72h又有所升高（圖9）。通過對POD和SOD兩個防御酶活性的變化可以看出，5個抗病F1代種質(zhì)受病原菌侵染后，均能誘導POD和SOD活性顯著升高，并在接種不同時間段，通過防御酶活性的變化來抵御病原菌的進一步侵染。

2.3.2抗病相關(guān)基因表達分析前期研究發(fā)現(xiàn)HbNPR1和HbGLP01基因是橡膠樹棒孢霉落葉病的2個抗病相關(guān)基因，在多主棒孢病菌侵染后能引起其表達量的明顯變化，并且這2個基因在橡膠樹抗、感種質(zhì)中的表達模式存在顯著差異[21-22]。因此，分析這2個基因在5個抗病F1代種質(zhì)中的表達情況，將從基因水平明確種質(zhì)的抗病關(guān)聯(lián)性。從結(jié)果可以看出，當多主棒孢病菌（HCcYN49）接種后6h就能誘導HbNPR1基因表達量的升高，并且在24h時表達量均達到峰值，265和3162兩個種質(zhì)中HbNPR1基因的誘導表達量要高于其他幾個種質(zhì)，在48h時有所下降，72h時表達量降至最低，與對照PR107相比，5個抗病F1代種質(zhì)的相對表達量都高于對照，表達模式基本一致（圖10）。對于HbGLP01基因，265、129、134在多主棒孢病菌接種12h時表達量就達到峰值，而134、3162、3528三種質(zhì)以及對照PR107在24h達到峰值，48h之后表達量均下降，5個F1代種質(zhì)中HbGLP01基因的表達模式存在一定差異（圖11）。研究表明，NPR1是植物中廣譜抗性的基因，參與水楊酸抗病信號轉(zhuǎn)導途徑，與TGA轉(zhuǎn)錄因子相互作用，引起下游抗病基因的表達[23]。而GLP是一類重要的結(jié)構(gòu)性蛋白，具有草酸氧化酶（OXO）和SOD活性，能抑制活性氧的產(chǎn)生，增強細胞壁的穩(wěn)定性，在病原菌侵染早期起到關(guān)鍵作用[24-25]。

3討論

橡膠樹棒孢霉落葉病是主要植膠國家橡膠樹上暴發(fā)流行最為嚴重的病害之一，也是國際天然橡膠產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的主要生物限制因素[26]。國際上，對該病的防治主要采用抗病育種的方式，而抗病品種的鑒選和創(chuàng)制利用是抗病種質(zhì)選育的關(guān)鍵。

橡膠樹是一種基因型高度雜合且育種周期長達30年的熱帶高大喬木，雜交育種是橡膠樹最常規(guī)也是選育優(yōu)良橡膠樹種質(zhì)常用的方法[27]，從具有優(yōu)良性狀的親本雜交組合中選擇F1代優(yōu)良單株，并進行無性系的繁育，是橡膠樹優(yōu)良種質(zhì)創(chuàng)制的基本策略[28]。近年來，通過雜交育種選育出如速生高產(chǎn)的熱墾525和云研277-5[16]、抗寒性狀良好的湛試327-13[29]等優(yōu)良品種（系），都較好地遺傳了親本的性狀特征，反映了親本雜交的有效性，縮短了育種進程。因此，建立橡膠樹棒孢霉落葉病的早期抗病性鑒定技術(shù)體系，通過對雜交組合F1代群體早期抗病性的評價以及抗病表型特征的觀察，從中選出抗病性較好的優(yōu)良F1代單株并進行無性系的繁育，將有助于獲得抗病的無性系種質(zhì)材料，對橡膠樹優(yōu)良品種（系）的選育具有重要意義。

抗病性鑒定在實施過程中的方案設(shè)計、評價方法、病情分級標準以及接種的病原菌對抗病性評價結(jié)果都至關(guān)重要。本研究嚴格按照農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T3195—2018《熱帶作物種質(zhì)資源抗病蟲鑒定技術(shù)規(guī)程橡膠樹棒孢霉落葉病》實施，選用的病原菌是來自3個亞型的多主棒孢病菌代表性菌株。由于多主棒孢病菌與橡膠樹上的其他真菌性病害的病原在致病機制上存在明顯差異，它是一種死體營養(yǎng)型的病原真菌，在侵染初期能產(chǎn)生寄主專化性毒素cassiicolin，該物質(zhì)是導致橡膠葉片壞死的重要致病因子，根據(jù)cassiicolin的毒素類型，將多主棒孢病菌劃分成了不同的亞型（Cas1～Cas6），我國存在Cas0、Cas2和Cas5三種亞型，其中Cas5亞型為橡膠樹上的優(yōu)勢種群[30]。不同的橡膠種質(zhì)對這3個亞型多棒孢病菌的抗病性存在明顯差異[19]。為了客觀全面地分析橡膠樹雜交F1群體的抗病性水平，進而選出抗病性較好的優(yōu)良F1代種質(zhì)，本研究采取2輪抗病性評價，第一輪評價是利用多主棒孢病菌優(yōu)勢種群Cas5亞型的代表性菌株，采用離體菌餅接種法，對3個雜交組合共821份F1代種質(zhì)進行大規(guī)模的抗病性評價，從中獲得32份候選抗病F1代單株，并對每個單株進行基部芽接，獲得F1代無性系種苗；第二輪評價是利用Cas0、Cas2和Cas5三個亞型多主棒孢病菌的代表性菌株，分別采用粗毒素生物萎蔫和田間活體接種2種方法對候選的32份F1代無性系種苗進行抗病性復篩，經(jīng)過2輪評價、不同亞型的多主棒孢病菌接種以及多種評價方法，最終獲得5份抗病性較好的F1代種質(zhì)，并從防御酶水平和抗病相關(guān)基因的角度進一步驗證了5份F1代種質(zhì)的抗病關(guān)聯(lián)性。通過上述的抗病性鑒定技術(shù)，得到的抗病性評價結(jié)果以及獲得的F1代抗病種質(zhì)都具有較強的可靠性，客觀反映出3個雜交組合F1代群體的抗病性。該技術(shù)體系能為后續(xù)橡膠樹種質(zhì)的選育提供較好的技術(shù)方案，評價結(jié)果也能為橡膠樹優(yōu)良品種的選育與創(chuàng)制利用提供較好的種質(zhì)材料。

寄主植物與病原微生物相互作用的過程中會產(chǎn)生一系列生理生化反應，特別是引起酚類代謝相關(guān)酶活性增強，如SOD、POD、CAT以及PAL等，都是參與寄主防御反應的關(guān)鍵因子，而超氧化物歧化酶和過氧化物酶是細胞內(nèi)減輕活性氧傷害的保護酶[31]。本研究中，當多主棒孢病菌侵染初期，在5個抗病F1代種質(zhì)中就能引起超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性的升高，在一定程度上說明，多主棒孢病菌侵染能誘導這2個酶的活性進而增強寄主的抗病性，但這并不是在所有的種質(zhì)中都有明顯的相關(guān)性，因為代謝過程中的酶活性變化是根據(jù)寄主植物和病原微生物互作體系的不同而不同[31]，比如同一個品種與不同病原生理小種（或種群）之間的互作體系，以及不同品種與同一個病原生理小種（或種群）之間的互作體系，都會導致病原菌在侵染過程中防御酶活性的變化。此外，植物的抗病性還與病原微生物關(guān)聯(lián)分子模式引發(fā)的免疫反應（PTI）以及由病原效應子引發(fā)的免疫反應（ETI）密切相關(guān)，并且是由水楊酸、乙烯、茉莉酸等植物激素介導的抗病性[32]。橡膠樹HbNPR1基因在水楊酸抗病信號轉(zhuǎn)導途徑中起到了十分關(guān)鍵的作用，它能激活下游防御反應基因的表達，正向調(diào)控寄主的抗病性[21]。HbGLP01是一種類萌發(fā)素蛋白，在植物基礎(chǔ)抗性方面發(fā)揮著重要作用，具有OXO和SOD活性，能催化草酸氧化，增強植物細胞壁結(jié)構(gòu)，觸發(fā)過氧化脂質(zhì)反應和乙烯的合成[22]。本研究中這2個基因在參與橡膠樹與多主棒孢病菌相互作用初期都發(fā)揮著重要作用，在不同抗性水平F1代種質(zhì)中的表達量明顯不同，具有作為橡膠樹棒孢霉落葉病抗病性早期分子鑒定靶標基因的潛力。