二甲雙胍通過AMPK/Sirt1信號(hào)通路延緩心肌細(xì)胞衰老

余 星 劉文熾 肖婧雯 張 彥

1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州市第一醫(yī)院心內(nèi)科，福建福州 350004；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院創(chuàng)傷外科，福建福州 350004

衰老是生物體結(jié)構(gòu)和功能隨著年齡的增長而下降的一種自然過程，心臟重量隨著年齡的增長而增加，而心肌細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，這種功能性心臟細(xì)胞的持續(xù)喪失伴隨著再生活動(dòng)的下降[1]。心肌細(xì)胞的衰老伴隨著心肌收縮力降低，自噬功能及抗應(yīng)激能力不斷下降，最終引起心功能障礙[2-3]。近年來，延緩心肌細(xì)胞衰老作為預(yù)防心血管疾病的潛在靶點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。二甲雙胍是治療2 型糖尿病的一線首選藥物[4]，其除了具有降糖作用外，在干預(yù)衰老的幾個(gè)關(guān)鍵通路中具有獨(dú)特的地位[5]，使用二甲雙胍可降低衰老相關(guān)疾病（包括癌癥和心血管疾病）的全因病死率[6]。Xia 等[7]發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞衰老，從而緩解5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的小鼠腸道損傷。AMP 活化蛋白激酶[adenosine 5’-monophosphate （AMP）-activated protein kinase，AMPK]是許多細(xì)胞途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在防治衰老方面起著至關(guān)重要的作用。二甲雙胍可激活心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞的AMPK，從而保護(hù)心血管。沉默信息調(diào)節(jié)劑2 相關(guān)酶1（sirtuin1，Sirt1）是一種NAD+依賴性脫乙酰酶，參與細(xì)胞周期調(diào)控、炎癥、自噬和衰老等大量生物過程，在預(yù)防人類各種疾病方面發(fā)揮著重大作用。但目前有關(guān)二甲雙胍是否對(duì)衰老心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用及AMPK/Sirt1 在其中發(fā)揮的作用并無確切研究。本研究通過觀察潛在抗衰老藥物二甲雙胍對(duì)百草枯誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞衰老的影響以及AMPK/Sirt1 信號(hào)通路在其中的作用，探討二甲雙胍的心臟保護(hù)作用，以期為心臟衰老的防治提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

HL-1 心肌細(xì)胞系（武漢普諾賽科技公司）；二甲雙胍、β-半乳糖苷酶活性檢測試劑盒（北京索萊寶科技公司）；百草枯（阿拉丁公司）；活性氧檢測試劑盒（江蘇碧云天生物公司）；β-actin 抗體、Anti-AMPK 抗體、Anti-Sirt1 抗體（abcam 公司）。超凈工作臺(tái)（北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司）；流式細(xì)胞儀（BD 公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；電泳槽（美國BioRad 公司）；化學(xué)發(fā)光儀（美國Thermo 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HL-1 心肌細(xì)胞，培養(yǎng)條件為DMEM+10%FBS+1%P/S，置于5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 心肌細(xì)胞衰老模型的建立 心肌細(xì)胞在6孔板內(nèi)生長至合適密度時(shí)，加入100 μmol/L 的百草枯（paraquat，PQ）培養(yǎng)72 h[8]。通過衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色（senescence associated β-galactosidase，SA-β-Gal）[8]、活性氧（reactive oxygen species，ROS）活性[8]鑒定模型是否成功。

1.2.3 細(xì)胞分組與處理 細(xì)胞分組如下，①空白對(duì)照組（CK 組）：不做特殊處理；②百草枯組（PQ組）：心肌細(xì)胞暴露于100 μmol/L 的PQ；③二甲雙胍（metformin，MET）干預(yù)組（PQ+0.01/0.1/1/10 mM MET 組）：心肌細(xì)胞暴露于100 μmol/L 的PQ 中60 min，用含不同濃度的二甲雙胍（0.01、0.1、1、10 mmol/L）的培養(yǎng)處理10 d；④二甲雙胍聯(lián)合AMPK siRNA 干預(yù)組（PQ+0.1 mM MET+si-AMPK組）：HL-1 心肌細(xì)胞加用AMPK siRNA 處理1 h，于100 μmol/L 的PQ 中干預(yù)1 h，再用二甲雙胍0.1 mmol/L 處理10 d；⑤AMPK 沉默組（si-AMPK組）：構(gòu)建AMPK 沉默載體（AMPK siRNA）并轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞；⑥轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組（mock 組）：用空載轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞；⑦陰性序列對(duì)照組（NC 組）：陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞。

1.2.4 SA-β-Gal 細(xì)胞種于6 孔板中，用PBS 洗滌后加入1 ml 的SA-β-Gal 染色固定液，將固定液棄去后用PBS 清洗，同時(shí)在每孔中再加入1 ml 的SA-β-Gal 染色工作液，封口膜封住6 孔板，將培養(yǎng)板放置于恒溫箱中孵育過夜。染色結(jié)束之后于普通光學(xué)顯微鏡下觀察，并計(jì)算細(xì)胞衰老率。

1.2.5 ROS 水平檢測 根據(jù)試劑說明，本研究采用流式法測定細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，并按照之前的實(shí)驗(yàn)方法來操作[8]。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot，WB） 處理后的細(xì)胞用RIPA 緩沖液充分裂解，4℃12 000 g 離心15 min 得到總蛋白，使用BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒定量蛋白質(zhì)濃度，電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，使用5% 脫脂牛奶封閉1 h，封閉完后將膜放入裝有一抗的抗體雜交盒中，4℃孵育過夜。TBST 洗膜后加入二抗，室溫孵育2 h，TBST 洗膜后，加ECL 試劑進(jìn)行顯色、曝光，并使用Image J 軟件進(jìn)行定量。

1.2.7 RNA 干擾 AMPK siRNA 序列：正義鏈為5’-GCAGAAGUAUGUAGAGCAATT-3’，反義鏈為5’-T T G C T C T A C A T A C T T C T G C T T-3’，陰性對(duì)照（negative control，NC）序列：正義鏈為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈為5’-ACGTGACACGTTCGGAGAATT-3’，RNA 干擾參照既往方法進(jìn)行[8]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism 7.0 軟件分析結(jié)果并繪制統(tǒng)計(jì)圖，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，三組及以上比較采用單因素方差分析，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜ 0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍減輕百草枯誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞衰老及最適濃度篩選

與CK 組比較，100 μmol/L 百草枯干預(yù)心肌細(xì)胞72 h 后能增加細(xì)胞衰老率及ROS 水平，不同濃度二甲雙胍均可降低百草枯誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞衰老率（圖1A）及ROS（圖1B），以0.1 mmol/L 濃度時(shí)差異最為顯著，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01），因此選擇0.1 mmol/L 作為二甲雙胍的最適濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 二甲雙胍對(duì)心肌細(xì)胞衰老的影響及最適濃度篩選

2.2 二甲雙胍對(duì)AMPK、Sirt1蛋白表達(dá)的影響

WB 檢測發(fā)現(xiàn)PQ 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)AMPK、Sirt1 蛋白表達(dá)下降，而經(jīng)過二甲雙胍預(yù)處理能夠部分逆轉(zhuǎn)AMPK 和Sirt1 蛋白表達(dá)的下降，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01），見圖2。

圖2 二甲雙胍對(duì)AMPK、Sirt1 蛋白表達(dá)的影響

2.3 AMPK siRNA對(duì)AMPK、Sirt1蛋白表達(dá)的影響

與轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組（mock 組）比較，陰性序列對(duì)照組（NC 組）AMPK、Sirt1 表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。而與NC 組比較，AMPK 沉默組（si-AMPK）AMPK 蛋白表達(dá)明顯減少，同時(shí)Sirt1 表達(dá)也顯著減少，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01），見圖3。

圖3 AMPK siRNA 對(duì)AMPK、Sirt1 蛋白表達(dá)的影響

2.4 AMPK siRNA顯著抵消二甲雙胍改善心肌細(xì)胞衰老作用

PQ+0.1 mM MET+si-AMPK 組Sirt1 蛋白表達(dá)較二甲雙胍干預(yù)組明顯降低（圖4）；且細(xì)胞衰老陽性細(xì)胞比例（圖5A）及ROS 活性（圖5B）較二甲雙胍干預(yù)組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），但與PQ 組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見圖5。

圖4 AMPK siRNA 顯著抵消二甲雙胍改善心肌細(xì)胞衰老作用

圖5 抑制AMPK 表達(dá)和二甲雙胍處理對(duì)細(xì)胞衰老的影響

3 討論

本研究結(jié)果顯示，百草枯能成功誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞衰老，而不同濃度二甲雙胍通過調(diào)控AMPK/Sirt1 信號(hào)通路很大程度上延緩百草枯誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老。

構(gòu)建細(xì)胞衰老模型的方法較多，有自然衰老模型、D-半乳糖、過氧化氫及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）誘導(dǎo)模型等，其中百草枯誘導(dǎo)衰老模型[8]容易操作，結(jié)果較穩(wěn)定。故本研究采用百草枯干預(yù)心肌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞衰老陽性比例和ROS 水平增加，這與公認(rèn)的細(xì)胞衰老特征一致，表明心肌細(xì)胞衰老模型構(gòu)建成功。研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍具有獨(dú)立于降糖作用外的抗細(xì)胞衰老作用，二甲雙胍可通過抑制胰島素樣生長因子（insulinlike growth factors -1，IGF-1）介導(dǎo)的磷酸酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B 信號(hào)通路來延緩2BS 細(xì)胞衰老[9]；同時(shí)，二甲雙胍通過蛋白磷酸酶2/蛋白激酶B 通路誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞衰老，從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖[10]，為腫瘤的治療提供了一定思路；本研究也發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能明顯降低心肌細(xì)胞衰老率及ROS 水平，提示二甲雙胍能抵抗小鼠心肌細(xì)胞衰老。

AMPK 的激活可減少與衰老相關(guān)的SA-β-Gal 細(xì)胞陽性率，恢復(fù)血管平滑肌細(xì)胞的增殖，是防治衰老的一個(gè)潛在靶標(biāo)。二甲雙胍通過磷酸化催化α 亞基上的關(guān)鍵調(diào)節(jié)位點(diǎn)來誘導(dǎo)AMPK 活化，抑制核因子κB 信號(hào)傳導(dǎo)并減輕細(xì)胞炎癥[11]。同時(shí)二甲雙胍抑制IGF-1 信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致胰島素水平降低，這些共同抑制炎癥和自噬，有利于拮抗衰老過程[12]。Sirt1 是一種NAD+依賴性脫乙酰酶，能抵抗氧化應(yīng)激、炎癥和心血管衰老。研究表明，Sirt1的表達(dá)隨著小鼠年齡的增長而減少，當(dāng)過表達(dá)Sirt1時(shí)，心肌肥大、氧化應(yīng)激等相關(guān)衰老標(biāo)志物下降[13]；當(dāng)Sirt1 缺乏時(shí)，p53 乙酰化積累增多，從而增強(qiáng)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老[14]。研究指出，AMPK 依賴細(xì)胞內(nèi)NAD+水平升高而激活Sirt1，二者相互調(diào)節(jié)，共享許多靶分子[15]。本研究發(fā)現(xiàn)百草枯在誘導(dǎo)HL-1 心肌細(xì)胞衰老過程中，AMPK 和Sirt1 表達(dá)水平顯著下降；經(jīng)二甲雙胍處理后，AMPK 和Sirt1 蛋白的表達(dá)上調(diào)；值得注意的是，在AMPK 抑制后，二甲雙胍的有益作用不再可見。

綜上所述，本研究提示在百草枯誘導(dǎo)的HL-1心肌細(xì)胞衰老模型中，二甲雙胍可能通過上調(diào)AMPK、增加Sirt1 表達(dá)而延緩衰老。但本研究為體外實(shí)驗(yàn)，尚不能準(zhǔn)確反映在體內(nèi)的情況，有待后續(xù)進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來深入研究。