當歸根際叢枝菌根真菌群落及其影響因子分析

鞏曉芳,薛林貴,楊 玲,陳玉坤,彭軼楠,祝 英,王治業

(1. 蘭州交通大學 生物與制藥工程學院,蘭州 730070;2. 甘肅省科學院生物研究所 甘肅省微生物資源開發利用重點實驗室,蘭州 730000)

當歸(Angelicasinensis(Oliv.) Diels)屬于傘形花科,為多年生草本植物,是我國傳統中藥材之一,其味甘、辛,性溫,歸肝、心、脾經,具有補血活血、調經止痛、潤腸通便等功效,在中藥材中具有“十方九歸”的地位[1]。甘肅省岷縣是我國優質當歸的主產區[2],岷縣當歸被稱為“岷歸”,岷歸因產量高和品質優而享有“岷歸甲中華”的美譽[3]。近年來,因當歸的連作障礙及病蟲害頻發,導致當歸產量和品質逐年下降,不僅使藥農的收入降低還影響地方中藥材產業的發展[4]。研究表明中藥材的產量和品質除受自身遺傳因素決定外,土壤因子(土壤理化特性、土壤養分和土壤微生物等)也是直接影響中藥材產量和主要藥效成分的重要因素[5]。根際土壤微生物在植物的生長發育過程中起著至關重要的作用,其群落結構對植物生長和健康具有重要的影響[6-7]。姜小鳳等[8]研究表明當歸根際土壤細菌群落對當歸健康生長和藥效成分積累具有重要的影響。Zhu等[9]報道了土壤微生物會影響當歸生長和藥效成分類型的形成。因此,研究土壤微生物在當歸生長中的變化特征對研究當歸品質形成理論及其調控具有重要意義。

叢植菌根真菌(AMF)是一類有益的土壤微生物,能與80%以上的陸生植物形成互惠共生體—菌根[10],菌根有助于植物借助廣泛而發達的菌絲從土壤中獲取養分,促進植物的生長,還能增強植物的抗逆性[11],如干旱、鹽漬化和重金屬毒害。You等[12]研究表明菌根可以去除土壤中的重金屬,降低土壤中重金屬的積累從而緩解對植物的毒害。仲啟祥等[13]報道當歸種植土壤重金屬中鎘的含量最高,當歸植株對重金屬砷具有明顯的吸收特性,但當歸植株對鎘和砷的富集能力較低。研究表明AMF與中藥材也能形成菌根,在中藥材的生長過程中發揮有益功效[14]。課題組前期的研究發現,AMF與當歸的共生過程中,土壤中AMF的孢子密度和球囊霉素含量隨當歸的生長發生明顯的規律性變化,且AMF參數與土壤因子的相關性顯著[15]。但當歸不同生長期根際土壤中AMF的多樣性及群落結構的特征及其與土壤因子的相關關系尚未見報道。

本研究選擇甘肅省定西市岷縣當歸栽培區,分別在當歸的重要生長期:葉叢期、根膨大期和成藥期進行采樣,采用Illumina MiSeq高通量測序技術,對當歸不同生長期根際土壤AMF多樣性及其群落結構進行測序分析,并與當歸根際土壤理化因子及土壤重金屬鎘和砷的測定結果進行關聯分析,闡明當歸根際土壤AMF多樣性和群落結構在當歸生長過程中的變化及主要影響因素,為當歸的健康生長和品質提升提供理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品種植區概況

選擇甘肅省定西市岷縣十里鎮(E 103° 57′ 16″,N 34° 29′ 51″)當歸栽培區為試驗地。岷縣為溫帶半濕潤向高寒濕潤氣候過渡帶,高寒陰濕,年均氣溫5.5 ℃,年降水量635 mm,7-9月為雨水集中期,平均相對濕度68%,年無霜期123 d。土壤為黑鈣土,土質黏細,砂質含量低,干后易結塊。本研究試驗田選擇地勢較為平坦的地,均勻地移栽品種為“岷歸1號”的種苗,定期人工除草管理。

1.1.2 樣品采集

選擇當歸的重要生長期:葉叢期(S期,5月21日)、根膨大期(M期,7月28日)和成藥期(H期,10月8日)采樣,每期采用5點“S”法選擇6個點,采集當歸植株和根際土壤。采樣時將帶有根際土的當歸植株放入無菌自封袋,做好標記放入冰盒帶回實驗室后,輕揉并抖動當歸獲得根際土樣,并將每個土樣分成2份,1份裝入無菌自封袋,-80 ℃冰箱儲存,用于樣品高通量測序;另1份自然風干后過篩(0.149 mm),用于土壤pH值、電導率、重金屬鎘和砷的測定。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品理化性質及重金屬測定

土樣pH值采用pH計測定,水土比為1∶2.5;電導率采用電導率儀測定,水土比為1∶2.5。重金屬鎘和砷采用硝酸-雙氧水-氫氟酸多酸消解,用ICP-OES/MS測定元素含量[13,15]。

1.2.2 樣品DNA提取

1.2.3 PCR擴增和測序

1.2.4 高通量測序數據分析

使用fastp[17]軟件對雙端原始測序序列進行質控,再用Flash[18]軟件進行拼接,然后使用Uparse[19]軟件,根據97%的相似度對質控拼接后的序列進行操作分類單元OTU(operational taxonomic unit)聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier[20]比對maarjam20220506/AM數據庫進行OTU物種分類學注釋,置信度閾值為70%,并在不同物種分類水平統計每個樣本的群落組成。

1.2.5 數據統計分析

多樣性數據及土壤因子關聯分析均在美吉生物云平臺上進行,具體如下:采用mothur[21]軟件計算Alpha多樣性指數;使用基于bray-curtis距離算法的PCoA分析檢驗樣本間微生物群落結構的相似性。采用Wilxocon秩和檢驗進行物種組成差異分析;基于Pearson相關性|r|>0.6,p<0.05 挑選物種進行相關性分析,并使用基于距離的冗余分析(distance-based redundancy analysis,db-RDA)用來分析當歸根際土壤AMF群落與土壤因子的相關關系,采用R語言工具統計和作圖。土壤因子采用SPSS 22軟件進行統計分析,然后用Origin Pro 2019 (Origin Lab Corporation,USA) 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 當歸不同生長期根際土壤理化性質分析及重金屬鎘和砷的質量分數測定

當歸不同生長期根際土壤理化性質及重金屬鎘和砷含量變化如圖1所示。

圖1 當歸不同生長期根際土壤理化性質及重金屬鎘和砷含量的變化

由圖1可知,當歸根際土壤pH值和土壤電導率(EC)在當歸的S期、M期到H期呈明顯的下降趨勢(見圖1(a),1(b)),其中H期當歸根際土壤的pH值和EC極顯著低于S期和M期(p<0.001),M期的EC極顯著低于S期(p<0.000 1)。當歸根際土壤重金屬鎘含量在S期、M期到H期變化差異不顯著(見圖1(c)),而砷含量在當歸的S期、M期到H期顯著降低(見圖1(d)),其中H期根際土壤中砷的質量分數相比于S期下降了35%,達到極顯著水平(p<0.001)。說明在當歸的不同生長期根際土壤的理化性質及重金屬鎘和砷含量具有明顯差異。

2.2 當歸根際土壤AMF測序信息結果

Illumina MiSeq測序結果顯示,所有土樣AMF測到的序列長度均集中分布在200～240之間(見圖2(a)),序列數在不同土樣間具有較大差異,大小依次為:H期>M期>S期。稀釋曲線用來反映所抽取的優化測序深度是否合理,由圖2(b)可知,抽取的所有樣品的序列數均達到12 000條以上,曲線趨向平坦,表明所有樣本測序數量充足,測序合理。本研究從當歸根際土壤中共獲得1 066 554條有效序列,平均每個樣品中得到59 253條有效序列。

圖2 當歸根際土壤AMF測序結果

當歸根際土壤AMF高通量測序獲得的有效序列經比對NCBI數據庫,總共得到137個AMF-OTUs,分屬于1門1綱5目9科9屬32種。OTU Venn分析如圖2(c)所示,圖中直觀地顯示了當歸不同生長期根際AMF群落OTU組成的共有和特有物種數。從S期、M期到H期OTU的數目呈增加趨勢,H期的OTU數目最多,占總數目的71.53%,S期的OTU數目最少,占總數目的54.74%,M期居中,占總數的62.04%。3個時期共有的OTU數目為35,S期的獨有OTU數目最多,占S期總數目的32%;H期的獨有OTU數目居中,占H期總數目的18.37%;M期的獨有OTU數目最少,占M期總數目的10.59%。

2.3 當歸不同生長期根際土壤AMF-α多樣性分析

Coverage指數反映群落覆蓋度,α多樣性指數可以反映微生物群落的豐富度和多樣性,Shannon和Simpson指數反映群落的多樣性;Sobs、Chao和Ace指數反映群落的豐富度。當歸S期、M期和H期根際土壤AMF的α多樣性分析結果如圖3(a)～3(f),從圖3(a)可知當歸S期、M期和H期的覆蓋度均大于99%,說明測得的AMF物種基本覆蓋了當歸不同時期根際土壤AMF所有物種。由圖3(b)和3(c)可知,在當歸不同生長期,H期的Shannon指數顯著高于S期和M期(p<0.05),S期和M期之間無統計學差異;Simpson指數為H期低于S期和M期,但三者之間均未達到顯著水平;Sobs、Chao和Ace指數均為H期高于S期和M期,三者之間也沒有達到顯著水平,以上結果說明當歸成藥期根際土壤AMF的多樣性和豐富度均大于葉叢期和根膨大期,且成藥期當歸根際土壤AMF的多樣性顯著大于當歸葉叢期和根膨大期(p<0.05)。

圖3 當歸不同生長期根際土壤AMF α-多樣性分析

2.4 當歸不同生長期根際土壤AMF-β多樣性分析

基于bray_curtis距離算法,采用Anosim(analysis of similarities)當歸不同生長期根際土壤AMF群落進行組間差異分析,其PCoA分析結果如圖4所示。

圖4 當歸不同生長期根際土壤AMF β-多樣性分析

圖4表明在OTU水平上(見圖4(a)),主成分1(PC1)和主成分2(PC2)解釋方差分別為35.07%和18.83%,累計達53.90%;在屬水平上(見圖4(b)),主成分1(PC1)和主成分2(PC2)解釋方差分別為71.24%和10.10%,累計達到81.34%。說明本研究中影響當歸根際土壤AMF群落結構的主導因子明顯(p<0.05),OTU水平和屬水平均呈現出當歸S期、M期和H期有相交部分也有獨立的部分,說明當歸不同生長期根際土壤AMF群落的組成具有一定的差異,反映了當歸根際土壤AMF群落組成隨著當歸的生長在不斷變化。

2.5 當歸不同生長期根際AMF組成分析

當歸根際土壤AMF的組成如圖5所示。

圖5 當歸不同生長期根際土壤AMF組成

從屬水平分析,不同樣品間的組成具有明顯差異(見圖5(a),5(b)),當歸根際土壤AMF在屬水平上的組成,包括:球囊霉屬(Glomeraceae)、多孢囊霉屬(Diversisporaceae)、Unclassified_c_Diversisporales屬、無梗囊霉屬(Acaulosporaceae)、Unclassified_c_Glomeromycetes屬、巨孢囊霉屬(Gigasporaceae)、類球囊霉屬(Paraglomus)、原囊霉屬(Archaeospora)和雙型囊霉屬(Ambispora)。優勢菌為球囊霉屬(Glomeraceae)和多孢囊霉屬(Diversispora),其中球囊霉屬的豐度要明顯高于多孢囊霉屬,球囊霉屬的豐度在S期、M期和H期的平均值分別為61.84%,71.97%和75.15%,表明球囊霉屬隨當歸的生長豐度逐漸增加;而多孢囊霉屬的豐度在S期、M期和H期的平均值分別為25.13%,25.77%和16.50%,表明多孢囊霉屬隨當歸的生長豐度逐漸減少(圖5(b))。圖5(c)是當歸根際AMF屬水平組成的三元相圖,其中球囊霉屬(Glomeraceae)占比為69.7%,S、M和H貢獻度分別為29.6%,34.4%和36.0%;多孢囊霉屬(Diversisporaceae)占22.5%,S、M和H貢獻度分別為37.3%,38.2%和24.5%;而Unclassified_c_Diversisporales屬、無梗囊霉屬(Acaulosporaceae)、巨孢囊霉屬(Gigasporaceae)和Unclassified_c_Glomeromycetes屬等的占比均低于3.5%。以上結果說明球囊霉屬是當歸根際AMF的絕對優勢屬。

2.6 當歸不同生長期根際AMF物種差異分析

采用Wilxocon秩和檢驗對不同生長期當歸根際AMF的物種組成差異進行分析,由表1可知,在當歸的S期、M期和H期,當歸根際土壤AMF的優勢菌,球囊霉屬(Glomeraceae)和多孢囊霉屬(Diversisporaceae)及非優勢菌,無梗囊霉屬(Acaulosporaceae)、Unclassified_c_Glomeromycetes、巨孢囊霉屬(Gigasporaceae)、Unclassified_f_Diversisporaceae屬、類球囊霉屬(Paraglomus)、原囊霉屬(Archaeospora)和雙型囊霉屬(Ambispora)均無顯著差異(p<0.05),僅Unclassified_o_Diversisporales屬在S期、M期和H期的豐度具有顯著差異(p<0.05),說明當歸根際土壤AMF中Unclassified_o_Diversisporales屬的豐度對當歸的不同生長期響應明顯。

表1 不同生長期當歸根際AMF物種組間差異分析結果

2.7 當歸根際土壤因子與AMF關聯分析

當歸根際土壤理化因子,鎘和砷含量與當歸根際土壤AMF菌群的豐度的相關性分析結果表明(見表2),土壤pH值與unclassified_c__Glomeromycetes屬極顯著正相關(p<0.01),與unclassified_o__Diversisporales屬和原囊霉屬(Archaeospora)顯著負相關(p<0.05),而與巨孢囊霉屬(Gigasporaceae)極顯著負相關(p<0.01);無梗囊霉屬(Acaulospora)與土壤電導率和土壤重金屬鎘和砷均為顯著正相關(p<0.05);重金屬鎘與類球囊霉屬(Paraglomus)顯著負相關,與雙型囊霉屬(Ambispora)顯著正相關(p<0.05),說明當歸根際土壤理化因子及鎘和砷含量對當歸根際土壤AMF菌群的豐度具有一定的影響。

表2 當歸根際土壤AMF優勢菌與土壤理化性質及鎘和砷質量分數的相關系數

基于bray_curtis距離算法,采用db-RDA分析對當歸根際土壤因子與AMF菌群進行關聯分析,結果如圖6所示。圖6(a)中顯示土壤pH值與Shannon指數和豐富度指數Ace指數為正相關,而與Simpson指數負相關;Shannon指數、Ace指數和Chao指數與土壤電導率、鎘和砷均為負相關;當歸根際土壤pH值和電導率對AMF菌群的影響相對弱于土壤重金屬鎘和砷,土壤重金屬鎘對AMF菌群的影響大于砷。說明當歸根際土壤AMF的多樣性、豐富度和菌群結構對當歸根際土壤理化因子和重金屬鎘和砷含量均有明顯的響應。

圖6 當歸根際土壤AMF與土壤因子的db-RDA和VPA分析

VPA分析顯示(見圖6(b)),當歸根際土壤因子對AMF菌群影響因素的可解釋度為71.46%,其中重金屬鎘和砷的單獨解釋度最高,為45.24%,土壤理化性質pH值和電導率的單獨解釋度為33.52%,AMF多樣性的單獨解釋度較低,僅為16.25%,說明當歸根際土壤中重金屬鎘和砷對AMF菌群的影響作用較大,是本研究中AMF菌群的主要驅動因子。

3 討論

研究表明AMF在其共生植物的生活史中會不斷發生變化,其中土壤理化性質是引起AMF群落結構變化的重要因素之一[22]。本研究中土壤pH值隨當歸的生長顯著降低(見圖1(a)),且土壤pH值與多個AMF屬為負相關,其中與巨孢囊霉屬(Gigasporaceae)極顯著負相關(p<0.001)(見表2),可能是隨著當歸的生長發育,當歸根系分泌的有機酸類物質在土壤中逐漸累積[23],使土壤向微酸性變化(見圖1(a)),因AMF喜好微酸性土壤,適宜的土壤環境有利于AMF的生長,使AMF菌群的多樣性和豐富度增加,這與前人的研究結果一致[24],說明土壤 pH值是驅動AMF多樣性和群落變化的主要驅動因子之一。土壤電導率是反映土壤鹽濃度的重要參數,土壤鹽濃度對AMF有著重要影響,研究表明土壤鹽濃度過高會縮短AMF菌絲芽管的發育而抑制AMF菌絲的分支,還會使植物葉綠素含量減少而使植物光合作用強度降低,導致宿主植物地下根部獲得的光合產物減少而影響AMF的生長和發育[14]。本研究中從當歸的S期到H期,根際土壤的電導率顯著下降(見圖1(b)),當歸根際土壤AMF多樣性指數Shannon指數顯著增大,豐富度指數Ace和Chao指數明顯增大(見圖3),且相關性結果表明土壤電導率與AMF多樣性指數Shannon指數和豐富度指數Ace和Chao指數均為負相關(見圖6(a)),說明較低的土壤電導率更利于當歸根際土壤AMF多樣性和豐富度的增大。

本研究除了土壤pH值和電導率兩個重要土壤因子外,還證實了土壤重金屬Cd和As也是AMF群落結構的重要驅動因子,且相比于土壤pH值和電導率,土壤重金屬Cd和As對AMF菌群的影響更明顯(見表2,圖1和圖6)。You等[25]研究表明AMF能促進宿主植物對重金屬Cd的吸收,而本研究中當歸根際土壤重金屬Cd含量從當歸的S期到H期沒有發生顯著的變化(見圖1(c)),說明AMF沒有明顯促進當歸植株對重金屬Cd的吸收,這可能與土壤中磷元素的運輸有關[25],也可能與Cd濃度有關,張淑彬等[26]研究表明低濃度的Cd含量刺激AMF菌絲的生長,但是當Cd濃度大于AMF的耐受值后會影響甚至抑制AMF菌絲的生長。本研究中AMF多樣性和豐富度隨著當歸的生長呈增大的變化趨勢(見圖3),可能是當歸根際土壤中Cd濃度低于AMF的耐受值,而對AMF的生長發育發揮正效應。本研究中土壤重金屬As與當歸根際土壤AMF多樣性指數和優勢菌球囊霉屬(Glomus_f_Glomeraceae)均為負相關(見圖6(a)和表2),這與前人的研究結果一致[27],表明重金屬As會影響AMF的多樣性和豐富度。也有研究表明As脅迫下,AMF能有效提升宿主植物對微量元素及水分的吸收,從而顯著促進宿主植物根系的發育和植株的生長,為AMF提供了更好的生長條件[28]。這與本研究結果的不同之處是本研究中當歸根際土壤中的As含量隨當歸的生長逐漸降低(見圖1(d)),即As對AMF的脅迫效應逐漸減弱,而AMF的多樣性和豐富度卻增大,這可能是因為重金屬經過AMF菌絲后,菌絲的過濾作用使重金屬不易進入宿主植物而積累在AMF菌絲中,待宿主植物完成生活史后AMF菌絲隨之分解而將積累的重金屬釋放回環境[28]。因此,雖然土壤中重金屬As的含量在當歸生長期有所下降,但As對AMF的脅迫沒有減弱,所以AMF多樣性和豐富度增加。

微生物對不同營養物質的偏好性決定了不同植物根系分泌物對不同土壤微生物的招募[29],導致不同植物根系的微生物菌群組成差別較大,而呈現特定宿主植物獨特的AMF群落[30]。本研究中隨當歸的生長,當歸根際土壤AMF的多樣性和物種豐富度明顯增加,當歸根際土壤AMF菌群結構在當歸的生長中呈現明顯的變化(見圖4),主要原因是隨著當歸植株及地下莖的不斷生長,為AMF提供了更好的宿主營養體,有利于AMF的多樣性和豐富度增大,引起AMF的菌群結構出現一定的變化。研究表明球囊霉屬具有特有的繁殖方式,能夠耐受不同環境的變化而分布廣泛,因此是不同生態系統AMF群落的主要成員[31],本研究中當歸根際土壤AMF的優勢屬為球囊霉屬(Glomus_f_Glomeraceae)和多孢囊霉屬(Diversispora),隨著當歸的生長,次優勢屬多孢囊霉屬的豐度逐漸下降,而球囊霉屬的豐度逐漸增加,成為當歸根際AMF的絕對優勢屬(見圖5),表明球囊霉屬是當歸根際土壤AMF的特定優勢屬,這與其它藥用植物的研究結果一致[32]。但是不同植物根際AMF的次優勢屬和低豐度的屬之間具有很大差異[24,30-32],這可能是不同植物根際呈現獨特AMF群落的原因。而本研究中僅Unclassified_o_Diversisporales屬的豐度對當歸的不同生長期響應明顯(見表1),該屬在當歸的生長中是否發揮特定作用還需進一步研究。

4 結論

本研究發現在當歸不同生長期根際土壤AMF的多樣性和菌群結構具有一定的差異,當歸成藥期的根際土壤AMF多樣性和豐富度最大;在當歸的不同生長期當歸AMF菌群的優勢菌為球囊霉屬(Glomus_f_Glomeraceae)和多孢囊霉屬(Diversispora),隨當歸的生長,多孢囊霉屬的豐度逐漸降低而球囊霉屬的豐度逐漸增加成為絕對優勢屬;僅Unclassified_o_Diversisporales屬的豐度對當歸的不同生長期響應顯著;當歸根際土壤pH、電導率和重金屬鎘和砷的含量共同影響當歸根際土壤AMF的多樣性和豐富度,但土壤重金屬鎘和砷含量對AMF菌群的影響較大,為AMF菌群的主要驅動因子。以上結果可為當歸的生態種植和品質提升提供參考。