核桃分心木水提物對腎陽虛大鼠尿17-OHCS、SOD及睪酮的影響

劉鵬 王震 王英 胡本祥

【摘要】? 目的? 分析核桃分心木水提物對腎陽虛模型大鼠尿17-羥皮質類固醇（尿17-OH-CS）、超氧化物歧化酶（SOD）、睪酮（T）的影響。方法? 取40只雄性SD大鼠，根據隨機數字表法分為假手術對照組（A組）、腎陽虛模型對照組（B組）、核桃分心木水提物治療組（C組）及青蛾丸治療對照組（D組）。采用切除SD大鼠雙側腎上腺的3/4方法構建腎陽虛模型大鼠。術后4周，C組大鼠灌胃給予核桃分心木水提物，D組大鼠灌胃給予青蛾丸混懸液，A組和B組給予等容量的生理鹽水，灌胃4周。觀測大鼠一般狀態、體溫和尿17-OHCS含量、血清SOD、睪酮含量。結果? 兩兩比較結果顯示，C組和D組大鼠的體溫、尿17-OHCS含量、血清SOD及睪酮含量明顯高于B組，但低于A組，差異均有統計學意義（P<0.05）；而各項指標C組低于D組，差異均有統計學意義（P<0.05），表明核桃分心木水提物和青蛾丸均能改善大鼠腎陽虛癥狀，并且核桃分心木水提物的需要大于核桃分心木水提物。結論? 核桃分心木水提物可以有效改善腎陽虛模型大鼠腎陽虛癥狀。

【關鍵詞】? 核桃分心木；水提液；超氧化物歧化酶；睪酮

中圖分類號? R285? ? 文獻標識碼? A? ? 文章編號? 1671-0223（2024）01--05

Effects of aqueous extract of walnut distractor on 17-OHCS， SOD and testosterone in rats with kidney yang deficiency Liu Peng， Wang Zhen， Wang Ying， Hu Benxiang. Shangluo Vocational and Technical College， Shangluo 726000， China

【Abstract】? ? Objective? To analyze the effects of water extract of walnut tree on urinary 17-hydroxycorticosteroids （urinary 17-OH-CS）， superoxide dismutase （SOD） and testosterone （T） in rats with kidney-yang deficiency model. Methods? Forty male SD rats were randomly divided into sham operation control group （group A），kidney yang deficiency model control group （group B），walnut distractor water extract treatment group （Group C） and qingmoth pill treatment control group （Group D）.Three quarters of bilateral adrenal glands of SD rats were excised to construct the model rats of kidney yang deficiency.Four weeks after operation， the rats in group C were given walnut distractor water extract by gavage，the rats in group D were given qingmoth pill suspension by gavage，group A and group B were given equal volume normal saline by gavage for four weeks.The general state， body temperature，urinary 17-OHCS content，serum SOD and T content were observed. Results? The results showed that the body temperature， urinary 17-OHCS content， serum SOD and testosterone contents of rats in group C and group D were significantly higher than those in group B， but lower than those in group A， with statistical significance （P<0.05）. The indexes in group C were lower than those in group D， and the differences were statistically significant （P<0.05）， indicating that both the water extract of walnut and Qingmoth pills could improve the symptoms of kidney-yang deficiency in rats， and the need of water extract of walnut and walnut was greater than that of walnut and walnut. Conclusion? The water extract of walnut distractor can effectively improve the symptom of kidney-yang deficiency model rats.

【Key words】? Walnut distractor; Water extract; Superoxide dismutase; Testosteron

核桃分心木為胡桃科植物胡桃（juglans regia L）果實之間的呈蝴蝶形狀的木質間隔，又稱核桃隔、胡桃衣。分心木呈薄片狀，多彎曲，破碎而不整齊。表面淡棕色至棕褐色，或棕黑色，略有光澤。質脆，易折斷，以塊大、質薄、色黃為佳。性味苦、澀，平。歸脾、腎經。功效：澀精縮尿，止血止帶，止瀉痢。據《全國中草藥匯編》記載，其具有“補腎澀精，主治腎虛遺精、滑精、遺尿”之功效。根據中醫理論，腎虛遺精、滑精、遺尿均為腎陽虛之表現。故核桃分心木多與腎陽虛征有著密切的聯系[1]。

在我國，核桃種植歷史悠久，核桃產業發展迅速。據統計，隨著不斷增多的核桃深加工產品和不斷增長的核桃需求，到2021年核桃在我國市場需求量將達到648.57萬噸[2]。核桃分心木作為核桃產業加工的副產品，主要被用作燃料或丟棄，造成巨大浪費，且污染環境。本研究將核桃分心木水提物用于腎陽虛大鼠模型，觀察其一般狀態、體溫和尿17-羥皮質類固醇（17-OHCS）含量，血清中超氧化物歧化酶（SOD）及睪酮（T）的含量，探究核桃分心木水提物的作用效果及作用機制。

1? 材料與方法

1.1? 實驗動物

成年健康SD雄性大鼠40只，體質量200±20g，由西安交通大學動物實驗中心提供，動物合格證編號：SCXK（陜）2021-011。將大鼠適應性飼養（大鼠飼養條件：溫度控制在20～25℃，濕度控制在40%～70%，標準飼料購于西安交通大學動物實驗中心）1周后，根據隨機數字表法分為假手術對照組（A組）、腎陽虛模型對照組（B組）、核桃分心木水提物治療組（C組）及青蛾丸治療對照組（D組）。

1.2? 試劑、藥物及設備

核桃分心木，購自陜西商洛。17-羥皮質類固醇（17-OHCS）放免檢測試劑盒，上海聯祖生物科技有限公司；SOD-ELISA試劑盒，T（睪酮）試劑盒，上海酶聯生物科技有限公司；水合氯醛，青島宇龍海藻有限公司，批號： H37022673；0.9%氯化鈉注射液，四川科倫藥業股份有限公司，批號： H51021158；5%葡萄糖氯化鈉注射液，四川科倫藥業股份有限公司，批號： H20043867；甲醇（色譜純）、三氟乙酸（色譜純），美國 BCL公司；蒸餾水。

ZH-DXL型大鼠代謝籠，安徽正華生物儀器設備有限公司；GC-1200型自動放免儀，安徽中科中佳科學儀器有限公司；英展TCS-W-300電子秤，江蘇昆山托普泰克電子有限公司；MT-601C型電子體溫計，杭州廣發電子技術有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀廠；SCIENTZ-18N真空冷凍干燥機，山東博科生物產業有限公司；高速離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；美國Waters1525高效液相色譜儀；美國Agilent1290Infinity液相色譜儀；美國Agilent 6540 UHD accurate mass Q-TOF-MS質譜儀，配有電噴霧電離（ESI）離子源，Agilent MassHunter工作站；Agela Venusil XBP-C18色譜柱，Agela科技有限公司；Zorbax? Eclipse? PlusC18色譜柱，Agilent科技有限公司；伯樂T100梯度PCR儀，美國伯樂公司。

1.3? 實驗方法

1.3.1? 核桃分心木水提物的準備? 取干燥的核桃分心木，粉碎至100～200目，稱量20.0g放置于500ml錐形瓶中，加入400ml蒸餾水，瓶口密封置于陰涼處靜置12h，浸提得到核桃分心木水提液。水提液及剩余的粉末均在4℃下冷藏備用。將水提液離心分離（15000r/min），取上清液，上清液經旋轉蒸發儀進行濃縮（條件為負壓下40℃），將濃縮液經真空冷凍干燥得到分心木水提物干粉。

1.3.2? 采用高效液相色譜-串聯飛行時間質譜分析核桃分心木水提液化學成分? 將上述提取物置于容量瓶中，加水定容，配置成濃度為5mg/ml的溶液，采用0.45μm濾膜過濾。樣品溶液在4℃下冷藏備用。利用高效液相色譜-串聯飛行時間質譜分析核桃分心木水提液化學成分，具體方法同李平等[3]。

1.3.3? 動物造模及給藥? 取健康SD大鼠40只，經適應性飼養1周。B、C、D組大鼠實驗前8小時禁食、禁飲。經10％水合氯醛（0.3ml/100g體重）腹腔注射麻醉后，俯臥，背部剪毛，備皮后采用0.5%碘伏進行局部皮膚消毒。在胸椎及腰椎交界處，沿背部正中線縱向向下切開皮約3cm，先使動物右側臥位，在左側肋緣與脊柱交界處，縱行剪開薄層腰大肌，切口約2cm，用血管鉗交替分離，以顯露大鼠左側腎臟，切口下腎臟呈深紅色。腎臟上方的腹后壁脂肪中呈淺黃色的組織即腎上腺，用蛟式血管鉗將周圍脂肪組織分離開，用眼科剪刀剪下腎上腺的3/4，給予明膠海綿壓迫止血，經檢查無出血后間斷縫合腰大肌筋膜。再使動物向左側臥，采用同樣方法切除右側腎上腺的3/4。縫合腰大肌筋膜及背部皮膚，碘伏消毒。A組大鼠除不切除腎上腺外，其它手術過程同B、C、D組。術后連續5d在傷口處涂以紅霉素藥膏，并每只每天注射20萬單位青霉素以預防感染。術后第1天飼養于用刨花作墊料的塑料鼠盒中，室溫保持在21～25℃，5%葡萄糖氯化鈉注射液代替飲水。術后第2天獨籠飼養于大鼠籠內，常規飼料，5%葡萄糖氯化鈉注射液代替飲水。繼續飼養4周。C組大鼠：給予核桃分心木水提物（高劑量200mg/kg[4]）制成核桃分心木水提物液1ml，每天清晨9∶00灌胃。D組大鼠：給予青蛾丸（80mg/200g·d[5]）制成青蛾丸混懸液1ml，每天清晨灌胃。A組（假手術組）和B組（模型組）大鼠給予等容量的生理鹽水灌胃。灌胃4周。

1.4? 檢測指標

（1）體溫：用電子體溫計每日清晨8∶00依次測量大鼠體溫。

（2）尿17-羥皮質類固醇（尿17-OH-CS）水平：于灌胃4周后清晨8∶00將大鼠依次置于相應標記的代謝籠內至次日清晨8∶00，收集24h尿液，滴加防腐劑0.1ml/10ml防腐，－20℃保存，采用放射免疫法檢測尿17-OH-CS含量。

（3）超氧化物歧化酶（SOD）、睪酮（T）含量：于實驗最后1天，麻醉大鼠后，心臟快速采血，離心后嚴格按照SOD-ELISA試劑盒及T試劑盒說明檢測大鼠血清中SOD、T的含量。

1.5? 數據處理方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析。計量資料以“±s”的形式表示，多組間均數比較采用多因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；計數資料組間率比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1? 核桃分心木水提物化學成分

采用高效液相色譜-串聯飛行時間質譜對核桃分心木水提物進行定性分析，結合質譜信息和相關參考文獻數據，共計鑒定出4種化合物的結構，分別為沒食子酸、兒茶素、槲皮苷和鞣花酸。

2.2? 核桃分心木水提物對腎陽虛大鼠模型的影響

實驗大鼠在術后2h內蘇醒，手術傷口基本不影響大鼠爬行及飲食。術后1周，實驗大鼠傷口干燥，傷口皮膚開始愈合；術后2周，實驗大鼠傷口皮膚愈合，開始長出新毛，手術組較假手術組大鼠體毛生長緩慢；術后3周，除手術組個別大鼠外，體毛能夠均勻覆蓋手術切口。術后4周，手術組大鼠出現精神不振、喜蜷臥、反應遲鈍、活動減少，體毛稀疏、干枯無光澤，豎毛等表現，提示腎陽虛大鼠模型造模成功。假手術組大鼠一般情況良好，活動較多且反應靈敏，體毛濃密有光澤，大便呈顆粒狀。治療過程中，核桃分心木水提物治療組及青蛾丸治療對照組大鼠一般情況均逐漸好轉，較模型組反應靈敏，體毛較密、有光澤。

2.3? 核桃分心木水提物對大鼠體溫和尿17-OHCS含量的影響

灌胃4周后，四組大鼠體溫及尿17-OHCS含量比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；其中A組大鼠的體溫及尿17-OHCS含量最高，而B組最低。兩兩比較結果顯示，C組和D組大鼠的體溫及尿17-OHCS含量明顯高于B組，但低于A組，差異均有統計學意義（P<0.05）；而C組低于D組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。表明，核桃分心木水提物和青蛾丸均能改善大鼠腎陽虛癥狀，但核桃分心木水提物的作用更加突出。

2.4? 核桃分心木水提物對大鼠SOD活性影響

灌胃4周后，四組大鼠SOD活性比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；其中A組大鼠的SOD活性最高，而B組最低。兩兩比較結果顯示，C組和D組大鼠的SOD活性高于B組，但低于A組，差異均有統計學意義（P<0.05）；而C組低于D組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表2。表明，核桃分心木水提物和青蛾丸均能提高大鼠SOD活性，但核桃分心木水提物的作用優于青蛾丸。

2.5? 核桃分心木水提物對大鼠睪酮含量的影響

灌胃4周后，四組大鼠睪酮含量比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；其中A組大鼠的睪酮含量最高，而B組最低。兩兩比較結果顯示，C組和D組大鼠的睪酮含量高于B組，但低于A組，差異均有統計學意義（P<0.05）；而C組低于D組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表3。表明，核桃分心木水提物和青蛾丸均能提高大鼠睪酮含量，但核桃分心木水提物的作用優于青蛾丸。

3? 討論

腎陽虛證為中醫名詞術語，是由于腎陽虛衰、溫煦失職、氣化失權所表現的一類虛寒證候，稱為腎陽虛證。多由素體陽虛，或年老腎虧，或久病傷腎，以及房勞過度等因素引起。腎陽虛證屬于中醫理論體系中的重要證候之一，臨床表現多樣，如神疲乏力、畏寒怕冷、四肢發涼、腰膝酸痛、性功能減退、小便清長、余瀝不盡、夜尿頻多等。中醫提出腎陽虛證發生的命門學說，即腎為先天之本，腎中寓真陰真陽，腎陽主一身之陽氣，命門火衰則陽虛之證迭出。陽虛證為諸多病癥的根源所在，因此一直備受醫學界關注[6]。有研究證明，腎陽虛證與神經內分泌功能關系密切。沈自尹[7]采用中西醫結合的方法治療腎陽虛證時，發現患者24h尿17-OHCS含量普遍低下，經補腎后其值有所提高。并有研究發現腎陽虛與現代醫學的神經內分泌免疫系統有關，腎陽虛證在下丘腦-垂體-靶腺（腎上腺皮質、甲狀腺、性腺、胸腺）軸均有不同環節、不同程度的功能紊亂，且主要發病環節在下丘腦（或更高級中樞）的調節功能紊亂。這也是目前認為造成腎陽虛證的主要病機。中醫認為陽氣有溫煦機體的功能，腎陽為一身陽氣之根本。腎陽虛，則溫煦功能減弱，機體產熱減少，表現為怕冷，喜蜷臥，客觀指標上則體溫偏低。尿17-OHCS是反映下丘腦-垂體-腎上腺軸功能的客觀指標，是沈氏等經過臨床實踐和深入基層進行一定數量調查后所得出的結論[8]，是腎陽虛證的特異性指標。

SOD又稱超氧化物歧化酶，能消除生物體在新陳代謝過程中產生的有害物質，其具有特殊的生理活性，是生物體內清除自由基的首要物質。對人體不斷地補充SOD具有抗衰老的效果。SOD在生物體內的水平高低意味著衰老與死亡的直觀指標。睪酮主要由睪丸分泌，是主要的男性性激素及同化激素，對人體健康有重要的影響，主要包括增強性欲、力量、免疫功能、對抗骨質疏松癥等功效。哺乳動物和人在代謝過程中睪丸中可生成一定程度受控的自由基，它與精子的生理功能有關，當自由基的產生超出了抗氧化系統的清除能力時，則會攻擊精子，對精子及生物大分子產生各種毒性作用，影響睪丸的生精功能[9]。男性的睪丸受氧化損傷時常伴隨有腎陽虛癥狀[10]。同時睪酮缺乏是男性腎陽虛發生的重要原因[11]。本實驗證實，腎陽虛大鼠SOD活性降低，睪酮含量下降。而在應用核桃分心木水提物灌胃后，SOD活性增強，睪酮含量升高。提示核桃分心木水提物可以有效對抗氧化損傷，有效改善腎陽虛癥狀。

本實驗采用高效液相色譜-串聯飛行時間質譜對核桃分心木提取液進行定性分析，結合質譜信息，以及相關參考文獻數據，共計鑒定出4種化合物的結構，分別為沒食子酸、兒茶素、槲皮苷和鞣花酸，結果與文獻報道相一致[3]。其中沒食子酸（化學名稱：3，4，5-三羥基苯甲酸，分子式：C7H6O5）是一種多酚類有機化合物，廣泛存在于大葉桉、掌葉大黃、山茱萸等植物中，在食品、生物、醫藥、化工等領域有廣泛的應用。沒食子酸是天然多酚類物質，具有抗突變、抗炎、抗病毒、抗自由基、抗氧化等多種生物學活性；同時沒食子酸具有抗腫瘤作用，小劑量沒食子酸抑制ras癌基因信號活化和免疫調節的作用，但其抗腫瘤作用具體機制不明[12]；對肝臟具有保護作用，可以抵抗四氯化碳誘導的肝臟生理和生化的轉變，可通過抑制內皮NO的生成誘導血管內皮依賴性收縮和對內皮依賴性松弛 [13]。兒茶素（分子式：C15H14O6）系從茶葉等天然植物中提取出來的一類具有高活性的類黃酮的總稱，具有抗氧化、抗病菌、抗腫瘤以及保護心腦器官等多種藥理作用。兒茶素可降低血中膽固醇及低密度脂蛋白，并增加高密度脂蛋白的含量，對人體脂肪代謝以及脂肪分布，特別是內臟脂肪的減少有著明顯的作用。兒茶素可以改變腸道微生物的分布，具有整腸作用。兒茶素還具有抑制血壓及血糖、抗輻射及抗突變、抗紫外線等功用[14]。槲皮苷是一種廣泛存在于植物中的黃酮類單體化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂等多種藥理作用。槲皮苷具有一定的抗炎活性，主要表現為致炎性因子的抑制作用。槲皮苷對中樞神經系統有抑制作用，具有鎮靜催眠作用。此外，槲皮苷還有止血、防治基因突變性疾病的作用[15]。鞣花酸是廣泛存在于各種軟果、堅果等植物組織中的一種天然多酚組分，鞣花酸對化學物質誘導癌變及其他多種癌變有明顯的抑制作用，特別是對結腸癌、肺癌、肝癌、食管癌、舌及皮膚腫瘤等有很好的抑制作用。鞣花酸具有多種生物活性功能，例如抗氧化功能、抗癌、抗突變性能、對人體免疫缺陷病毒的抑制作用。除此之外，鞣花酸還是一種有效的凝血劑，對多種細菌、病毒都有很好地抑制作用，能保護創面免受細菌的侵入，防止感染，抑制潰瘍。同時經研究發現，鞣花酸還具有降壓、鎮靜作用。通過本次對核桃分心木提取液的化學分析，也與文獻報道核桃分心木具有鎮靜催眠、降血糖、抗炎、抗菌、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等作用相一致。

本實驗證實核桃分心木提取液及青蛾丸均可明顯改善腎陽虛模型大鼠的體表溫度，尿中排出17-OH-CS增多，SOD活性增強，睪酮含量升高，提示腎陽虛癥狀明顯改善，這與核桃分心木提取液中的沒食子酸、兒茶素、槲皮苷和鞣花酸等成分密切相關。這些成分可以緩解下丘腦-垂體-靶腺功能的紊亂，達到調節神經內分泌作用，抗氧化損傷，同時發揮增強免疫功能、防止蛋白質代謝紊亂、防基因突變、促進能量及細胞代謝作用，最終達到全面緩解腎陽虛癥狀，促進痊愈。

通過實驗研究證明， 核桃分心木提取液可以明顯改善腎陽虛模型大鼠癥狀。這為下一步將核桃分心木用于腎陽虛患者及亞健康人群的保健茶飲，提供了一定的實驗依據。

4? 參考文獻

[1] 王艷，迪麗達爾·馬合木提，韓艷春，等.維吾爾藥核桃分心木不同提取物對腎陽虛模型小鼠的實驗研究[J].新疆醫科大學學報，2012，35（2）：153-157.

[2] 曾詩榆，蘇薇薇，王永剛.核桃分心木的研究進展[J].藥學研究，2021，40（8）：524-525.

[3] 李平.核桃分心木水提液化學成分及抗腫瘤活性分析[D].太原：山西大學，2017：25-33.

[4] 侯登勇，張建，何穎，等.核桃分心木水提物抗疲勞作用研究[J].中國食物與營養，2021，27（9）：73-77.

[5] 賀石林，王鍵，王凈凈.中醫科研設計與統計學[M].長沙：湖南科學技術出版社，2005：48-49.

[6] 黃黎明，梁恒.運用蛋白質組學方法研究腎陽虛異病同證的思路方法[J].上海中醫藥雜志，2005，39（5）：44-46.

[7] 沈自尹.腎陽虛證的定位研究[J].中國中西醫結合雜志，1997，17（1）：50-52.

[8] 李廣曦.腎陽虛證動物模型的造模方法及其相關指標回顧[J].中國中醫基礎醫學雜志，2000，6（4）：46-55.

[9] 張丹，朱慶均.腎陽虛小鼠睪丸NO、NOS、MDA、SOD變化的實驗研究[J].中國中醫藥科技，2009，16（2）：84.

[10] 張朝昱，張先，趙鵬，等.寒蔥提取物對腎陽虛大鼠SOD、MDA及睪丸組織的影響[J].延邊大學農學學報，2019，41（1）：68.

[11] Archibong Ae， Ramesh A， Niaz Ms. Effects of benzo（a）pyreneonintra-testicular? function? in? F-344? rats[J].Int J? Environ Res lth，public health，2008，5（1）：32-40.

[12] Tsai Cl， Chiu Ym， Ho Ty， et al.Gallic acid inducesapoptosis in human gastric adenocarcinoma cells[J].Anticancer Res，2018，38（4）：2057-2067.

[13] Anand Kk， Singh B， Saxena Ak， et al.3，4，5-Trihydroxy benzoicacid（gallicacid） the hepatoprotective principle in the fruits of Terminalia belerica-bioassay guided activity[J].Pharmacol Res，1997，36（4）：315-320.

[14] 華瓊.茶多酚片改善原發性腎病綜合征患者血液流變學臨床觀察[J].河南中醫藥學刊，1997，12（5）：47-48.

[15] 楊琳.槲皮苷藥理活性研究進展[J].亞太傳統醫藥，2015，11（6）：61-63.

[2023-04-17收稿]