基于糖酵解相關(guān)基因GFUS 對三陰性乳腺癌療效預(yù)測模型構(gòu)建與驗證

章海斌，王 練

（蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科1，中醫(yī)科2，安徽 蚌埠 233000）

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是一類特殊類型的乳腺癌，由于其缺乏雌激素和孕激素受體以及人表皮生長因子受體2（Her-2）的表達，表現(xiàn)出不同組織學類型，基因組和免疫特征，因而被單列為一類疾病[1]。流行病學資料顯示[2]，TNBC 的發(fā)生率占所有乳腺癌的15%～20%，好發(fā)于絕經(jīng)前40 歲以下的年輕女性。TNBC 具有高侵襲的特性，術(shù)后復發(fā)率高，約25%，且術(shù)后復發(fā)時間僅為19～40 個月，遠低于非TNBC 患者的35～67 個月。遠處轉(zhuǎn)移發(fā)生率約46%，多累及腦及其他內(nèi)臟器官，轉(zhuǎn)移后的中位生存時間為13.3 個月。因此其5 年死亡率遠高于其他類型乳腺癌，達40%。復發(fā)后TNBC患者發(fā)生3 個月內(nèi)概率高達75%[3]。基于TNBC 的異質(zhì)性與難治性，建立有效的預(yù)后生物標志物對TNBC 患者準確預(yù)后和合理治療策略至關(guān)重要。越來越多的證據(jù)表明，有氧糖酵解是癌細胞的重要代謝過程。不管是否有充足的氧氣，腫瘤細胞主要利用糖酵解來產(chǎn)生能量，并且具有較高的糖酵解率。這種有氧糖酵解表型被稱為Warburg 效應(yīng)[4]。Warburg 效應(yīng)已在不同類型的實體腫瘤中得到證實，包括乳腺癌[5]。因此，靶向糖酵解過程可能成為TNBC 的潛在治療靶點。GFUS 又稱組織特異性移植抗原P35B，是一種NADP(H)結(jié)合蛋白,催化GDP-D-甘露糖代謝中的兩步外聚酶和還原酶反應(yīng)，將GDP-4-酮-6-D-脫氧甘露糖轉(zhuǎn)化為GDP-L-巖藻糖，在糖基化過程中起著關(guān)鍵作用[6]。GFUS 表達的增加可以同時誘導核心巖藻糖蛋白和巖藻糖蛋白的升高。這種異常的巖藻糖基化在結(jié)直腸癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、食管癌等腫瘤中都普遍存在，其調(diào)控腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移、血管生成、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸等方面發(fā)揮作用[7-9]。研究發(fā)現(xiàn)[10]，GFUS 的高表達在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，可作為乳腺癌的獨立分子標志物。因此，本研究通過應(yīng)用多種生物信息學方法，實現(xiàn)GFUS 共表達基因鑒定，構(gòu)建了TNBC 的預(yù)后模型，以期對指導TNBC 個體化治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 資料來源 從TCGA（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）獲取160 例TNBC 腫瘤樣本與113 例癌旁正常組織樣本的基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)。

1.2 方法

1.2.1 GFUS 在TNBC 中的表達差異及的功能分析使用R 軟件v4.0.3 進行統(tǒng)計分析，對GFUS 表達水平在癌與癌旁進行差異分析，P＜0.05 被認為差異有統(tǒng)計學意義。使用c2.cp.kegg.v2022.1.Hs.symbols.gmt集合，采用基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）分析GFUS 高表達組和低表達組之間主要富集在的信號通路和表現(xiàn)的相應(yīng)生物學功能。

1.2.2 差異基因的篩選及共表達基因鑒定 使用limma R 包對腫瘤和正常組織之間的DEG 進行鑒定（FDR＜0.05 and |log2FC|＞1），得到在TNBC 中差異表達的基因。通過皮爾森相關(guān)性分析選擇得到共表達基因（閾值相關(guān)性系數(shù)在0.4 及P＜0.05）。

1.2.3 基因篩選與模型構(gòu)建 對差異共表達基因的表達量以及生存數(shù)據(jù)進行單變量Cox 比例風險回歸分析，利用R 包survival coxph function，選擇P＜0.05作為閾值得到預(yù)后顯著基因。通過Lasso 壓縮估計構(gòu)建模型：使用R 軟件包glmnet 進行l(wèi)asso cox 回歸分析，首先分析每個自變量的變化軌跡，隨著lambda 的逐漸增大而逐漸增加自變量系數(shù)趨于0 的個數(shù)，后使用5-fold 交叉驗證進行模型構(gòu)建，分析每個lambda 下的置信區(qū)間，最終當lambda=0.042 357 2時模型達到最優(yōu)，最終模型公式如下：

1.2.4 預(yù)后模型驗證 采用外部驗證來評估該模型的預(yù)測價值，外部驗證集和訓練集具有相同的模型和系數(shù)。同樣，每個樣本的風險得分由樣本的表達水平計算的而來。使用R 軟件包timeROC 對RiskScore進行預(yù)后分類的生存分析及受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）分析，分別分析3、5 年的預(yù)后預(yù)測分類效率。

1.3 統(tǒng)計學分析 R 軟件（R 版本：4.0.3）進行所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。Wilcoxon 檢驗用于連續(xù)變量分析，χ2檢驗用于分類數(shù)據(jù)分析。Kaplan-Meier 分析和Log-rank 檢驗用于生存差異計算。分析結(jié)果均以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 基于TCGA 數(shù)據(jù)分析GFUS 在TNBC 中的表達差異 從TCGA 數(shù)據(jù)庫中獲得的mRNA 水平顯示，癌旁正常組織中的GFUS 水平低于癌組織（P＜0.05），見圖1。

2.2 GFUS 在TNBC 中的高表達與較差預(yù)后相關(guān) 與GFUS 低表達患者相比，GUFS 高表達患者具有更差的總生存率（overall survival，OS）（P＜0.05），見圖2A。同樣，高表達GFUS 的TNBC 患者具有更差的無進展生存期（progress free survival，PFS）、無病生存期（disease free survival，DFS）及疾病特異性生存期（disease free survival，DSS）（P＜0.05），見圖2B～圖2D。

圖2 GFUS 高低表達組生存指標差異

2.3 GFUS 高低表達組的功能分析 運用GSEA 分析GFUS 高表達組和低表達組的基因主要富集的信號通路和生物學功能見圖3A～3F。結(jié)果表明，高表達組主要富集在RENIN_ANGIOTENSIN_SYSTEM、GLUTATHIONE_METABOLISM、OXIDATIVE_PHOS PHORYLATION 等通路；低表達組主要富集在SMALL_CELL_LUNG_CANCER、WNT_SIGNALING_PATHWAY、TGF_BETA_SIGNALING_PATHWAY 等通路。

圖3 基因集富集分析（GSEA）結(jié)果

2.4 疾病差異表達基因鑒定 為了進一步探索三陰性乳腺癌中差異表達的基因，使用limma R 包對腫瘤和正常組織之間的DEG 進行鑒定（FDR＜0.05 and|log2FC|＞1），得到3050 個基因，其中在腫瘤組織中上調(diào)基因共有1099 個，下調(diào)基因有1951 個，差異表達基因的火山圖見圖4A，上下調(diào)前100 個基因的表達熱圖間圖4B。

圖4 差異表達火山圖和熱圖

2.5 GFUS 共表達基因鑒定 為了進一步鑒定GFUS共表達基因，通過皮爾森相關(guān)性分析選擇閾值相關(guān)性系數(shù)在0.4 及P＜0.05，共得到340 個共表達基因，其中正相關(guān)基因有308 個，負相關(guān)基因有32 個，相關(guān)性散點圖見5A，相關(guān)性基因的表達熱圖見5B。

2.6 模型構(gòu)建 最終得到77 個差異共表達基因圖6A，對這77 個基因的表達量以及生存數(shù)據(jù)進行單變量Cox 比例風險回歸模型。利用R 包survival coxph function，選擇P＜0.05 作為閾值，最終得到了36 個預(yù)后顯著的基因。應(yīng)用Lasso [Least absolute shrinkage and selection operator,Tibshirani（1996）]方法進行壓縮估計并構(gòu)建模型，該算法可以進一步縮小基因范圍，同時保證較高準確率。使用R 軟件包glmnet 進行l(wèi)asso cox 回歸分析，首先對每一個自變量的變化軌跡進行分析，自變量系數(shù)趨于0 的個數(shù)隨著lambda 的逐漸增大而增多，接著使用5-fold 交叉驗證構(gòu)建模型，以分析每個lambda 下的置信區(qū)間。圖6B、圖6C 可以看出當lambda=0.042 357 2 時模型達到最優(yōu)，最終模型公式如下：

圖6 篩選構(gòu)建模型的相關(guān)基因

依據(jù)樣本的表達水平分別計算了每個樣本的風險得分，并繪制出樣本的RiskScore 分布。如圖7A所示，風險得分高的樣本OS 顯著低于得分較低的，這提示了高的RiskScore 樣本預(yù)后更差。4 個不同的signature 基因隨著風險值的增加表達情況發(fā)生變化，鑒定了GPLD1 的高表達和低風險相關(guān)，為保護因素；鑒定了GFUS、ATP6V0B、MFSD3 的高表達和高風險相關(guān)，為危險因素。根據(jù)RiskScore 中值將樣本劃分高低風險組，并繪制KM 曲線，如圖7B 所示，從中可以看出兩組差異及其顯著Log-rankp=0.004 59，HR=3.476（95%CI：1.469～8.229），其中80個樣本被劃分為高風險組，80 個樣本為低風險組；進一步使用R 軟件包timeROC 對CubScore 進行預(yù)后分類的ROC 分析，分別分析了1、3、5 年的預(yù)后預(yù)測分類效率，如圖7C 所示，從中可以看出模型具有很高的AUC 線下面積，在0.687 以上。

圖7 預(yù)測風險模型的構(gòu)建

2.7 外部數(shù)據(jù)驗證 采用和訓練集相同的模型和系數(shù)來實現(xiàn)外部驗證，以評估該模型的預(yù)測價值。外部驗證集中采用與訓練集相同的模型和相同的系數(shù)。根據(jù)樣本的表達水平來依次計算樣本的風險得分，使用R 軟件包timeROC 對RiskScore 進行預(yù)后分類的ROC 分析，對3、5 年的預(yù)后預(yù)測分類效率進行了分別分析，如圖8C 所示，從中可以看出該模型具有很高的AUC 曲線下面積，5 年的在0.68 以上，接下來對Riskscore 進行劃分高低分線，并繪制KM 曲線，從中可以看出他們存在極顯著的差異Log -rankp=0.0446，HR=2.137（95%CI：1.018～4.483），其中高風險組的樣本數(shù)為45 個，低風險組的樣本數(shù)為62 個，見圖8A、圖8B。

圖8 外部數(shù)據(jù)集驗證風險模型

3 討論

三陰性乳腺癌是一種具有侵襲性的乳腺癌亞型，因缺少特異靶向藥物，化療仍是當前的主要治療手段[11]。隨著精準醫(yī)學的發(fā)展，現(xiàn)已進入腫瘤管理的新時代。發(fā)現(xiàn)新的標志物對于提高TNBC 的診療效果有著重大意義。

癌細胞經(jīng)歷了新陳代謝的改變，以滿足對能量、構(gòu)建模塊和氧化還原電位的巨大需求。腫瘤即使在有氧氣的情況下也會表現(xiàn)出分泌葡萄糖和乳酸的行為，這一過程被稱為有氧糖酵解[12]。糖酵解是癌細胞代謝的支柱，而癌細胞已經(jīng)進化出各種機制來加強它。葡萄糖代謝與其他代謝途徑交織在一起，使癌癥代謝變得多樣化和異質(zhì)化，其中糖酵解發(fā)揮著核心作用[13]。致癌信號傳導加速了糖酵解酶的代謝活動，主要是通過增強其表達或翻譯后修飾。有氧糖酵解將葡萄糖發(fā)酵成乳酸，通過各種機制支持腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[14]。最新研究也證實[15]，糖酵解與腫瘤治療耐藥相關(guān)。已知糖酵解中間產(chǎn)物的積累可激活磷酸戊糖途徑產(chǎn)生NADPH。NADPH 的產(chǎn)生使癌細胞能夠維持足夠水平的還原性谷胱甘肽（GSH）。GSH 是一種關(guān)鍵的非酶抗氧化劑，通過維持氧化還原狀態(tài)以抵消化療藥物的作用，在保護癌細胞免受抗腫瘤藥物的侵害方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[16]。同時，對糖酵解依賴性的增加是腫瘤代謝重編程的重要特征，這一過程參與了腫瘤微環(huán)境與腫瘤免疫調(diào)節(jié)[17]。因此，靶向糖酵解過程不僅可以抑制腫瘤生長、遷移和侵襲，同時，有望通過抑制糖酵解來提高抗腫瘤免疫治療效果。

與其他亞型相比，三陰性乳腺癌更加依賴糖酵解過程[18]。缺氧時HIF-1α 水平升高也與有氧糖酵解增加有關(guān)，與非TNBC 細胞相比，HIF-1α 穩(wěn)定在TNBC 細胞中更常見。然而，HIF-1α 的穩(wěn)定并不局限于缺氧條件，在有氧條件下也能穩(wěn)定，這足以驅(qū)動常氧條件下的糖酵解。有研究發(fā)現(xiàn)[19]，50%在常氧條件下表現(xiàn)出HIF-1α 穩(wěn)定的癌細胞系是高度糖酵解和高侵襲性的。在常氧條件下HIF-1α 穩(wěn)定背后的機制來自于乳酸和丙酮酸（有氧糖酵解的最終產(chǎn)物）通過刺激HIF-1α 的積累來調(diào)節(jié)缺氧誘導的基因表達，即使是在缺氧獨立的條件下。Sadeghalvad M[20]等證實與ER+腫瘤相比，TNBC 中的丙酮酸和乳酸顯著增加；TNBC 與ER+腫瘤相比，幾乎所有糖酵解中間體都上調(diào)，這表明TNBC 糖酵解過程增加。

GFUS 作為參與糖酵解過程的關(guān)鍵基因，在多種腫瘤中高表達。本研究結(jié)果顯示：GFUS 在TNBC中的表達顯著高于正常組織，且這種高表達與不良預(yù)后密切相關(guān)。基因富集分析結(jié)果顯示：高GFUS表達組多參與腫瘤代謝過程。基于對GFUS 共表達基因篩選發(fā)現(xiàn)，GPLD1 的高表達和低風險相關(guān)，為保護因素；鑒定了GFUS、ATP6V0B、MFSD3 的高表達和高風險相關(guān)，為危險因素。將篩選出的基因構(gòu)建模型，根據(jù)該模型將TNBC 患者分為高低風險組。生存分析顯示出高風險組OS 顯著低于低風險組，提示GFUS、ATP6V0B、MFSD3 與TNBC 患者預(yù)后密切相關(guān)。風險評分可作為獨立預(yù)后因素。另外，該模型可以有效預(yù)測不同風險組中乳腺癌患者3、5年生存率。本研究尚有一定局限性，數(shù)據(jù)均來自TCGA 數(shù)據(jù)庫，在其他數(shù)據(jù)庫和臨床樣本中的驗證需進一步進行。

綜上所述，基于GFUS 構(gòu)建的預(yù)后模型可以很高的評估TNBC 患者預(yù)后，并可為TNBC 靶向治療藥物發(fā)展及增強免疫治療效果提供新思路。