DTT在D-二聚體假性增高病例中的應用*

喬瑩利,李 濤,宋 迪,張 壘,許潑實

河南省人民醫(yī)院/阜外華中心血管病醫(yī)院檢驗科,河南鄭州 450003

D-二聚體的基本結(jié)構(gòu)是一個相對分子質(zhì)量為180×103的片段,只包含兩個D結(jié)構(gòu)域,但交聯(lián)的纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物(FDP)的結(jié)構(gòu)可以是高度復雜的,包括多個交聯(lián)的D結(jié)構(gòu)域和(或)原始纖維蛋白原分子的E結(jié)構(gòu)域。理論上FDP水平應該高于D-二聚體水平[1-3]。近年來,血漿D-二聚體水平>FDP水平的情況偶有報道,多為D-二聚體假性增高[4-7]。D-二聚體假性增高的原因多為免疫干擾引起的檢測誤差,臨床常用于糾正免疫干擾的方法有稀釋試驗、更換檢測系統(tǒng)、異嗜性抗體阻斷劑(HBR)處理等[7-9]。二硫蘇糖醇(DTT)能用于蛋白質(zhì)中分子內(nèi)或分子間二硫鍵的還原[10],且不會影響D-二聚體之間的連接,因此,DTT有望用于糾正D-二聚體的假性升高,但目前尚缺乏文獻報道。本研究對DTT糾正D-二聚體假性增高的效果進行了探討,共收集了19 例臨床檢測工作中D-二聚體水平>FDP水平的標本及患者臨床資料,并對標本進行多倍稀釋、比對試驗、DTT糾正試驗,旨在探討DTT對D-二聚體異常結(jié)果的糾正情況。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院2022 年1 月至2023 年3 月首次檢測血漿D-二聚體水平>FDP水平的門診及住院患者(19例)同期血清和血漿標本(試驗組)及臨床資料,患者年齡、性別、疾病類型等分布如表1所示。本研究已征得所有研究對象的知情同意并通過醫(yī)院倫理委員會審核。

表1 19例血漿D-二聚體水平>FDP水平的患者基線資料

1.2儀器與試劑 本實驗室檢測系統(tǒng)為日本Sysmex公司的CS5100全自動凝血分析儀,試劑為德國Siemens公司的 INNOVANCE D-二聚體試劑盒、日本Sysmex公司的 Latex Test BL-2 P-FDP試劑盒。比對試驗的儀器為日本積水公司的全自動凝血分析儀SEKISUI CP 2000,試劑為配套的Nanopia D-二聚體和Nanopia P-FDP試劑盒;其他試劑為DTT(德國Biofroxx公司)。

1.3方法 發(fā)現(xiàn)D-二聚體水平>FDP水平后,在征得患者的知情同意后,當日或次日空腹采集患者枸櫞酸鈉1∶9抗凝血3 mL,3 500 r/min離心10 min,分離乏血小板血漿,立即進行多倍稀釋試驗,剩余血漿分裝后于-80 ℃冰箱內(nèi)保存用于比對試驗、DTT糾正試驗。隨機選取20例FDP與D-二聚體比值為2～5的枸櫞酸鈉抗凝血漿作為對照組。所有標本均無溶血、乳糜及黃疸,類風濕因子均低于試劑說明書聲明的抗干擾水平。

1.3.1稀釋試驗 使用與初始檢測時相同的方法和儀器,將收集到的D-二聚體水平>FDP水平的19例患者的血漿采用儀器稀釋模式分別對D-二聚體(1/8、1/16、1/32)與FDP(1/2、1/4)做稀釋檢測,然后將其稀釋后的結(jié)果分別與初始結(jié)果進行比較。對于D-二聚體原倍檢測超出儀器線性范圍或抗原過量的標本,以8倍稀釋結(jié)果作為初始結(jié)果。

1.3.2比對試驗 在正常質(zhì)量控制條件下,將收集的D-二聚體水平>FDP水平血漿標本用另一種儀器、試劑和檢測方法(SEKISUI CP 2000,Nanopia D-二聚體與P-FDP試劑盒,乳膠免疫比濁法)檢測D-二聚體和FDP水平,并嚴格按照說明書操作。由于比對試驗D-二聚體的單位和參考范圍與初始測量系統(tǒng)不一致,因此,使用D-二聚體值與參考范圍上限的比值進行初始檢測系統(tǒng)和比對檢測系統(tǒng)的比較。

1.3.3DTT糾正試驗 將患者標本和50 mmol/L的DTT溶液等比例混合,將室溫放置反應30 min后上機檢測的D-二聚體結(jié)果乘以2倍作為DTT處理結(jié)果。同期,將試驗標本與生理鹽水等比例混合,以室溫放置30 min后上機檢測的D-二聚體結(jié)果的2倍為鹽水處理結(jié)果。20例對照組血漿標本同樣按上述步驟處理。比較試驗組和對照組中DTT處理的回收率。

1.3.4試驗組DTT處理后可糾正的結(jié)果與比對檢測系統(tǒng)的結(jié)果比較 將試驗組中經(jīng)DTT處理可糾正的D-二聚體結(jié)果與比對檢測系統(tǒng)的D-二聚體結(jié)果比較,由于比對檢測系統(tǒng)D-二聚體的單位和參考范圍與初始測量系統(tǒng)不一致,因此,使用DDT糾正后D-二聚體值與參考范圍上限的比值和比對檢測系統(tǒng)的D-二聚體值與參考范圍上限的比值比較。

2 結(jié) 果

2.1稀釋試驗結(jié)果 稀釋試驗結(jié)果顯示,19例中有8例可通過多倍稀釋糾正為FDP水平>D-二聚體水平。D-二聚體的1/8稀釋結(jié)果[5.03(1.79～22.35)mg/L FEU]與初始結(jié)果[4.03(3.06～22.35)mg/L FEU]比較,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.515)。D-二聚體的1/16稀釋結(jié)果[3.69(1.84～10.59)mg/L FEU]和1/32稀釋結(jié)果[2.88(2.01～8.74)mg/L FEU]與初始結(jié)果[4.03(3.00～22.35)mg/L FEU]比較,差異有統(tǒng)計學意義(P值分別為0.001、<0.001)。FDP的1/2和1/4稀釋結(jié)果[2.50(2.50～2.50)μg/mL和2.50(2.50～2.71)μg/mL]與初始結(jié)果[2.50(2.50～2.50)μg/mL]比較,差異無統(tǒng)計學意義(P值分別為0.285和0.059)。

2.2比對試驗結(jié)果比較 更換另一種檢測系統(tǒng)(SEKISUI CP 2000)進行檢測,19例均符合FDP水平>D-二聚體水平。初始檢測系統(tǒng)和比對檢測系統(tǒng)D-二聚體值與參考范圍上限的比值比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。初始檢測系統(tǒng)和比對檢測系統(tǒng)FDP結(jié)果比較,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.088)。見表2。

表2 比對試驗結(jié)果[M(P25～P75)]

2.3DTT糾正試驗 19例患者經(jīng)DTT處理后,有15例可糾正為FDP水平>D-二聚體水平,有4例不能糾正。對照組經(jīng)鹽水或DTT處理后的D-二聚體水平比較,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.702)。試驗組的DTT處理的回收率顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。試驗組的DTT處理結(jié)果和鹽水處理結(jié)果比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),試驗組的鹽水處理和初始結(jié)果比較,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.445)。見表3。

表3 試驗組和對照組D-二聚體經(jīng)DTT和鹽水處理結(jié)果比較[M(P25～P75)或

2.415例患者DDT糾正后結(jié)果和比對檢測系統(tǒng)的結(jié)果比較 15例患者DDT糾正后D-二聚體值與參考范圍上限的比值[0.91(0.47～1.67)]和比對檢測系統(tǒng)的D-二聚體值與參考范圍上限的比值(0.84±0.42)比較,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.147)。

3 討 論

本研究收集的19例D-二聚體水平>FDP水平患者的臨床資料顯示:女性11例(57.89%),45歲以上有17例(89.47%),提示該現(xiàn)象男女均可出現(xiàn),以中老年患者居多。稀釋試驗的結(jié)果顯示,隨著稀釋倍數(shù)的增加,D-二聚體水平呈下降趨勢,FDP無顯著性變化,多數(shù)病例經(jīng)稀釋后不能糾正為FDP水平>D-二聚體水平。比對試驗結(jié)果顯示,19例初始系統(tǒng)D-二聚體水平>FDP水平的血漿標本,更換系統(tǒng)檢測后均能糾正為FDP水平>D-二聚體水平,且兩個系統(tǒng)FDP結(jié)果比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。這說明干擾物質(zhì)影響了初始檢測系統(tǒng)D-二聚體的測定,但對更換后的系統(tǒng)沒有影響。稀釋試驗和比對試驗的結(jié)果均提示,本研究中的19例D-二聚體水平>FDP水平的患者均為D-二聚體假性增高。

D-二聚體在某些情況下可作為激活凝血和促進纖維蛋白溶解有價值的標志物,間接反映機體處于高凝狀態(tài)和繼發(fā)性纖溶亢進[2-3]。D-二聚體具有較高的陰性預測價值,因此,D-二聚體廣泛應用于活動性深靜脈血栓形成(DVT)和肺栓塞(PE)的排除診斷。此外,D-二聚體還被用于確定靜脈血栓栓塞癥(VTE)患者的最佳抗凝時間、診斷和監(jiān)測彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)、鑒別診斷原發(fā)與繼發(fā)性纖溶亢進、監(jiān)測溶栓治療效果,以及監(jiān)測患者處于出血或血栓形成高風險等其他情況[2-3,11-13]。目前商業(yè)化的D-二聚體免疫測定針對的是交聯(lián)纖維蛋白降解片段D域表位,D-二聚體抗體的性質(zhì)決定了其單克隆抗體或多克隆抗體的多樣性[14]。因此,在臨床檢測過程中D-二聚體的檢測易受到干擾物質(zhì)的影響而出現(xiàn)D-二聚體水平>FDP水平的情況。由于錯誤的結(jié)果可能會導致臨床對疾病的誤診、甚至錯誤的治療,因此,糾正干擾得到真實的D-二聚體結(jié)果就顯得尤為重要。

DTT常常被用于蛋白質(zhì)中二硫鍵的還原,可用于阻斷蛋白質(zhì)中的半胱氨酸之間所形成的蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間二硫鍵[10],而不會影響D-二聚體之間的連接。在血型鑒定試驗中常使用DTT破壞IgM抗體的二硫鍵,降低IgM分子的多價性,從而降低其效價,使其失去直接凝集紅細胞的能力,從而消除IgM類自身抗體對血型鑒定結(jié)果的影響[15]。在DNA提取實驗中常常添加DTT打斷蛋白質(zhì)之間的二硫鍵,使DNA充分游離,提高DNA的提取效率[6]。造成D-二聚體假性增高的干擾物質(zhì)有類風濕因子、異嗜性抗體、大分子免疫球蛋白、人抗動物抗體、自身抗體、其他蛋白等[4,7-9,16-20],臨床常用于減少干擾的方法有稀釋法、更換檢測系統(tǒng)、HBR處理等[7-9]。DTT在糾正D-二聚體檢測干擾中的作用尚不明確,本研究對DTT糾正D-二聚體檢測干擾的效果進行了初步探索。DTT糾正試驗結(jié)果顯示,對照組經(jīng)DTT處理與鹽水處理后的D-二聚體水平比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),說明DTT處理不影響常規(guī)D-二聚體檢測。試驗組經(jīng)DTT處理和鹽水處理的D-二聚體水平比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),說明DTT處理可顯著減少D-二聚體的檢測干擾。在本研究的19例患者中,15例患者經(jīng)DTT處理后,可糾正為FDP水平>D-二聚體水平,且DTT處理后D-二聚體結(jié)果和比對檢測系統(tǒng)的血漿D-二聚體結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),提示DTT糾正后的結(jié)果可靠,可用于臨床診療。

綜上所述,本研究中的19例患者均為D-二聚體假性增高,其中15例檢測前經(jīng)DTT預處理后可糾正,糾正后的結(jié)果與更換另一種系統(tǒng)的結(jié)果比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),說明DTT可糾正大多數(shù)D-二聚體假性增高的干擾。該試驗具有操作方便(室溫30 min)、價格低廉(1 g DTT不到50元人民幣)、不需要額外的檢測系統(tǒng),可在基層醫(yī)院常規(guī)使用,有望成為糾正D-二聚體假性增高的一種新方法。本研究的不足之處是樣本量較少,且仍有4例(21.05%)不能采用DTT預處理糾正干擾,這需要進一步擴大樣本量,查找干擾原因,闡明干擾物質(zhì)的類型,探究更具有針對性的糾正方式。