循環(huán)腫瘤細(xì)胞與循環(huán)腫瘤微栓在鼻咽癌中的表達(dá)及其臨床意義

周龍清，喻國(guó)凍，張 瑜

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，貴州 貴陽(yáng) 550004）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）是指原發(fā)于鼻咽部黏膜上皮的惡性腫瘤，多發(fā)生于鼻咽頂壁和內(nèi)側(cè)，尤其是咽隱窩，其發(fā)生率主要與病毒感染、遺傳、環(huán)境等因素有關(guān)，是耳鼻喉科頭頸腫瘤疾病中常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。多數(shù)NPC 患者以頸部出現(xiàn)腫塊為首發(fā)癥狀，由于NPC 早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已進(jìn)入進(jìn)展期或晚期。目前，EB 病毒血清抗體標(biāo)志物與血漿EB 病毒DNA（EBV-DNA）檢測(cè)均可用于NPC 的早期篩查，但其特異度較低，且影像學(xué)檢查也存在一定局限性[1]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）是一種新興的腫瘤特異性生物標(biāo)志物，是指由腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞，在胃癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤的診斷、治療及預(yù)后監(jiān)測(cè)中逐漸被臨床應(yīng)用和推廣[2]。研究指出，部分CTCs 可逃離機(jī)體免疫識(shí)別或藥物治療，在體內(nèi)尋找合適的微環(huán)境，形成“種子”在遠(yuǎn)端組織器官或原發(fā)組織種植生長(zhǎng)，導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)[3]。循環(huán)腫瘤微栓（CTM）是指多個(gè)CTCs 同類聚集或與其他種類細(xì)胞聚集形成的細(xì)胞團(tuán)，在血液中，CTM 會(huì)減緩血流速度，可成為血液中凝血酶形成的平臺(tái)，形成血栓栓塞[4]。相比單個(gè)形式存在的CTCs，CTM 更易避免腫瘤細(xì)胞凋亡，且更易發(fā)生免疫逃逸，生存力更強(qiáng)，放化療耐受性更好，轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)更高[5]。目前CTCs 與CTM 在NPC 患者中的臨床研究報(bào)道較少。因此，本研究旨在探討CTCs 與CTM 在NPC 中的表達(dá)及其臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2020 年8 月至2021 年8 月貴州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的122 例疑似NPC 患者的臨床資料，按病理學(xué)檢查結(jié)果的不同分為鼻咽部慢性炎癥組（30 例）與NPC 組（92 例）。鼻咽部慢性炎癥組患者中男性15 例，女性15 例；年齡18～63 歲，平均（46.56±5.86）歲。 NPC 組患者中男性48 例，女性44 例；年齡22～75 歲，平均（48.52±7.79）歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照《實(shí)用耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)》[6]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)且經(jīng)常規(guī)病理檢查確診；②未接受相關(guān)化療與靶向治療等抗腫瘤治療；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并免疫疾系統(tǒng)疾??；②進(jìn)行放化療和（或）生物靶向治療；③長(zhǎng)期使用非甾體類抗炎類藥物。本研究經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 病理學(xué)檢測(cè)和分型 取所有患者組織樣本，均使用10%福爾馬林進(jìn)行固定并石蠟包埋切片后，經(jīng)病理科診斷疾病類型，并進(jìn)行病理分型。

1.2.2 外周血CTCs 與CTM 的檢測(cè) 采用CTC-Biopsy?系統(tǒng)檢測(cè)所有患者外周血CTCs 與CTM 情況，采集所有患者外周靜脈血約8 mL，其中5 mL 立即置于抗凝真空采血管并輕柔顛倒混勻8 次以避免凝血，采用3 mL 0.2%的多聚甲醛緩沖液進(jìn)行稀釋，室溫下靜置10 min 后經(jīng)直徑為8 μm 的圓孔膜過(guò)濾，分離并富集CTCs，用Diff-Quick染色富集到的CTCs，風(fēng)干并封片。處理樣本要求：血液樣本需在2 h 內(nèi)完成檢測(cè)，若不能在2 h 內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，則需豎直靜置于4 °C 冰箱保存，保存時(shí)間不能超過(guò)24 h，處理前至少在室溫環(huán)境復(fù)溫30 min。 CTCs 判定標(biāo)準(zhǔn)[7]：細(xì)胞核不規(guī)則，呈現(xiàn)桿狀、分葉狀、馬蹄形狀、腎形、卵圓形狀；核質(zhì)比大于0.8；核直徑大于15 μm；核仁突出、深染且著色不均勻；核膜增厚出現(xiàn)凹陷或皺褶，核膜呈鋸齒狀；細(xì)胞核染色質(zhì)邊移或巨大核仁、異常核分裂。CTM 判定標(biāo)準(zhǔn)：3 個(gè)及3 個(gè)以上的CTCs 成團(tuán)[7]。所有患者CTCs、CTM 結(jié)果的判定均由3 名資深細(xì)胞病理學(xué)家在不了解患者臨床資料和病理診斷的情況下獨(dú)立評(píng)估和判讀。

1.2.3 NPC 患者EBV 感染情況 將1.2.2 中采集的剩余3 mL 外周靜脈血采用熒光定量聚合酶分析法檢測(cè)NPC 患者EBV-DNA 感染情況，以拷貝數(shù)＞500 拷貝/mL 計(jì)為陽(yáng)性[8]。

1.3 觀察指標(biāo)①比較兩組患者CTCs 陽(yáng)性率與CTM 陽(yáng)性率。②比較NPC 組CTCs、CTM 陽(yáng)性和陰性患者的臨床特征，收集所有患者性別、年齡、病理類型、T 分期、N 分期、臨床分期、EBV-DNA，并進(jìn)行分析。T 分期標(biāo)準(zhǔn)：TX為原發(fā)腫瘤無(wú)法評(píng)價(jià)；T0為無(wú)原發(fā)腫瘤存在證據(jù)，包含頸部淋巴結(jié)EBV 陽(yáng)性；T1為腫瘤局限于鼻咽部，或侵犯口咽和（或）鼻腔；T2為腫瘤侵犯咽旁間隙，和（或）鄰近軟組織（包括翼內(nèi)肌、翼外肌、椎前肌）；T3為腫瘤侵犯顱底、頸椎、翼狀結(jié)構(gòu)，和（或）鼻旁竇；T4為腫瘤顱內(nèi)侵犯，侵犯顱神經(jīng)、下咽部、眼眶、腮腺和（或）翼外肌側(cè)緣軟組織浸潤(rùn)。N 分期標(biāo)準(zhǔn)：NX 為區(qū)域淋巴結(jié)無(wú)法評(píng)價(jià)；N0無(wú)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；N1為單側(cè)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，和（或）單側(cè)、雙側(cè)咽后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移灶最大徑≤ 6 cm，在環(huán)狀軟骨下緣以上；N2為雙側(cè)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移灶最大徑≤ 6 cm，在環(huán)狀軟骨下緣以上；N3為單側(cè)或雙側(cè)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移灶最大徑＞6 cm，和（或）侵犯超過(guò)環(huán)狀軟骨下緣[8]。③相關(guān)性。采用Spearman 相關(guān)系數(shù)法分析NPC 患者CTCs、CTM 陽(yáng)性率與N 分期、EBV-DNA的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以[ 例(%)]表示，采用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman相關(guān)系數(shù)法分析NPC 患者CTCs、CTM 陽(yáng)性率與N 分期、EBV-DNA 的相關(guān)性。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者CTCs 和CTM 的表達(dá)差異NPC 患者 CTCs 染色可見(jiàn)核型異常，胞核呈分葉狀，見(jiàn)圖1， CTCs陽(yáng)性率67.39%（62/92），高于鼻咽部慢性炎癥組中CTCs陽(yáng)性率為0.00%（0/30），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=41.109，P＜0.05）。 NPC 患者CTM 染色可見(jiàn)存在3 個(gè)和3 個(gè)以上CTC 構(gòu)成的小細(xì)胞團(tuán)，見(jiàn)圖2，CTM 陽(yáng)性率為56.52%（52/92），高于鼻咽部慢性炎癥組中CTM 陽(yáng)性率0.00%（0/30），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=29.553，P＜0.05）。

圖1 NPC 患者CTCs（40×）

圖2 NPC 患者CTM（40×）

2.2 NPC 組CTCs 陽(yáng)性和陰性患者臨床特征分析NPC組患者中， CTCs 陽(yáng)性患者N2～N3期占比高于CTCs 陰性，EBV-DNA 陽(yáng)性患者占比高于CTCs 陰性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）； NPC CTCs 陽(yáng)性和陰性患者在性別、年齡、病理類型、T 分期、臨床分期方面比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 NPC 組CTCs 陽(yáng)性和陰性患者臨床特征分析[ 例(%)]

2.3 NPC 組CTM 陽(yáng)性和陰性患者臨床特征分析NPC組患者中，CTM 陽(yáng)性患者N2～N3期占比高于CTCs 陰性，EBV-DNA 陽(yáng)性患者占比高于CTCs 陰性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；NPC CTM 陽(yáng)性和陰性患者在性別、年齡、病理類型、T 分期、臨床分期方面比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 NPC 組CTM 陽(yáng)性和陰性患者臨床特征分析[ 例(%)]

2.4 相關(guān)性經(jīng)Spearman 相關(guān)性分析顯示，NPC 患者CTCs 陽(yáng)性與N 分期、EBV-DNA 陽(yáng)性均呈正相關(guān)（r=0.259、0.232）；NPC 患者CTM 陽(yáng)性與N 分期、EBV-DNA 陽(yáng)性均呈正相關(guān)（r=0.247、0.337），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 NPC 患者CTCs、CTM 陽(yáng)性率與N 分期、EBV-DNA 的相關(guān)性分析

3 討論

NPC 是一種對(duì)放射敏感性的腫瘤，由于其解剖位置特殊，早期缺乏特異性癥狀與有效的診斷方法，從而不易被診斷。早診斷、早治療是降低NPC 患者病死率、提高生存率的關(guān)鍵。傳統(tǒng)腫瘤疾病主要通過(guò)組織活檢和影像學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行診斷。影像學(xué)檢查只能發(fā)現(xiàn)直徑＞5 mm 的腫瘤，對(duì)微小瘤體診斷的準(zhǔn)確率較低[9]。在腫瘤的形成、發(fā)展過(guò)程中，部分腫瘤細(xì)胞由原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進(jìn)入外周血液，因此，外周血CTCs 的檢測(cè)可有效用于體外早期診斷，與傳統(tǒng)組織病理活檢相比，CTCs 檢測(cè)具有無(wú)創(chuàng)、便捷等優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于腫瘤疾病的診斷與患者的預(yù)后評(píng)估[10]。

CTCs 在NPC 患者疾病進(jìn)展過(guò)程的各個(gè)階段表達(dá)不同，因此檢測(cè)外周血中的CTCs 對(duì)鼻咽癌的早期篩查與診斷均具有積極作用[11]。CTCs 具有不同的細(xì)胞表型，包括上皮細(xì)胞型CTCs、上皮與間質(zhì)細(xì)胞混合型CTCs 和間質(zhì)細(xì)胞型CTCs，細(xì)胞表型可有效反映腫瘤細(xì)胞的惡性程度，其中間質(zhì)細(xì)胞型CTCs 較其他表型CTCs 具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力[12]。CTCs 以不同形態(tài)存在于外周血，3 個(gè)及3 個(gè)以上CTCs 構(gòu)成的細(xì)胞簇稱為CTM，在惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移中具有重要作用，且CTM 比CTC 更具侵襲性、轉(zhuǎn)移潛能及對(duì)凋亡的抵抗力[13]。本研究結(jié)果顯示，鼻咽部慢性炎癥患者外周血液中均未檢測(cè)到CTCs 與CTM，NPC 患者CTCs 陽(yáng)性率為67.39%，CTM 陽(yáng)性率為56.52%，與吳君心等[14]研究結(jié)果一致。

本研究進(jìn)一步對(duì)患者的臨床特征資料分析，結(jié)果顯示，NPC 患者中，CTCs、CTM 陽(yáng)性患者N2～N3期占比高于陰性患者，EBV-DNA 陽(yáng)性患者占比高于陰性患者，提示NPC 患者外周血中CTCs、CTM 陽(yáng)性均與患者N 分期、EBV-DNA 密切相關(guān)，NPC 患者中N 分期越高且EBV-DNA陽(yáng)性的患者有較高的CTCs 和CTM 陽(yáng)性率。T、N 分期是影響NPC 患者治療的重要因素，目前臨床主要通過(guò)影像學(xué)技術(shù)對(duì)NPC 患者診斷與T、N 分期進(jìn)行判定，但影像學(xué)的遲滯性和不穩(wěn)定性導(dǎo)致不能對(duì)NPC 的療效及時(shí)評(píng)估[15]。CTCs 檢測(cè)在NPC 患者的診斷與臨床分期中具有一定優(yōu)勢(shì)，可避免組織病理學(xué)和影像學(xué)檢測(cè)的局限性，同時(shí)能反映腫瘤整體異質(zhì)性的特征，尤其是對(duì)于已發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者[16]。腫瘤在無(wú)淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)，可在外周血液循環(huán)中檢測(cè)到CTCs，因其從原發(fā)灶脫落，通過(guò)侵襲、遷移和入侵血管等方式進(jìn)入血液循環(huán)，極易通過(guò)血液循環(huán)而轉(zhuǎn)移到全身其他器官，因而可通過(guò)檢測(cè)外周血中CTCs 了解患者病情惡化、轉(zhuǎn)移情況[17]。

在NPC 的發(fā)生發(fā)展中，CTCs 和EB 病毒的活化狀態(tài)受環(huán)境因素的影響，且放化療等抗腫瘤治療也將影響CTCs與EB 病毒的相互作用。EB 病毒對(duì)NPC 患者的診斷、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的檢測(cè)具有重要意義，外周血中CTCs 數(shù)量與EB病毒的載量呈正相關(guān)，EB 病毒的負(fù)荷越大，外周血中檢測(cè)出的CTCs 數(shù)量則越多[18]。本研究中，經(jīng)Spearman 相關(guān)性分析顯示，NPC 患者CTCs 陽(yáng)性率與N 分期、EBV-DNA陽(yáng)性均呈正相關(guān)（r=0.259、0.232）；NPC 患者CTM 陽(yáng)性率與N 分期、EBV-DNA 陽(yáng)性均呈正相關(guān)（r=0.247、0.337），說(shuō)明NPC 患者與EB 病毒感染高度相關(guān)，外周血中CTM陽(yáng)性，則腫瘤惡化、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的可能性較高。

綜上，NPC 患者外周血中CTCs 陽(yáng)性與N 分期及EBV-DNA 密切相關(guān)，CTM 陽(yáng)性與N 分期、EBV-DNA 密切相關(guān)，CTCs 和CTM 可作為NPC 早期診斷和預(yù)后的輔助評(píng)價(jià)指標(biāo)。