大口黑鱸殺魚愛德華氏菌的分離鑒定及耐藥性分析

郭文杰，韓銳，許為鎮，李言偉，但學明

（華南農業大學海洋學院，廣東 廣州 510665）

大口黑鱸（Micropterus salmoides）俗名加州鱸魚，肉質堅實，味道鮮美，無肌間刺，已被市場廣泛接受，成為了養殖量增長速度最快的水產品之一。2020 年我國大口黑鱸的養殖產量已達16 萬余噸[2]，其中廣東省的養殖量占全國的75%，池塘養殖面積超過2 666.67 hm2，主要集中在佛山市順德區和南海區，成為了佛山市水產養殖的支柱種類，形成了苗種、飼料、養殖、加工流通一體化較為完善的產業鏈。

殺魚愛德華氏菌（Edwardsiella piscicida）是胞內寄生的革蘭氏陰性菌，可溶血，靠周生鞭毛運動[3]。它能感染多種海、淡水魚類，包括大菱鲆（Scophthalmus maximus）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）和斑點叉尾（Ictalurus punctatus）[4，5]等，是對水產危害巨大的致病菌。

隨著大口黑鱸養殖規模和養殖密度不斷擴增，疾病危害也日趨嚴重。目前對大口黑鱸養殖造成危害的常見病原菌包括柱狀黃桿菌（Flavobacterium cloumnare）、遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）以及嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）等，這些病原菌通常在每年3—4 月份水溫上升到24 ℃以上就開始大量繁殖，如果水環境惡化或魚體免疫力下降[6]，就會侵染魚體發病。抗生素的過度使用以及配伍不合理[7]，不但起不到治療作用，更會引起環境耐藥性和抗生素殘留等問題[8]。2022 年3 月下旬，廣東珠三角地區的大口黑鱸大規模死亡，特別是佛山市南海區沙頭鎮和九江鎮發病最嚴重，死亡率最高可達50%，且有向周圍養殖區域漫延的趨勢，患病魚主要臨床癥狀表現為腹部膨大，嚴重腹水和內臟缺血。為揭示大口黑鱸死亡原因，本文在佛山市南海區沙頭鎮9 口魚塘采集瀕死病魚共42 個病樣，進行病理分析、病原分離與鑒定、病原菌毒力和耐藥性檢測等實驗，以期為該病的診斷和防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

2022 年3 月16 日—21 日在佛山市南海區沙頭鎮采集的患病瀕死的大口黑鱸體長25～35 cm，典型的臨床癥狀為腹部膨大和內臟缺血。

血平板、BHI 腦心浸液培養基、革蘭氏染色試劑盒和細菌生化鑒定試劑盒均購于廣東環凱微生物科技有限公司，藥敏紙片購于杭州微生物試劑有限公司，Taq DNA 聚合酶、dNTP 購自TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 病理組織切片觀察

取具有典型臨床癥狀病魚的肝、脾、腎用波恩氏液固定24 h，然后進行常規石蠟切片和HE 染色，對病魚組織進行病理學分析。

1.2.2 細菌的分離、純化和鑒定

取具有典型臨床癥狀的病魚進行拍照記錄分析。解剖刀在酒精燈外焰燒紅刀口后貼到內臟表面，消除表面細菌，然后用接種環輕輕插入肝脾腎內部，待接種環表面浸潤內臟組織液后拔出，在血平板上按照肝、脾、腎分區域進行平板劃線。分離完畢后將血平板倒置于28 ℃恒溫培養箱。培養48～72 h，觀察平板生長結果。挑選形態一致的菌落至BHI固體培養基劃線培養兩代，獲得純化的菌株。將純化后的菌株在液體培養基中擴大培養后，加入40%甘油溶液中-80 ℃保存備用。

以過夜培養的菌液為模板，細菌16S rDNA 通用擴增序列為引物（27F:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，1492R: 5-TACGGYTACCTTGTTACGA CTT-3'）進行PCR 擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后,送華大基因公司測序。將目標菌株的16S rRNA 基因序列在NCBI 數據庫中應用BLAST 軟件進行同源性分析，用Clustal W 軟件將NCBI 數據庫中獲得的相似度較高的序列和其他種屬的序列進行多序列匹配,采用MEGA 6.0 中的鄰接法構建系統發育樹，并通過自舉分析檢測置信度，自舉數據集為1 000 次。

按照廣東環凱微生物科技有限公司細菌生化鑒定試劑盒說明書，將適量新鮮菌液懸液加入20種生化鑒定管中，37 ℃靜置，24 h 內觀察生化鑒定管中變化。

1.2.3 動物回歸試驗

試驗魚體長（25±8）cm、體質量（400±124）g，每組10 尾魚，每尾魚注射200 μL 菌液。根據吸光值和平板計數結果，制成濃度為108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL 的菌懸液進行腹腔注射攻毒，以PBS 為對照組。水溫在26 ℃，持續充氣，連續觀察10 d，記錄死亡數量，并分離死魚肝脾腎的細菌。

1.2.4 藥敏試驗

選用6 種水產養殖中常用的抗菌藥物：四環素、多西環素、氟苯尼考、恩諾沙星、利福平和阿莫西林。純化后的優勢菌用無菌水配制成菌懸液后，吸取100 μL 菌懸液（經平板計數CFU 為5.5x108）均勻涂布在BHI 固體培養基上，然后用無菌鑷子將藥敏紙片輕輕貼合在培養基表面，分布均勻，貼合后將平板倒置，在28 ℃的恒溫培養箱中培養24 h后，測量藥敏圈直徑。根據產品說明書提供的判斷標準，得出各藥物的敏感程度。

2 結果與分析

2.1 病魚的臨床癥狀

發病池塘水溫23 ℃，發病魚多為體長30～40 cm 的一齡魚，其中懷卵的雌魚占比約70%。病魚體表無明顯出血或潰爛，腹部明顯膨大，泄殖孔紅腫。將魚體垂直提起，可見少量腹水從泄殖孔中流出（圖1）。剖檢發現，鰓缺血，肝臟腫大、呈土黃色，脾臟呈暗黑色，后腎明顯腫脹，腹腔中存在大量腹水，腹水中有雞蛋清樣凝結物（圖2）。

圖1 患病大口黑鱸體表癥狀（黃色圈為腹部明顯膨大，紅色箭頭為泄殖孔紅腫）Fig.1 Body surface symptoms of diseased largemouth bass [the abdomen is obviously enlarged（yellow circle）and the genital pore is red in color and swollen（red arrows）]

圖2 病魚鰓（紅色箭頭）和肝臟缺血、腫大（黃色箭頭），腹水嚴重，含雞蛋清樣凝聚物（黃色圈）Fig.2 Gills（red arrows）and liver（yellow arrows）ischemia of the diseased fish,liver enlargement,severe ascites,containing egg white condensates（yellow circle）

2.2 病理變化

病魚肝組織壞死，細胞質中有嗜酸性玻璃樣小滴，部分肝臟細胞出現空泡變性和脂肪變性。腎小球增生，毛細血管擴張，腎小囊腔變窄，腎小管上皮細胞壞死，腎間組織炎性細胞浸潤。脾臟細胞萎縮變性，部分組織壞死（圖3）。

圖3 病理組織切片Fig.3 Pathological tissue section

2.3 細菌的分離和純化

大口黑鱸的肝、脾、腎組織在血平板劃線培養48 h 后，可見乳白色表面光滑的單菌落，單菌落直徑2～3 mm，γ 溶血。從血平板挑取優勢單菌落至BHI 固體培養基中純化培養，36 h 后在平板上形成形態一致的單菌落（圖4）。純化細菌經革蘭氏染色后呈陰性，短桿狀，其大小約0.5 μm×2 μm，可運動。

圖4 用血平板分離的菌落和用BHI 固體培養基純化的菌落Fig.4 Colonies isolated by blood plate and purified by BHI medium

2.4 分離菌的分子生物學鑒定

把分離菌16s rRNA 的測序結果導入NCBI 的GenBank 數據庫中進行BLAST 分析，發現該菌與殺魚愛德華氏菌（Edwardsiella piscicida）有100%的同源性。使用MEGA 6.0 軟件采用鄰接法構建的系統發育樹顯示（圖5），該菌株（S1）與殺魚愛德華氏菌聚為一支。

圖5 基于16S rRNA 基因序列的系統進化發育樹Fig.5 Phylogenetic development tree based on 16S rRNA gene sequence

2.5 分離菌的生化鑒定

菌株S1 在生化鑒定實驗中，與精氨酸脫羧、鳥氨酸脫羧、葡萄糖發酵、檸檬酸鹽以及H2S 的反應中呈現陽性，其余15 項生化鑒定指標均呈現陰性（表1）。結合分子生物學鑒定結果，證實該菌為殺魚愛德華氏菌。

表1 菌株的理化特性Tab.1 Physicochemical characteristics of the strain

2.6 動物回歸感染試驗

用不同劑量的細菌腹腔注射健康大口黑鱸72 h 內，三個實驗組均出現了死魚，108、107和106CFU/mL 組死亡率分別為90%、60%和20%，PBS 對照組無死亡（圖6）。多數瀕死魚的臨床癥狀與自然發病魚一致，且可從發病魚肝脾腎組織中分離出形態一致的優勢菌，經16S rRNA 鑒定，均為殺魚愛德華氏菌。這表明殺魚愛德華氏菌是大口黑鱸死亡的致病菌。

圖6 菌株S1 的回歸感染實驗Fig.6 Regression infection experiment of strain S1

2.7 藥敏試驗

對病魚中分離的殺魚愛德華氏菌（S1、S3、S4、S8）的藥敏試驗結果顯示，不同魚塘病魚的分離細菌的藥敏結果不同。1 號塘菌株S1 和8 號塘菌株S8 對氟苯尼考敏感性最強，阿莫西林次之，對多西環素和恩諾沙星中等敏感。而3 號塘菌株S3 和4號塘菌株S4 對阿莫西林最敏感，多西環素次之，對恩諾沙星和氟苯尼考中度敏感。4 株不同塘口的菌株都對利福平和四環素都耐受（表2）。

表2 菌株藥敏結果Tab.2 Drug sensitivity results of bacterial strains

3 討論

本研究在3 月開春季節走訪佛山水產養殖基地，跟蹤調查加州鱸流行病學。將患病加州鱸采樣解剖，從內臟分離出優勢病原菌，并對其進行16S rRNA 序列分析和生理生化鑒定，確定優勢菌株為加州鱸殺魚愛德華氏菌。

回歸實驗結果表明，腹腔注射108CFU/mL 組死亡率為90%，表明分離純化的殺魚愛德華氏菌株S1具有很強的致病力，是引起加州鱸在開春水溫回暖季節大量死亡的主要病原菌。人工感染菌株S1 的加州鱸出現內臟出血和腹部膨大等與自然感染一致的癥狀，表明殺魚愛德華氏菌作為條件性致病菌在適當的水溫環境下容易引起加州鱸的急性敗血癥。但人工感染的加州鱸未出現肝臟脂肪化、缺血、腫大的病癥，原因是肝臟的健康主要與養殖投喂模式及環境因素有關，屬于長期積累的病理變化結果。過量投喂增加了肝臟的負荷，養殖密度的不斷增加也進一步惡化水質環境，導致加州鱸機體免疫水平下降，在病原菌入侵時容易造成大量死亡。

藥敏實驗中采用了6 種水產動物常用的抗菌藥物。結果發現，不同塘口分離的殺魚愛德華氏菌菌株，對不同藥物的敏感度有所差別。四株分離株都對利福平和四環素耐受，1 號和8 號池分離株對氟苯尼考的敏感程度最高，但3、4 號池分離株對阿莫西林藥敏度最高。造成這種差異現象主要和不同塘口的用藥史有關[9,10]。用藥記錄顯示，3、4 號池存在過量使用氟苯尼考連續拌料投喂的現象。由于抗生素的選擇缺乏針對性、種類單一、配伍不合理甚至出現禁忌，不但增加環境中細菌對廣譜抗生素的耐藥性[11]，也會出現用藥效果不佳、抗生素殘留[12]等問題。因此，在養殖發病過程中，應先對患病魚體解剖檢查，綜合分析近期養殖環境變化、攝食和發病情況，找出疾病根源，結合池塘養殖過程中的用藥史，在藥敏實驗結果的指導下，選出合適的藥物及搭配方式，提高用藥準確率和成功率，對藥物的選擇和治療療程有明確的規劃，做到科學合理用藥。

殺魚愛德華氏菌是在開春水溫上升季節引起死亡的最主要病原菌，每年給加州鱸養殖業造成了較大的損失。本研究從患病加州鱸分離出的殺魚愛德華氏菌毒力也很高，應當引起足夠重視。本研究為該病的分離鑒定、藥物治療提供了科學依據，為加州鱸養殖提供了參考。