UPLC-Q-TOF/MS結合化學計量學對不同產地香圓主要成分的研究

陳婷 張文 朱仁愿 續艷麗 彭濤

基金項目：

甘肅省藥品監督管理局青年科技創新項目（2020GSMPA014）；甘肅省市場監督管理局科技計劃項目（SSCJG-SP-A202205）；國家市場監督管理總局科技計劃項目（2021MK110）。

作者簡介：

陳婷（1985—），女，漢族，碩士，工程師，研究方向為食品藥品質量安全研究。E-mail：125731803@qq.com

通信作者：

續艷麗（1985—），女，漢族，碩士，高級工程師，研究方向為藥品質量安全研究。E-mail：864093439@qq.com

【摘? 要】

建立了超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF/MS）快速分析香圓化學成分的方法。利用UPLC-Q-TOF/MS聯用技術，通過一級質譜精確質量數和高分辨二級碎片離子譜圖庫信息，參照標準品比對及相關文獻對化合物結構信息進行鑒定；采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）對不同產地香圓樣品進行數據分析及質量評價。結果顯示：經UPLC-Q-TOF/MS分析指認出29個成分；采自5個產地的25批香圓的PCA和OPLS-DA分析結果一致，樣本群處于不同的空間聚落，可以較好地區分且被明顯分成了5組，其中廣西樣品離散性較大，說明同一產地樣品的內部差異性較大；安徽、四川、云南、浙江樣品分布較為集中；進一步采用VIP值法進行分析，本實驗篩選出VIP 值>1的8個化學成分作為不同產地香圓差異性的主要化學標記物。所建立的香圓高分辨譜圖方法穩定、可靠，可為其質量控制提供參考依據。

【關鍵詞】

香圓；超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜；化學成分

【中圖分類號】R284.2??? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2023）22-0047-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.22.zgmzmjyyzz202322012

UPLC-Q-TOF/MS Combined with Chemometrics for the Study of the Main Components of Citron

CHEN Ting*? ZHANG Wen? ZHU Renyuan? XU Yanli*? PENG Tao

Lanzhou Institutes For Food and Drug Control，Gansu Engineering Research Center for Monitoring Exogenous Harmful

Residues in Traditional Chinese Medicines，Lanzhou 730050，China

Abstract：

A rapid method for the analysis of chemical constituents of Citri Fructus by ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time of flight mass spectrometry （UPLC-Q-TOF/MS） was established.Using UPLC-Q-TOF/MS technology，the chemical compositions were identified according to MS accurate mass and MS/MS spectrometry fragmentation information，and comparison with reference standards and literature;Principal component analysis（PCA） and orthogonal partial least square discriminant analysis（OPLS-DA） were used for the data analysis and quality evaluation of Citri Fructus from different production areas.The results showed that 29 components were identified by UPLC-Q-TOF/MS.The PCA and OPLS-DA analysis results of 25 batches of Citri Fructus collected from 5 production areas were consistent. The sample groups were located in different spatial settlements， which could be well distinguished and were clearly divided into 5 groups.The samples from Guangxi Province have large dispersion， indicating that the samples from the same production area have large internal differences; samples from Anhui Province， Sichuan Province， Yunnan Province and Zhejiang Province were more concentrated.The VIP value method was used for further analysis，in this experiment， 8 chemical components with VIP value>1 were screened out as the main chemical markers for the difference of Citri Fructus from different producing areas.The high-resolution spectrogram method for Citri Fructus is stable and reliable， and can provide reference for its quality control.

Keywords：

Citrus Wilsonii Tanaka;Ultra Performance Liquid Chromatography Coupled with Quadrupole-time of Flight Mass Spectrometry;Chemical Compositions

香櫞為蕓香科植物枸櫞 （Citrus medica L.）或香圓（Citrus wilsonii Tanaka）的干燥成熟果實，具有理氣和中、化痰止咳、抗菌、抗炎、抗過敏的功效［1］，用于緩解胃腹脹痛、嘔吐、咳嗽等癥［2-3］。《中國藥典》所收載的藥用正品香櫞有枸櫞和香圓兩種［4］，香圓藥材資源分布廣泛，果實來源豐富，主產于四川、廣東、廣西、云南等地，由于香圓產地廣泛且栽培品種繁多，市場上藥材質量差異較大［5-6］，藥典中香櫞僅以香圓中柚皮苷為含量測定及鑒別對象，并不能完全反映藥材的品質，因此建立一種簡單有效的分析方法對不同產地香圓進行質量評價顯得尤為重要。

目前，液相-飛行時間質譜儀（LC-Q/TOF） 因具有靈敏度高、準確率高、分辨率高等特點，能夠在線分析和鑒定復雜成分，尤其是飛行時間質譜儀可精確測定分子的質量數，特別適用于中藥及復方未知化合物的分析與鑒定［7-8］。現存關于香圓的研究報道主要集中在部分成分如橙皮苷和柚皮苷等的含量測定及其指紋圖譜的研究，所用分析技術多為液相色譜法等［9-10］。隨著數據分析技術的發展，高分辨質譜結合化學計量學分析已經逐漸應用于中藥材的質量評價中［11-12］。然而針對不同產地香圓的差異化學成分所進行的高分辨質譜研究尚未見報道。因此本文采用超高效液相色譜與高分辨質譜相結合，快速、高效、精確地采集和分析不同產地香圓的化學成分，同時結合多元統計分析方法對不同產地香圓進行對比分析，找出各組之間的差異化學成分，為香圓的產地鑒別和品質分類提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 儀器與試劑? Agilent 1290超高效液相色譜/6546四極桿-飛行時間質譜儀（美國安捷倫公司），配有雙電噴霧離子源（dual Jet Stream ESI）；ME204/02電子天平（美國梅特勒公司）；Milli-Q超純水機（美國Millipore公司）；Centrifuge 5810R高速離心機（德國Eppendorf公司）；SBL-10T型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技有限公司）； FW135 型中藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

甲醇、乙腈、甲酸為質譜純，其他試劑均為分析純，試驗用水為Milli-Q超純水。香圓藥材來源為產地采購（安徽、四川、云南、浙江、廣西），共25批，樣本均經蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院中藥室鑒定為香圓。

1.2? 供試品溶液的制備? 精密稱取香圓樣本粉末（過三號篩）各50 mg，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，超聲提取30 min，取出，放置冷卻，稱重，用甲醇補足失重，離心（4000 r/min，15 min），取上清液，經0.22μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.3? 檢測條件

1.3.1? 色譜條件? ZORBAX SB-C18色譜柱（2.1mm×100 mm，3.5μm）。流動相0.1%甲酸-5mmol/L乙酸銨水溶液（A）-乙腈溶液（B）；梯度洗脫（0～6 min，5%～30% B；6～16 min，30%～95% B；16～20 min，95%～5% B；20～23 min，5% B）；柱溫40℃；流速0.4mL/min，進樣量2 μL。

1.3.2? 質譜條件? 電噴霧離子源（ESI），在正/負離子模式下分別采集數據。干燥氣溫度325℃；干燥氣流速10 L/min；霧化器壓力3.1×105 Pa；毛細管電壓4000 V；噴嘴電壓500 V；鞘氣溫度325℃；鞘氣流速11 L/min；掃描范圍：m/z 50～1000。

1.4? 共有差異化學成分的鑒定及統計分析? 取香圓樣品，制備供試品溶液，按“1.3”的方法進行質譜數據采集，根據總離子流圖所得化合物的精確分子質量信息，通過比對精確相對分子質量和二級特征碎片離子，結合對照品、數據庫檢索及文獻報道，確定或推測共有峰信息。采集的原始數據通過Mass Hunter Qualitative Analysis 進行分析處理，如保留時間校準、峰識別、峰對齊等，將數據矩陣導入SIMI-CA 14.1 軟件，對香圓中的化學成分進行主成分分析（PCA），觀察樣本的聚類情況，再采用正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）進行有監督的數據分析。

2? 結果與討論

2.1? 方法學考察

2.1.1? 精密度試驗? 取500 μL供試品溶液，過0.22μm濾膜，得樣品溶液。分別選擇6個不同保留時間的離子（考察的離子分別是161.05243、289.07901、305.0739、325.0920、461.1162、597.1814），計算各離子的保留時間（tR），質荷比（m/z）和歸一化后峰面積的相對標準偏差（RSD），考察儀器方法的性能。重復測定５次，得到離子保留時間的RSD值依次為0.2%、0.3%、0.2%、0.1%、0.2%、0.4%，質荷比的RSD值均為0%，相對峰面積的RSD值依次為2.3%、1.6%、3.3%、1.2%、3.0%、4.1%，結果顯示儀器精密度良好。

2.1.2? 重復性試驗? 精密稱取香圓樣本粉末（過三號篩），按1.2節方法制備5份供試品溶液，得到6個離子保留時間的RSD值分別為0.3%、0.2%、0.4%、0.1%、0.3%、0.5%，質荷比的RSD值均為0%，相對峰面積的RSD值分別為4.2%、3.3%、1.2%、1.4%、2.5%、3.0%，結果顯示方法的重復性良好。

2.1.3? 樣品穩定性試驗? 取同一份供試品溶液，分別于0 h、4 h、8 h、12 h、24 h測定，得到6個離子保留時間的RSD值分別為2.3%、0.5%、1.4%、0.1%、0.1%、1.1%，相對峰面積的RSD值分別為3.4%、2.8%、1.7%、4.0%、3.2%、1.2%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2? 數據采集與成分鑒定? 按照液相色譜質譜檢測條件的要求，取供試品溶液進行采集分析。由于樣品化學成分復雜，因此采用正負離子分別掃描的方法，實現多種化合物同時測定。以安徽產地樣品為例，總離子流圖如圖1所示。通過Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis軟件自動分析采集的原始數據，提取其總離子流色譜圖（EICs）中所得化合物的精確分子質量信息，分析其二級碎片離子信息，通過對照品、化學數據庫（CNKI SciFinder，ChemSpider等）及文獻［13-20］報道進行檢索，對各化合物進行初步鑒定，建立包括化合物名稱、分子式和化學結構等信息的潛在化學成分數據庫。利用已有對照品的保留時間和質譜信息進行成分鑒定，推測出傘形花內酯、橘皮素、檸檬苦素等29種共有化學成分，5個產地香圓樣品共有化合物詳細信息見表1。

2.3? 不同產地香圓化學主成分分析（PCA）? 不同產地香圓中的29種化學成分的離子峰面積數據按照要求處理后，導入SIMCA-P 14.0軟件進行PCA處理，得分圖如圖2所示。結果發現不同產地香圓樣本群在得分圖中處于不同的聚落，可以較好地區分且被明顯分成了5組，說明不同產地香圓樣本主要化學成分存在差異變化。各組樣本點之間除廣西樣本外，其余離散性均較小，分布較為集中，表明廣西產地樣品的內部差異性較大，其余產地（安徽、四川、云南、浙江）香圓樣品組內差異較小。

2.4? 不同產地香圓化學成分偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）? 為了更好地觀察樣品組間差異，采用有監督的OPLS-DA模型對25批香圓進行分析，得分圖如圖3所示。由模型驗證參數可知，數據矩陣的結實率參數R2（X）= 0.754，模型區分參數R2（Y）=0.958，模型預測參數Q2（cum）=0.930，說明75.4%變量可用來解釋各組之間95.8%的差異，該模型的平均預測能力為93.0%，預測能力大于50%，且R2（Y）與Q2（cum）之間的差值為0.028，小于0.3，表明建立的模型穩定且有較強的預測能力。

為了驗證模型的有效性，利用OPLS-DA模型置換交叉檢驗，經過800次交叉驗證，結果R2與真實模型的R2Y值的一條回歸線截距為0.0881 （＜0.4），Q2與真實模型Q2Y值的一條回歸線截距為-0.443（＜0.05），結果顯示模型未出現過度擬合現象，該模型具有顯著的統計學意義（圖3c）。圖3a、3b結果顯示，不同產地的香圓在OPLS-DA 圖中呈現了各自的特定區域，分離效果明顯。與無監督模式的主成分分析（PCA）結果相比較，5個產地的香圓樣品得到更好地分離，且有助于尋找樣品間的差異化學成分。為進一步確認樣品分類差異貢獻程度的大小，采用變量載荷評價參數值（VIP） 進行評價，該值可以體現變量對模型的整體貢獻水平。VIP值越大，表明變量的貢獻程度越大，當VIP 值大于 1 時，化合物視為模型潛在的差異化學成分。本實驗篩選出VIP 值>1的8個化學成分作為不同產地香圓差異性的主要化學標記物，包括金合歡素、柚皮苷、傘形花內酯、5，7-二羥基香豆素、兒茶素、橘皮素、橙皮素、辛弗林，是區分不同產地香圓最重要的化合物。

3? 結論

本文對25批不同產地香圓藥材進行了研究，建立了UPLC-Q-TOF/MS定性分析方法，分析香圓化學成分圖譜并結合柚皮苷等對照品的保留時間和質譜信息等進行成分鑒定，共鑒定出29個成分。采用特征圖譜信息結合化學計量學分析對25批不同產地香圓樣品的主成分進行評價，通過PCA和OPLS-DA 對5個產地香圓藥材進行了區分。結果顯示，不同產地香圓樣本群處于不同的空間聚落，可以較好地區分且被明顯分成了5組，廣西樣品離散型較大，說明同一產地樣品的內部差異性較大；安徽、四川、云南、浙江樣品分布較為集中，組間差異較小；進一步采用VIP值法進行分析，本實驗篩選出VIP 值>1的8個化學成分作為香圓差異性的主要化學標記物。

本文建立的HPLC-Q-TOF/MS高分辨質譜測定香圓中化學成分的定性方法簡單、可靠，可較為全面的反應香圓化學信息，結合化學計量法對特征信息進行綜合評價，使結果更為全面科學，且有助于從多組分體系的角度鑒別中藥材品種，相互配合，為進一步的質量控制提供依據。

參考文獻

［1］

HUBER R， STINTZING F， BRIEMLE D，et al.In vitro antiallergic effects of aqueous fermented preparations from Citrus and Cydonia fruits［J］. Planta Med， 2012， 78（4）： 334- 340.

［2］劉春泉，李大婧，牛麗影，等.香櫞開發利用研究進展［J］.江蘇農業科學，2010，28（8）：1-5.

［3］毛淑杰，李先端，顧雪竹，等.香櫞的質量評價標準研究［J］.中國中醫藥信息雜志，2008（15）：42-43.

［4］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2020：270-271.

［5］張然，徐敏，何婷婷，等.香櫞多酚提取工藝優化［J］.食品工業科技，2018，39（6）：170-172.

［6］蘇靜華，張超，孫磊，等.指紋圖譜結合化學計量學用于香櫞品種鑒別的可行性分析［J］.中國中藥雜志，2015，40（12）：2318-2324.

［7］王靜，蔣惠宇，張晶晶，等.基于HPLC-TOF /MS與HPLC-MS/MS的養心氏片主要成分研究［J］.分析測試學報，2018，37（7）： 759-765.

［8］嚴穎，趙慧，鄒立思，等.基于LC-QTOF MS /MS技術分析不同產地杜仲的差異化學成分［J］.中國中藥雜志，2017，42（14）：2730-2737.

［9］朱景寧，毛淑杰，顧雪竹，等. HPLC測定香櫞中柚皮苷的含量［J］.中國中藥雜志，2007，32（3）： 265-266.

［10］姜艷艷，張樂，劉娟，等.香櫞、佛手中黃酮類成分含量測定及HPLC特征圖譜研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19（20）：103-107.

［11］祝婧，袁恩，牟俊雍，等.基于UPLC-Q/TOF-MS分析江西特色炮制工藝對枳殼化學成分的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2020，26（16）：142-153.

［12］趙曉梅，程宇欣，梁彩霞，等.基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術的吳茱萸化學成分分析［J］.中國實驗方劑學雜志，2021，27（6）：113-126.

［13］ZHAO P， DUAN L， GUO L， et al. Chemical and biological comparison of the fruit extracts of Citrus wilsonii Tanaka and Citrus medica L［J］. Food Chem， 2015，173（15）：54-60.

［14］尹偉，宋祖榮，劉金旗，等.香櫞化學成分研究［J］.中藥材，2015，38（10）：2091-2094.

［15］劉娟秀，羅益遠，劉訓紅，等.基于UPLC-TripleTOFMS/MS技術分析蒼耳子炒制前后的差異化學成分［J］.質譜學報，2017，38（1）：157-168.

［16］趙希娟，龐雯輝，譚濤，等.基于UPLC-Q-TOF/HRMS技術結合SWATH采集方法同時測定檸檬果實中26種生物活性成分的含量［J］.食品與發酵工業，2022，48（23）：306-314.

［17］張寬永，沈燚，張璐，等.基于UPLC-Triple-TOF-MS和網絡藥理學快速建立郁金潛在中藥質量標志物成分庫［J］.中草藥，2022，53（9）：2612-2622.

［18］李建緒，王紅程，高美華，等.枸櫞果實的香豆素和黃酮類成分研究［J］.藥學研究，2013，32（4）：187-189.

［19］董麗榮，劉曉秋，李忠榮，等.枸櫞果實化學成分研究［J］.精細化工，2010，27（10）：982-986.

［20］國家中醫藥管理局.中華本草（卷4）［M］.上海：上海科學技術出版社， 1999：908-911.

（收稿日期：2023-02-27? 編輯：劉? 斌）