不同炮制工藝蒼耳子UPLC 指紋圖譜及毒性成分含量比較

黃 成，王學芹，鄧 昕，洪 燕，朋湯義*，韓燕全,*，吳德玲

（1.安徽中醫藥大學第一附屬醫院/國家中醫藥管理局中藥制劑三級實驗室，合肥 230031；2.安徽中醫藥大學/中藥復方安徽省重點實驗室/現代藥物制劑安徽省工程技術中心，合肥 230031）

蒼耳子為菊科植物蒼耳Xanthium sibiricum Patr.干燥成熟帶總苞的果實，有小毒，具有祛風除濕、通鼻竅和殺蟲功效。隨著機械化的發展，蒼耳子機械去刺的設備和技術日臻成熟，機械去刺的效率高，去刺效果好且能保持果實完整[1]。去刺后的蒼耳子，以清炒法炒制時，存在受熱不勻、易焦糊和炮制終點難判斷等問題，對飲片質量和臨床療效有較明顯的影響[2-3]。通過炮制降低蒼耳子毒性是保證臨床安全用藥的關鍵[4]。本實驗采用UPLC 建立蒼耳子不同炮制品的指紋圖譜并對其主要毒性成分進行含量測定，比較不同方法炮制蒼耳子的質量差異，為毒性中藥的炮制和臨床安全使用提供有益參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Acquity H-Class 型超高效液相色譜儀，美國Waters 公司；BP211D 型十萬分之一電子天平，德國Sartorius 公司；KQ3200DB 型超聲清洗器,江蘇昆山超聲儀器有限公司；YM-902 高精密度防潑水pH 計，姜堰市櫻明儀器儀表有限公司；KDC-16H型高速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；XFB-200 型高速粉碎機，吉首市中州制藥機械廠。

1.2 試劑

綠原酸（14021401）、新綠原酸（11112202）、隱綠原酸（11112203）、3，4-二咖啡?？鼘幩幔?2041114）、4，5-二咖啡?？鼘幩幔?1081803）、蒼術苷二鉀鹽（14110812）、羧基蒼術苷三鉀鹽（14110813）均購自成都曼斯特化工有限公司；咖啡酸（110885-200102）購自中國食品藥品檢定研究院；3，5-二咖啡?？鼘幩幔―ST 210715-036）購自成都德思特生物技術有限公司；乙腈、甲醇均為色譜純，購自美國TEDIA公司；水為蒸餾水，購自廣州屈臣氏公司。

1.3 藥材

生蒼耳子藥材購自全國各省中藥材市場，共15批次，產地和生產日期信息見表1。

表1 蒼耳子樣品信息

2 指紋圖譜建立

2.1 色譜條件

Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈（A）-0.05%磷酸（C），流動相梯度洗脫程序：0 min，3%A；2.5 min，10%A；8 min，15%A；8.5 min，20%A；14 min，25%A；17 min，30%A；20 min，50%A；21 min，3% min；23 min，3%A。體積流量為0.2 mL·min-1，柱溫設定為30 ℃，進樣體積為1.0 μL，檢測波長為327 nm。

2.2 蒼耳子不同炮制品制備

生蒼耳子：取表1 中各批次蒼耳子去除雜質后即為蒼耳子生品 （S1～S15）；清炒蒼耳子：按照《中國藥典》2020 版附錄通則（0213）所載清炒法，炒至黃褐色，放涼備用[5]，即為蒼耳子清炒品（Q1～Q15）；砂炒蒼耳子：按照課題組前期研究，取藥材8 倍量的河砂置鍋內，中火加熱至滑利狀態，以距離鍋底約1 cm 處溫度為砂溫，待其穩定至160℃時，投入蒼耳子炒制7 min，炒至表面微黃出鍋，放涼備用[6]，即為蒼耳子砂炒品（SH1～SH15）。取蒼耳子各炮制品粉碎機粉碎后過3號篩（50目），備用。

2.3 對照品溶液的制備

分別精密稱 取 新綠原酸對照品5.15 mg，綠原酸6.30 mg、隱綠原酸9.42 mg、咖啡酸6.83 mg、3，4-二咖啡?？鼘幩?.66 mg、3，5-二咖啡?？鼘幩?.36 mg、4，5-二咖啡酰奎寧酸5.60 mg 置10 mL棕色容量瓶中，以甲醇溶解、定容至刻度，分別配置成7 種對照品貯備液。再分別精密吸取新綠原酸對照品貯備液20 μL、綠原酸2.25 mL、隱綠原酸25 μL、咖啡酸20 μL、3，4-二咖啡?？鼘幩?0 μL、3，5-二咖啡酰奎寧酸100 μL、4，5-二咖啡酰奎寧酸20 μL 至同一10 mL 棕色量瓶中，加甲醇定容至刻度混勻，得到混合對照品溶液的濃度：新綠原酸1.03 μg·mL-1、綠原酸141.75 μg·mL-1、隱綠原酸2.36 μg·mL-1、咖啡酸1.37 μg·mL-1、3，4-二咖啡酰奎寧酸0.666 μg·mL-1、3，5-二咖啡?？鼘幩?.36 μg·mL-1、4，5-二咖啡?？鼘幩?.12 μg·mL-1。

2.4 供試品溶液制備

精密稱取“2.2”項3 種炮制品的粉末0.2 g 至10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度并稱定質量，于150 W、40 Hz 條件下超聲提取40 min，放至室溫，用甲醇補足損失重量，搖勻后靜置，將沉淀后的上清液于離心機中以12 000 rpm·min-1條件離心10 min，再次靜置，臨用前用0.22 μm 有機相針式濾器濾過，取續濾液供UPLC 分析用。

2.5 精密度實驗

取相同的樣品溶液，在“2.1”項色譜條件下連續進樣6 次，記錄色譜峰面積和出峰時間，以綠原酸作為參照峰，計算相對峰面積和相對保留時間。結果相對峰面積RSD＜2.00%，相對保留時間RSD＜1.00%，說明儀器精密度良好。

2.6 重復性實驗

取相同的蒼耳子炮制品粉末6 份，按照“2.4”項方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下分別進樣，以綠原酸作為參照峰，計算相對峰面積和相對保留時間。結果相對峰面積RSD＜2.00%，相對保留時間RSD＜1.00%，說明該方法重復性良好。

2.7 穩定性實驗

取同一蒼耳子供試液，分別于配置后 0、4、8、12、16、24h 在“2.1”項色譜條件下進樣，以綠原酸作為參照峰，計算相對峰面積和相對保留時間。結果相對峰面積RSD＜3.00%，相對保留時間RSD＜1.00%，說明供試品溶液穩定性良好。

3 指紋圖譜研究

3.1 相似度評價

分別取各批蒼耳子炮制品粉末，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，將所得的指紋圖譜以AIA 格式按炮制類別分別導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”，分別以S1（生品1）、Q1（清炒品1）、SH1（砂炒品1）為參照圖譜，使用中位數法，時間窗口寬度設為 0.5 min，經自動匹配生成3 個炮制類別各15 批蒼耳子炮制品UPLC 指紋圖譜共有模式及對照指紋圖譜，篩選出共有峰15 個，經與混合對照品圖譜比對后，指認出7 個特征峰，其中2 號峰認定為新綠原酸，5 號峰認定為綠原酸，6 號峰認定為隱綠原酸，7號峰認定為咖啡酸，11 號峰認定為3，4-二咖啡?？鼘幩?，12 號峰認定為3，5-二咖啡?？鼘幩幔?4 號峰認定為4，5-二咖啡?？鼘幩幔B加圖譜見圖1，相似度評價結果見表2。蒼耳子不同炮制品的相似度均在0.994 以上，表明蒼耳子各炮制品質量均較為穩定。

3.2 聚類分析

將共有峰面積導入 SIMCA-14.1 軟件，在標準化處理后進行HCA，得到相應的樹狀圖見圖2，當分類距離為120 時，大致可以分為兩類，即S11、Q11、SH1～SH15 為一類，S1～S10、S12～S15、Q1～Q10、Q12～Q15 為另一類，說明砂炒品質量較為接近，生品和清炒品質量較為接近。

圖2 蒼耳子不同炮制品HCA 圖

3.3 主成分分析

為能夠客觀反映蒼耳子不同炮制品的差異性，將45 批不同炮制品的共有峰面積導入SPSS 23.0 軟件進行標準化處理，提取特征值＞1 的成分做為主成分，結果見表3，主成分因子載荷矩陣見表4。前5 個主成分的累積方差貢獻率達到了89.419%，涵蓋的信息較為全面。根據絕對值的大小進行判斷，4、7、8、9、13、14 號峰對主成分1 的貢獻較大，2、6、12 號峰對主成分2 的貢獻較大，3、15 號峰對主成分3 的貢獻較大，1、10 號峰對主成分4 的貢獻較大，13 號峰對主成分5 的功效較大，說明蒼耳子用不同方法炮制后質量發生變化，可能是以上多個成分共同作用導致的。使用SIMCA14.1 軟件繪制主成分散點得分圖，模型的R2X（cum）=0.930，Q2（cum）=0.664，結果見圖3，結果顯示蒼耳子各炮制品分布在橫坐標的上下兩側，砂炒品（綠色）分布在上方，生品（紅色）和清炒品（藍色）基本分布在下方。

圖3 蒼耳子炮制品的 PCA 模型得分散點圖

表3 蒼耳子不同炮制品主成分特征值及方差貢獻率 %

表4 蒼耳子不同炮制品主成分因子載荷矩陣

3.4 正交偏最小二乘判別分析

為尋找蒼耳子不同炮制品的化學差異成分，將生品、清炒品、砂炒品各15 批指紋圖譜數據導入SIMCA 14.1 軟件進行有監督模式的OPLS-DA。模型的R2X（cum）=0.569，R2Y（cum）=0.846，Q2（cum）=0.799，均大于0.500，表明模型的擬合度以及預測能力均較為優秀[7-8]，OPLS-DA 得分圖見圖4。結果表明蒼耳子生品和清炒品聚為一類，分布在縱坐標的左側，砂炒品聚為一類，分布在縱坐標右側，說明3 種炮制品間的化學成分差異明顯，結果與PCA 分析一致。對模型進行置換檢驗，結果顯示R2=（0.000，0.137）、Q2=（0.000，-0.257），表明該模型沒有出現過度擬合，可用來判斷蒼耳子各炮制品的類別[9]。以 VIP＞1 為標準，共得到5個成分，分別為2 號峰（新綠原酸）、6 號峰（隱綠原酸）、11 號峰（3，4-二咖啡?？鼘幩幔?、14號峰（4，5-二咖啡?？鼘幩幔?、12 號峰（3，5-二咖啡?？鼘幩幔?，表明這 5 個成分對蒼耳子不同炮制品分類有顯著影響，也是引起炮制前后化學成分差異的主要成分。

4 蒼術苷類含量測定

4.1 色譜條件

Shim-pack C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流動相為乙腈（A）-磷酸二氫鈉（pH=5.6）（B），流動相洗脫程序：0～7 min，10%～20%A；7～10 min，20%～50%A；10～16 min，50%～70%A；16～20 min，70%～10%A；20～22 min，10%～10%A。體積流量為0.8 mL·min-1，柱溫設定為30 ℃，進樣量為5 μL，檢測波長為203 nm，在此條件下，對照品和樣品色譜峰能有效分離，結果見圖5。

圖5 蒼耳子中蒼術苷類色譜圖

4.2 對照品溶液 的制備

分別精密稱定羧基蒼術苷、蒼術苷適量以適量甲醇溶解，配置成羧基蒼術苷濃度為33.90 μg·mL-1、蒼術苷濃度為25.95 μg·mL-1的混合對照品溶液。

4.3 線性關系考察

取混合對照品溶液 依次稀釋，配置成梯度濃度的標準曲線工作液，按照“4.1”項條件進樣，以峰面積為縱坐標Y、濃度為橫坐標X，進行線性關系考察，羧基蒼術苷線性方程為Y=62 180X+790.02，r=0.999 9，線性范圍6.78～67.80 μg·mL-1，蒼術苷線性方程為Y=17 415X+4 064，r=0.999 7，性范圍5.19～51.90 μg·mL-1，r=0.999 8，表明這2 種成分在各自線性范圍內線性關系良好。

4.4 精密度實驗

取同一供試液，在“4.1”項條件下連續進樣6 次，記錄峰面積，羧基蒼術苷和蒼術 苷峰面積的RSD 值分別為0.68%和0.91%，說明儀器精密度良好。

4.5 重復性實驗

取同一樣品粉末6 份，按“2.4”項分別 制備供試品溶液，在“4.1”項色譜條件下各進樣1 次，羧基蒼術苷和蒼術苷峰面積的RSD 值分別為1.21%和1.42%，證明該法重復性良好。

4.6 穩定性實驗

取同一供試液，分別于0、4、8、12、16、24h在“4.1”項色譜條件下進樣，羧基蒼術苷和蒼術苷峰面積的RSD 值分別為1.79%和1.68%，證明供試液穩定性良好。

4.7 加樣回收率實驗

取同一已知含量的蒼耳子樣品粉末6 份，精密稱定，每份0.1 g，然后加入適量的羧基蒼術苷、蒼術苷對照品，按“2.4”項制作供試液，按“4.1”項色譜條件進樣，計算含量與回收率，結果見表5，說明加樣回收率較好。

表5 蒼耳子中蒼術苷類加樣回收率實驗

4.8 樣品含量

取“2.4”項各供試液，按照“4.1”項條件進樣分析，得到羧基蒼術苷和蒼術苷的色譜峰面積，按照外標法計算2 種成分含量，見表6。結果表明，在與生品比較時，清炒品 羧基蒼術苷含量降低（P＞0.05），蒼術苷含量升高（P＜0.05）；砂炒品羧基蒼術苷含量降低（P＜0.05），蒼術苷含量升高（P＜0.05）。

表6 不同炮制蒼耳子的羧基蒼術苷、蒼術苷含量

5 討論

蒼耳子炮制方法一般為清炒后去刺，如《雷公炮制藥性解》載：“炒令香，杵去刺用”[10]。以綠原酸、新綠原酸為代表的酚酸類被認為是蒼耳子的主要有效成分，具有抗炎、鎮痛等生物活性[11-13]；羧基蒼術苷類被認為是蒼耳子的主要毒性成分，能對機體的多臟器產生毒性[14-16]。本課題組前期對去刺后蒼耳子的砂炒工藝進行了研究，從炮制品外觀、均一度和炮制時間來看，砂炒法優勢更明顯，但是其與清炒法炮制的內在質量差別，還需進一步實驗研究。HCA、PCA 和OPLS-DA 得出相同的結論，即生品和清炒品為一類，砂炒品為另一類。其原因可能是因為在清炒法炮制過程中，藥材溫度變化較大，受熱不均導致成品間質量差異較大；砂炒法炮制過程中，河砂能在翻炒時包裹藥材，使藥材溫度較為衡定，因此其成品質量較為均一[17-19]。在OPLS-DA 中新綠原酸、隱綠原酸、3，4-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡?？鼘幩?、3，5-二咖啡酰奎寧酸是5 個貢獻較大的成分，多成分共同導致了蒼耳子炮制品質量的改變。

羧基蒼術苷在炮制后含量降低，高低順序為生品＞清炒品＞砂炒品；蒼術苷在炮制后含量升高，高低順序為砂炒品＞清炒品＞生品，這一變化有可能是羧基蒼術苷在受熱時部分轉變為蒼術苷導致的[20]。

本實驗結果表明清炒法和砂炒法均可降低蒼耳子毒性成分含量，且砂炒法炮制的蒼耳子質量更加穩定均一，可用于炮制蒼耳子。