轉染GKN2 基因對CD44（+）SGC7901胃癌干細胞的抑制作用

胡皓彬，凌 暉，蔡志宏，肖 萍，李艷春

（湖南省人民醫(yī)院/湖南師范大學附屬第一醫(yī)院病理科，湖南 長沙 410002）

胃癌（gastric cancer）的死亡率在惡性腫瘤中名列前茅，且逐年穩(wěn)步增長[1]。影響胃癌預后的因素有很多，如腫瘤干細胞（CSCs）與胃癌的預后較差有關[2]。CSCs 能促進癌細胞的生長與轉移，胃癌中同樣存在CSCs，即胃癌干細胞（GCSCs）[3，4]。GCSCs 的存在是胃癌難以根治的重要原因之一，因此越來越受到人們的關注。Takaishi S 等[5]最早發(fā)現(xiàn)CD44（+）的胃癌細胞具有干細胞特性，CD44（-）細胞的致瘤潛能更低。CD44 的表達與胃癌中的多種干細胞標志物有關，是調控細胞干樣特性的中心環(huán)節(jié)[6]。CD44 普遍應用于GCSCs 的分離鑒定。GKN2（gastrokines-2）是胃粘液分泌細胞系產(chǎn)生的一種分泌蛋白，其在胃癌中普遍表達減少或缺失[7]。有證據(jù)表明[8，9]，GKN2 缺失是胃癌發(fā)病機制之一，并提示恢復GKN2 表達可作為抑制胃癌進展的一個策略。可以推測，GKN2 在GCSCs 中可能同樣表達缺失，且恢復GKN2 的表達，對GCSCs 可能具有相似的抑制作用。為此，本研究用GKN2 高表達腺病毒載體轉染CD44（+）SGC7901 細胞，即胃癌樣細胞（GCSCs），驗證轉染前后GCSCs 中GKN2 的表達，同時通過檢測其增值、遷移、侵襲的影響，評估GKN2 對GCSCs 的抑制作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人胃癌SGC7901 細胞株為南華大學腫瘤研究所保存并友情提供。人CD44 免疫磁珠及MiniMACS 分選器（Miltenyi 公司），Alexa Fluor?488 anti-mouse/human CD44（Biolegend 公司），載體：Ad-GFP-GKN2 表達載體和Ad-GFP 空載體（漢恒生物科技有限公司），iBindTM儀器、iBindTM溶液試劑盒和iBindTM卡片（Life 公司），抗體：兔抗人GKN2單克隆抗體、兔抗人β-actin 單克隆抗體、二抗羊抗兔IgG-HRP（abcam 公司），CCK-8 試劑盒（日本同仁供應，貨號為ck04），Transwell 小室及Matrigel 基質膠（Corning 公司）。

1.2 方法

1.2.1 SGC7901 細胞培養(yǎng)及免疫磁珠細胞分選（MACS）①取SGC7901 細胞，加入5 ml 含10%～15%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，放入含5% CO2以及較高相對飽和濕度（95%）的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，細胞融合度達80%以上時可進行傳代。②將SGC7901 貼壁細胞用4 ℃預冷的AutoMACS緩沖液制成細胞密度為1×107個/ml 的懸液后離心，每1×107個細胞加80 μl 緩沖液及20 μl CD44 免疫磁珠于4 ℃孵育15 min，加500 μl 緩沖液重懸。安裝MiniMACS 分選器，往MS 柱加入細胞懸液，CD44（-）細胞會自然流出，而CD44（+）細胞則吸附于MS 柱中。取下MS 柱，于柱中加入1 ml 緩沖液，用所配備的活塞非常快速果斷地推下，流出的即為CD44（+）細胞。將分選出的CD44（+）SGC7901 細胞用無血清培養(yǎng)基（SFM）放入恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。③使用Alexa Fluor?488 anti-mouse/human CD44 免疫熒光抗體檢測SGC7901 細胞分選后CD44 的表達情況。

1.2.2 CD44（+）SGC7901 細胞瞬時轉染，Western Blot驗證轉染前后GKN2 的表達 ①腺病毒轉染：取生長狀態(tài)良好的CD44（+）SGC7901 細胞，進行腺病毒轉染：加入Ad-GFP-GKN2 過表達載體或Ad-GFP空載體，將細胞分為未轉染組、空載體組和GKN2 高表達組，轉染后用SFM 培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。②Western Blot 檢測：提取各組細胞總蛋白，取少量蛋白進行BCA 蛋白定量，其余進行加熱變性。取20 μl 每孔樣品，進行SDS-PAGE 電泳及轉膜，然后使用iBind 蛋白質印跡處理系統(tǒng)順次完成封閉、孵一抗、孵二抗和清洗步驟，整個過程自動完成。最后ECL 顯影、拍照，最后用AlphaImager2200 軟件進行結果分析。

1.2.3 CCK-8 增殖實驗 取生長狀態(tài)良好的未轉染組、空載體組、GKN2 高表達組細胞，制成細胞細胞密度為2.5×105個/ml 的懸液，種于96 孔板，每孔種100 μl，每組設6 個復孔，另設一組只加100 μl SFM培養(yǎng)基的空白孔組，余孔每孔用100 μl PBS 補齊。設3 塊復板，分別培養(yǎng)24、48、72 h 后，每孔中加入CCK8 溶液10 μl，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 h 后使用酶標儀測450 nm 處的OD 值，并計算GKN2 高表達組抑制CD44（+）SGC7901 細胞生長的抑制率。

1.2.4 Transwell 遷移實驗 取生長狀態(tài)良好的3 組細胞，用不含血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基重懸，調節(jié)細胞濃度至1×106個/ml，往Transwell 上室中加入150 μl 細胞懸液，24 孔板中加入700 μl 含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基作為下室，將上室放在下室上，放入含5% CO2以及較高相對飽和濕度（95%）的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，取出小室，4%多聚甲醛固定15～30 min，結晶紫染液染色20 min，顯微鏡下拍照，取5 個視野，計數(shù)。

1.2.5 Transwell 侵襲實驗 Matrigel 基質膠與不含血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基按1∶5 的比例混合（冰上操作），往Transwell 上室中加入40 μl 基質膠，細胞培養(yǎng)箱中靜置2 h，待其形成薄層凝膠收集各組細胞，余后步驟與Transwell 遷移實驗相同。

1.3 統(tǒng)計學方法 將所得實驗數(shù)據(jù)用統(tǒng)計學軟件SPSS 20.0 分析，計量資料（±s）表示，比較采用t檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫熒光檢測分選前后SGC7901 細胞膜CD44表達情況 使用CD44 熒光抗體孵育后，細胞膜表面表達綠色熒光的即為CD44 陽性細胞。結果顯示，未分選的SGC7901 細胞可見少量陽性細胞；而分選后CD44（+）SGC7901 細胞數(shù)目大量增加，分選成功，所得CD44（+）SGC7901 細胞為GCSCs，見圖1。

圖1 免疫熒光檢測分選前后SGC7901 細胞膜CD44 的表達情況

2.2 Western Blot 驗證轉染前后GKN2 的表達 Ad-GFP-GKN2 轉染GCSCs 細胞48 h 后檢測其轉染前后蛋白表達。GKN2 高表達組中GKN2 的表達量增加，證明GKN2 轉染成功，同時證明GCSCs 細胞中GKN2 的表達缺失，見圖2。

圖2 Western Blot 檢測3 組GCSCs 細胞中GKN2 蛋白的表達

2.3 CCK8 增殖實驗結果 3 組450 nm 處的OD 值（OD450）見表1，轉染后不同時間點GKN2 高表達組OD450 均低于未轉染組及空載體組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。且隨著時間的增加，抑制率（與空載體組對比）呈現(xiàn)增高的趨勢。GKN2 高表達能抑制GCSCs 的增殖，且在轉染后96 h 內，抑制率與時間呈正相關。

表1 3 組于轉染后不同時間后的OD450 值（±s）

表1 3 組于轉染后不同時間后的OD450 值（±s）

注：與未轉染組及空載體組比較，*P＜0.05

2.4 Transwell 遷移實驗結果 Transwell 下室中含有的血清可以促使GCSCs 從上室往下室遷移，見圖3；血清使GCSCs 分化為貼壁的SGC7901 細胞，并且細胞會被結晶紫染成紫色，顯微鏡下計數(shù)被染色的細胞數(shù)，GKN2 高表達組低于未轉染組及空載體組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖3 GKN2 對GCSCs 遷移能力的影響

2.5 Transwell 侵襲實驗結果 細胞穿過基質膠進入下室的過程可模擬細胞對組織的侵襲行為，進入下室的GCSCs 分化為貼壁癌細胞并被結晶紫染色。結果顯示，GKN2 高表達組低于其余兩組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 GKN2 對GCSCs 侵襲能力的影響

3 討論

近代觀點認為，惡性腫瘤擁有的無限增殖能力以及易于復發(fā)的特性，與腫瘤干細胞（CSCs）的存在密切相關。CSCs 只占整個腫瘤中的一小部分，卻與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移以及復發(fā)等行為有著密不可分的關系[10-12]。研究CSCs 的前提是將其從腫瘤組織中分離出來并對其進行鑒定。目前免疫磁珠（MACS）法和流式細胞術較為常用，通過細胞表面標志物進行細胞分選，如CD44、CD24、CD133、EpCAM 等。而CD44 是其中最常用的，也是被認為最關鍵的GCSCs 標志物[6，13]。本研究選用CD44 作為分選標準，采用MACS 法，從胃癌細胞系SGC7901中分離出CD44（+）的細胞，再用免疫熒光法驗證分選是否成功，同時也驗證GCSCs 只占腫瘤中的一小部分這一理論。

GKN2 均屬于胃動蛋白家族——“gastrokines”（GKNs）成員，該家族是一種胃黏膜產(chǎn)生的分泌蛋白，目前包含3 個成員：GKN1、GKN2 和GKN3。GKN1 和GKN2 都被認為在維持胃粘膜動態(tài)平衡、抑制胃腸道腫瘤方面起著重要作用[14]，與胃癌的發(fā)生密切相關。本研究主要探討GCSCs 與GKN2 的關系。Western Blot 結果顯示GCSCs 中GKN2 的表達幾乎缺失，說明GCSCs 與其余多種胃癌細胞系一樣，GKN2 的表達顯著降低，這提示GKN2 的表達水平可能從干細胞水平就開始改變，再經(jīng)過一系列的調控機制，最終導致了胃癌的發(fā)生。因此，研究GCSCs 中GKN2 表達量的改變有較大的意義。前期研究也已證實，GKN2 高表達可抑制人胃癌MKN28 細胞的增殖、遷移和侵襲[15]。而GCSCs 作為腫瘤惡性行為的“罪魁禍首”。本研究選用轉染效率高、轉染速度快的GKN2 過表達腺病毒載體，對GCSCs 進行瞬時轉染，并使用Western Blot 證實轉染后GKN2 的表達水平大幅度增加，說明瞬時轉染成功。CCK8 增殖實驗結果表明GKN2 能抑制GCSCs 的生長，且其抑制作用在96 h 內與時間成正相關。該結果為研究GKN2 與GCSCs 間的作用關系創(chuàng)造了前提。研究表明，CSCs 的遷移侵襲能力較強，且與腫瘤組織的侵襲性密切相關，GCSCs 作為CSCs 中的一大類也同樣如此[16-19]。總之，GKN2 能抑制胃癌細胞的侵襲性，而GCSCs 又在胃癌的侵襲性中起著重要作用，為此，本研究采用Tanswell 法觀察了GKN2 高表達對GCSCs 遷移及侵襲的影響。由于GCSCs 為不貼壁細胞，為了便于觀察，本次在下室中加入10%胎牛血清，使穿過小室的GCSCs 分化為貼壁的胃癌細胞。結果顯示，GKN2 高表達組穿過小室的細胞數(shù)目減少，這說明GKN2 高表達能顯著抑制GCSCs 的遷移及侵襲。GKN2 的缺失會使其伴侶蛋白：TFF1，失去其抑制胃癌侵襲和轉移的作用[20，21]，而其具體機制，則有待進一步探究。

目前，腫瘤的治療已逐漸進入分子靶向階段，尋找有效的基因靶點，針對性的抑制惡性腫瘤的生長，是人們所追求的目標。許多研究表明，GKN2 對胃癌有抑制作用，本研究亦證實，GKN2 能夠抑制GCSCs。盡管GKN2 已發(fā)現(xiàn)多年，但其抑制胃癌的具體機制依然未有完全闡明，仍有很高的研究價值，對其進行更深入的探索與研究，可能為臨床治療胃癌開拓新的方向。