以外種皮珠孔組織為外植體的胡椒體細胞胚再生研究

丁雅雯 代金福 岑怡 范睿 伍寶朵 郝朝運 胡麗松

關鍵詞：胡椒；外植體滅菌；愈傷誘導；體細胞胚胎發生

胡椒（PipernigrumL.）是胡椒科（Piperaceae）胡椒屬（Piper）多年生常綠藤本植物[1]，原產于印度西高止山脈（印度南部西海岸的馬拉巴爾地區，現屬喀拉拉邦），是世界重要的熱帶香辛料作物之一，有“香料之王”的美譽。在醫學工業中胡椒被用作健胃劑、解熱劑和支氣管粘膜刺激劑等。在食品工業被用作抗氧化劑、防腐劑和保鮮劑等[2-3]。據統計，2019年世界胡椒收獲面積達55.3萬hm2，總產量達43.3萬t。我國胡椒主要分布在海南、云南、廣東等省，種植面積超過3萬hm2，年產量達3.6萬t，面積和產量均位居世界第五。其中，海南是我國的胡椒主產區，種植面積和產量約占全國80%[4-5]。近年來，隨著我國人民生活水平的不斷提高和飲食結構的變化，胡椒消費量還將大幅增加。市場需求的不斷擴大給胡椒產業提供了廣闊的發展前景。種苗繁育是產業推廣的重要環節，目前胡椒良種繁殖以傳統的扦插為主，該方法具有種苗優良性狀穩定的優點，但它對苗圃規劃、母株選擇、苗期培育等環節有著嚴格的要求，成本較高，且無法滿足產業快速推進需求[6-7]。因此，基于體細胞再生的高通量育苗技術是產業快速推進的迫切需求。

植物組織培養，又稱為植物離體再生，一般的過程主要是離體的植物組織，在適宜的培養條件下，體細胞通過脫分化形成愈傷組織，愈傷組織進一步分化成體細胞胚，然后體細胞胚經歷類似合子胚的發育過程，最終再生成完整植株，基于體細胞再生的種苗發育技術能夠極大地保留種苗的優良性狀。同時，在室內人工環境下進行種苗繁育，可避免遭受天氣因素的干擾，生長狀態相對一致，利于集中管理，降低成本。體細胞組培再生是種苗高通量、規模化、商業化生產應用最廣泛的技術。例如，MATHEWS等[8]報道，以胡椒實生苗的各部位組織為外植體，僅苗端可以叢生芽方式增殖，但其他部位組織只能產生愈傷組織，而不能再生植株；BHAT等[9]以同為胡椒屬的蔞葉（P.betleL.）和蓽拔（P.longumL.）的各種外植體成功地培養出新植株，但對胡椒則只能在節環組織上產生不定芽，其他外植體只能誘導形成愈傷組織而無器官發生；劉進平等[10]以印尼大葉種胡椒的莖尖、合子胚、胚軸片段和子葉片段等為外植體進行了系統的組培再生研究。結果發現盡管采取了75%酒精、1%升汞和20g/L次氯酸鈉組合的滅菌手段，僅成熟的種子可以建立無菌培養。在此基礎上，以無菌種子苗芽尖為外植體建立了胡椒叢生芽誘導技術，由于后代變異、童期長、再生效率等問題該技術沒有在產業上推廣應用[11-13]。印度香料研究所用成熟的胡椒種子為外植體，在改良型無生長素的SchenkandHildebrandt（SH）培養基上暗培養，誘導出愈傷組織，進而分化出新的植株。盡管該研究提供了胡椒體細胞再生成功的技術方案，但從研究結果來看，并沒有明確外植體是種子萌發出的胚狀體，還是外種皮珠孔組織[14]。前人的研究從外植體選擇、滅菌方法及培養條件等方面為胡椒體細胞再生研究提供了重要的參考。本研究以熱引1號胡椒為研究對象，利用酒精梯度表面滅菌結合0.1%氯化汞對胡椒果實進行處理，通過無菌種子萌發獲得外種皮外植體；利用對不同的植物生長調節劑種類和濃度配比，篩選出適宜的愈傷誘導培養基、體胚發生和生根壯苗培養條件，為胡椒組培苗的離體快繁技術提供理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料為我國主栽品種熱引1號（P.nigrumc.v.Reyin-1）胡椒，材料種植于中國熱帶農業科學院香料飲料研究所內的農業農村部萬寧胡椒種質資源圃。

1.2方法

1.2.1外植體消毒滅菌與接種利用酒精和0.1%氯化汞設置不同條件組合對胡椒果實進行滅菌處理。處理1：0.1%氯化汞對外果皮直接滅菌8～10min，無菌水沖洗3～5次后去除果皮獲得無菌種子；處理2：75%酒精對外果皮滅菌45s，無菌水清洗3～5次，去除果皮后用75%酒精對種子滅菌45s，無菌水清洗3～5次獲得無菌種子；處理3：75%酒精表面消毒45s，無菌水清洗3～5次，去除果皮后用75%酒精對種子消毒滅菌45s，無菌水清洗3～5次，0.1%氯化汞浸泡消毒6～10min，無菌水清洗3～5次后獲得無菌種子。滅菌后的種子，接種到萌發培養基上進行無菌培養，2周后統計污染率。種子萌發培養基選用MS培養基為基本培養基，添加1.5%蔗糖、0.25%活性炭和0.25%植物凝膠（表1）。種子材料接種時，每瓶培養基中接種3～4粒，29℃、黑暗條件下培養20～30d，可獲得外種皮。

1.2.2愈傷組織及體細胞誘導將無菌外種皮接種在愈傷組織誘導培養基上，每瓶培養基接種3～5粒，每個組合接種6～8瓶，重復3次。每月繼代轉接1次，繼代培養2次之后，統計愈傷組織誘導率愈傷誘導率=（愈傷組織總數-死亡愈傷組織種殼數）/接種外種皮總數×100%。挑選狀態一致的愈傷組織轉接在原培養基上，繼續繼代轉接，2代之后，統計胚性愈傷組織分化率。胚性愈傷組織分化率=分化出胚性愈傷組織的外植體總數/（愈傷組織總數-死亡愈傷組織總數）×100%。愈傷組織誘導和分化培養基均選用MS培養基為基本培養基，除添加1.5%蔗糖和0.25%植物凝膠外，還附加了2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D，0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20mg/L）、3-吲哚丁酸（IBA，0.25、0.50、1.00、2.00、4.00mg/L）和6-糠基氨基嘌呤（KT，0.075、0.150、0.300、0.600、1.200、2.400、4.800mg/L）3種植物生長調節劑，具體培養基配方如表1所示，3種植物生長調節劑組合出12種實驗組，未添加任何植物生長調節劑的MS培養基為對照組。胡椒愈傷組織誘導、增殖和分化培養所使用的培養基均未添加活性炭，誘導培養過程均在27℃，黑暗條件下進行。

愈傷每月繼代培養1次，繼代3次后。統計出間接體細胞胚胎誘導率，間接體胚發生誘導率=（誘導出體細胞胚的愈傷組織團數）/胚性愈傷總數×100%。發現有體胚長出時，及時轉移至光下培養。體細胞胚胎誘導培養基具體成分如表1所示。待胚性愈傷分化出球形胚后，轉接至MS培養基上，每月繼代轉接1次，記錄體胚狀態變化，直至分化出子葉胚，將誘導出的子葉胚轉接在體胚繼代培養基上，進而使其分化成完整植株。胡椒體胚繼代培養基的組成成分和種子萌發培養基相同（表1），每瓶培養基中接種4粒子葉胚，接種50瓶。體細胞胚轉接后排放于培養溫度27℃，光照周期12h/d，光照強度2000lx的條件下進行培養。記錄體胚狀態變化，胚胎被認為在長出明顯的主根和子葉后才叫發芽。

1.2.3壯苗培養將子葉胚繼代在體胚繼代培養基上，待幼苗長出2片以上新葉，苗高達3cm以上，繼代在壯苗培養基上進行生根壯苗。胡椒壯苗培養基選用1/2MS培養基為基本培養基，添加1.5%蔗糖、0.25%活性炭和0.25%植物凝膠。每瓶培養基接種1～2株幼苗，接種100瓶。排放于培養溫度29℃，光周期12h/d，光照強度2000lx的條件下進行培養。

2結果與分析

2.1外植體滅菌

以充分成熟、紅潤、飽滿、無病蟲害的果實為試驗材料（圖1），設置3種方式進行外植體滅菌處理，具體設置見材料方法。接種在不含植物生長調節劑的MS培養基中，放置于黑暗條件下培養2周統計污染率。污染率控制在10%以內。

在黑暗條件下培養約3周，種胚開始萌發，再經過1個月左右的培養，獲得一棵含兩片子葉和一粒種殼的胡椒實生幼苗。無菌實生幼苗再經過10～30d的培養，外種皮從子葉上脫落，獲得無菌外種皮作為植物組織培養的外植體材料（圖1C）。

2.2愈傷組織誘導

以外種皮為外植體開展愈傷組織誘導研究，以MS培養基為對照和基礎培養基，設置3種植物生長調節劑濃度組合并記錄愈傷誘導效果（表2）。外種皮經誘導培養后在珠孔組織處可見愈傷，生長正常的愈傷形態如圖2A、圖2B所示。統計結果發現，與IBA相比，2，4-D更益于誘導胡椒愈傷組織，不同濃度的2，4-D與KT植物生長調節劑組合均能促進胚性愈傷組織的分化，隨著濃度的升高，愈傷組織誘導率呈上升趨勢，愈傷最高誘導率達97.62%（表2）。繼代1個月后，試驗發現不同濃度的IBA和KT植物生長調節劑組合培養的愈傷組織逐漸死亡，IBA誘導活性不足，因此IBA不適宜作為胚性愈傷分化的植物生長調節劑。

不同濃度2，4-D和KT植物生長調節劑組合培養的愈傷組織經過2個月的繼代培養，2，4-D濃度為1.6mg/L，KT濃度為2.4mg/L時，部分愈傷組織轉化為增殖型愈傷（圖2），增殖生長量大，繼代轉接2周后，增大到3倍以上，1個月后，便布滿整個培養瓶，多呈乳白色，質地疏松，半透明狀，表面附著白色粉狀物或結晶體，卻無法分化為胚性愈傷組織。

當2，4-D濃度為0.8mg/L，KT濃度為1.200mg/L時，出現灰白色或灰褐色，團粒結構，半透明狀與淺黃色，顆粒狀，松散的胚性愈傷組織（圖2C、圖2D）。胚性愈傷分化率可達58.18%（表2）。

2.3體細胞胚胎誘導及體細胞分化

胚性愈傷經過約3周的培養，轉化為白色，結構松散，顆粒狀的體細胞胚，出現大量球形胚，少數為心形胚和魚雷形胚（圖3A）。試驗結果表明，在相對較低濃度的2，4-D（0.05、0.10mg/L）和KT（0.075、0.150mg/L）組合下，胡椒愈傷無法誘導出胚狀體，當2，4-D濃度為0.40mg/L，KT濃度為0.600mg/L時，體胚誘導率最高，為13.33%（表3）。將誘導出的球形體細胞胚（圖3A）繼代轉接在含0.40mg/L2，4-D和0.600mg/L的KTMS培養基上，經過1周左右的時間，轉化為心形胚（圖3B），3周后出現魚雷形體胚和子葉胚（圖3C、圖3D）。將子葉胚單獨轉接于體細胞胚繼代培養基上，繼帶培養約1個月，待子葉胚生長至約2cm，頂部分化出兩片綠色小葉后（圖3E、圖3F）可進行后續生根誘導培養。

2.4生根誘導與煉苗培養

待子葉完全長成后，將幼苗轉接在1/2MS培養基，添加1.5%蔗糖，0.25%活性炭和0.25%植物凝膠進行生根誘導培養。培養1個月后，葉片寬大，綠色加深，有新葉長出，2片對生新葉間長有芽點，并可見新誘導的白色根系，組培苗生長迅速，可生長至5～7cm（圖4A、圖4B）。待組培苗葉片轉為深綠色，有光澤，葉脈清晰，主蔓出現莖節，莖粗達0.9cm，根系布滿培養瓶底部（圖4C、圖4D）后，將組培苗移至室外培養基質中進行煉苗培養。培養基質采用草炭土、珍珠巖、蛭石混合物，比例為1∶1∶1，溫室中遮蔭培養2周后獲得組培苗（圖4E、圖4F）。

3討論

現有的文獻中有關胡椒體胚發生的研究較少，基于體細胞再生組培苗繁育技術仍有很多細節需完善。前人研究表明，胡椒體胚發生，與基因型、外植體生理狀態、培養基種類、植物生長調節劑種類、培養條件等諸多因素決定[15]。其中，外植體滅菌是開展組培繁育的第一步。劉進平等[10]用大田胡椒的芽、單節莖段、葉片、幼嫩花絮等材料進行外植體消毒滅菌，污染率均為100%，發現僅有成熟的胡椒種子可以建立無菌培養，但污染率仍然高達30%～60%。陳雄庭等[16]以胡椒主蔓節間切斷為外植體，其污染率在45%以上。印度香料研究所的研究人員報道了以胡椒種子胚為外植體，通過體細胞再生途徑獲得胡椒組培苗的方法[17]。但文章中并未明確外植體是種子萌發的胚狀體還是外種皮珠孔組織。本研究以成熟胡椒種子的外種皮作為外植體，通過酒精和升汞復合式滅菌處理，有效地降低了胡椒外植體污染問題，污染率控制在10%以內，建立了胡椒外植體高效的滅菌方式。同時將種子萌發的胚狀體和外種皮分離后培養，明確了外種皮的珠孔組織是適宜胡椒組培再生外植體。

愈傷組織的誘導分化效率和減少褐變是影響胡椒組培成功的關鍵。劉進平[18]研究發現，絕大多數胡椒愈傷組織在后續繼代培養中會逐漸褐化直至變黑死亡，即使加入質量分數10%PVP或0.3%活性炭也未能阻止愈傷褐變發生。本研究探究了添加植物生長調節劑組合對體胚誘導的影響，結果表明，2，4-D和KT組合是最佳的誘導植物生長調節劑組合，在2，4-D濃度為0.80mg/L和KT濃度為1.200mg/L時能促進胚性愈傷的誘導。在2，4-D濃度為0.40mg/L，KT濃度為0.600mg/L時，體胚分化率最高，為13.33%。同時發現體胚分化的過程中有次生胚發生，從胚軸下部根莖交接部位發生一叢新的次級胚胎，可實現體胚循環再生[18-20]。該次生體細胞胚胎起源于初生體細胞胚的根莖處，或是原始體細胞胚附著的胚性愈傷組織，組織發生增殖，從而產生大量次生體細胞胚胚團。為實現胚胎發生，也可以通過適當調節植物生長調節劑種類和濃度配比，或培養基中其他的有效成分等方式來實現。本研究以建立胡椒組培苗繁育技術為目標，系統研究了從外植體滅菌、愈傷誘導、體胚分化到室外煉苗的過程中的關鍵技術，并最終獲得組培苗，研究結果為胡椒高通量種苗繁育提供了全面的技術參考，具有重要的應用價值。