蒙醫溫針下調脊髓背角小膠質細胞STAT3 緩解大鼠脊髓損傷后坐骨神經痛

斯楞格，阿古拉，阿日嘎太，包立道，阿茹娜*

（1.內蒙古醫科大學蒙醫藥學院蒙醫傳統療法教研室，呼和浩特 010110；2.內蒙古科技大學包頭醫學院中醫學院，內蒙古 包頭 014040）

脊髓損傷常見為引起機體損傷平面以下的感覺、運動功能損傷，同時部分患者可合并中樞性坐骨神經痛（central neuropathic pain，CNP）樣改變[1-2]。但目前針對中樞性坐骨神經痛的發生機制尚未闡明。STAT3 信號傳導通路具有外周神經損傷后脊髓功能的中樞敏化效應，可能是坐骨神經痛的發病機制[3-4]。坐骨神經痛多數病例是繼發于坐骨神經局部及周圍結構的病變對坐骨神經的刺激壓迫與損害，稱為繼發坐骨神經痛；少數系原發性即坐骨神經炎，屬蒙醫“白脈病”范疇[5-7]。大量的實踐研究表明，蒙醫溫針是一種有效的鎮痛方法，可通過增加CCI 模型大鼠的中腦導水管周圍灰質中5-HT 和NE 的含量，降低GABA 和ACH 的含量起到鎮痛作用。對于慢性坐骨神經痛有良好的療效[8-10]。STAT3 信號通路被認為是外周神經損傷后中樞敏化過程中的主要調節信號，其介導神經小膠質細胞的激活，引起機體無菌性炎癥反應，增加神經系統興奮性，進而引起脊髓損傷后中樞性坐骨神經痛的發生發展。本研究利用慢病毒構建攜帶STAT3 siRNA的轉染體，從而特異性的激活小膠質細胞STAT3信號轉導通路，并觀察脊髓損傷后中樞性坐骨神經痛大鼠STAT3 表達水平變化情況，從而為闡明蒙醫溫針治療脊髓損傷后中樞性坐骨神經痛的作用機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF 級健康3 月齡雄性Wistar 大鼠（內蒙古醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK 蒙2013-0004），體質量200～250 g。自由攝食和飲水，室溫21℃～23℃。隨機分為5 組，正常對照組（Normal 組，n=15）；假手術組（Sham 組，n=20）；脊髓鈍性損傷模型組（CNP 組，n=30）：STAT3 siRNA 注射組（n=30），蒙醫溫針治療組（n=30）。本研究通過內蒙古醫科大學生物醫學科研倫理審批（YKD2018094）。

1.2 模型

用Nembutal（50 mg·mL-1）腹腔注射大鼠麻醉，取背部正中相當于T8、T9、T10 脊椎水平，暴露T8、T9、T10 椎體，T10 椎板切除，背側暴露T10 脊髓，固定脊柱，置于NYU Impactor 設備（ABI PE-Applied Biosystem）之下，調節高度和撞擊水平，以150 kdyn撞擊力損傷脊髓。損傷后，逐層縫合肌肉、皮膚。

1.3 蒙醫溫針治療方法

取鼠膝眼穴（髕韌帶兩側凹陷處），髖穴（臀下橫紋的中點）用特制銀針（內蒙古醫學院蒙醫藥學院，專利號：ZL201120058078.0，直徑0.5 mm，長度3.0 cm）斜刺，并連接MLY-I 型蒙醫療術溫針儀（內蒙古醫學院蒙醫藥學院，專利號：ZL201120058078.0）。電流強度100 mA，溫度40 ℃，每次刺激15 min，每隔2 d 治療1 次，共30 次。

1.4 觀察指標

運動功能：運動神經功能評定采用BBB 分級法進行評定；熱縮足持續時間測量，分別于造模前1 天、造模后3、7、14、21、28 d 針對大鼠后肢熱痛閾值進行干預，待大鼠出現縮足反射時立刻按下秒表進行計時，直至縮足反射消失停止計時；機械性痛覺超敏測量：使用足底觸覺測量儀，于造模前1 天、造模后3、7、14、21、28 d 測定大鼠后肢機械痛閾值，記錄大鼠出現50%縮足反應時的壓力值。

1.5 統計學方法

采用SPSS 16.0 統計軟件進行數據處理，以均數±標準差（±s）表示，2 組間差異比較用t檢驗；多組間差異比較用方差分析，以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠行為學評分結果

CNP 組大鼠造模后28 d 時BBB 評分，高于造模 后3、7、14、21 d 時 （P＜0.05），Sham 組及Normal 造模前、造模后BBB 評分無明顯差異（P＞0.05）。CNP 組大鼠造模后第3 天開始后肢熱縮足持續時間短于Sham 組和Normal 組（P=0.032）。CNP 組鼠術后第3 天，后肢機械縮爪閾值低于Sham組和Normal 組（P=0.021）。見表1。

表1 假手術組、正常對照組及CNP 組大鼠的行為學結果

2.2 蒙醫溫針治療及鞘內注射STAT3 siRNA 藥后大鼠行為學影響

蒙醫溫針組及STAT3 siRNA 組大鼠的TWD時間與Normal 組、Sham 組和空載病毒組相比顯著降低（P＜0.01），MWT 顯著升高（P＜0.01），BBB 評分顯著升高（P＜0.01）；蒙醫溫針治療后，造模后第7 天、第14 天和第28 天脊髓STAT3表達均顯著降低（P＜0.01），蒙醫溫針組及STAT3 siRNA 組STAT3 mRNA 表達顯著低于Normol 組、Sham 組和空載病毒組（P＜0.01）。見表2，圖1，圖2。

圖1 各組TWD、MWT、BBB 等行為學評分及OX-42、AFT-3、MCP-1 等mRNA 相對表達水平

圖2 各組造模后7d、14d、28d 脊髓STAT3 蛋白表達及mRNA 相對表達

表2 蒙醫溫針治療及鞘內注射STAT3siRNA 藥后大鼠行為學影響

3 討論

近期研究發現，STAT3 信號通路在外周神經損傷后脊髓中樞敏化形成中起到重要作用，小膠質細胞活化增殖進一步促進TNF-α 及MCP-1 等炎性因子產生和釋放增多，進而引起一系列免疫炎癥反應和神經興奮性增高，導致坐骨神經痛發生和發展。本研究通過熒光雙標染色觀察到STAT3 主要是在小膠質細胞中表達分布，從基因和蛋白質水平分別檢T10 節段脊髓損傷后中樞神經痛模型大鼠腰4～6節段脊髓背角的STAT3 表達水平，發現脊髓損傷7 d大鼠脊髓的STAT3 mRNA 和蛋白質均較Normol 組和Sham 組顯著增加，研究采用實時定量PCR、免疫組織化學和Western Blot 檢測STAT3 在T10 節段脊髓損傷后中樞神經痛大鼠腰4～6 節段脊髓背角的分布及表達，結果相互驗證，且CNP 組STAT3 表達上調的同時，疼痛行為學也有相應改變。以上實驗結果初步表明，腰4～6 節段脊髓背角中的STAT3表達增加與中樞神經痛產生和維持存在一定相關性。

STAT3 信號通路被認為是外周神經損傷后中樞敏化過程中的主要調節信號，可介導神經小膠質細胞激活，引起機體無菌性炎癥反應[11-13]，增加神經系統興奮性，引起脊髓損傷后中樞性坐骨神經痛發生[14]。本研究以基因和蛋白質水平檢測T10 節段脊髓損傷造模大鼠的腰4～6 節段脊髓背角STAT3 水平，研究結果提示造模成功后7 天，大鼠腰4～6 節段脊髓背角的STAT3mRNA 及蛋白水平均顯著高于Normol 組及Sham 組。同時檢測實驗大鼠STAT3 的分布與表達，各種實驗方法所得結果具有高度吻合性，均提示CNP 組大鼠STAT3 水平明顯升高，且疼痛行為學亦存在相應變化，從而可認為T10 節段脊髓損傷造模大鼠的腰4～6 節段脊髓背角STAT3 表達水平的升高與中樞性神經痛的發生發展存在相關性。

本研究檢測了T10 節段脊髓鈍性損傷后腰4～6節段脊髓背角小膠質細胞和星形膠質細胞的活化表達分布，造模后1 d 起，腰4～6 節段脊髓背角OX-42和GFAP 染色陽性細胞開始增多，染色加深，突起顯著增多，小膠質細胞核星形膠質細胞同時開始活化，CNP 大鼠腰4～6 節段脊髓背角的OX-42 染色陽性細胞數在脊髓損傷后第7 天達到高峰。說明脊髓損傷后小膠質細胞和星形膠質細胞激活興奮激活可能是脊髓損傷節段之下的CNP早期啟動和維持的重要因素，在CNP 早期小膠質細胞激活更為明顯。

本研究將RNAi 技術結合慢病毒載體技術，在大鼠T10 脊髓損傷后第3 天開始，行蒙醫溫針治療及蛛網膜下腔內連續注射STAT3 siRNA 治療，結果提示造模后第3 天開始，給予蒙醫溫針治療和蛛網膜下腔內連續注射STAT3 siRNA 治療，蒙醫溫針組及STAT3 siRNA 組大鼠的TWD 時間與Normol組、Sham 組和空載病毒組相比顯著降低，MWT 顯著升高，BBB 評分顯著升高；蒙醫溫針治療后，于造模后第7 天、第14 天和第28 天脊髓STAT3 表達均顯著降低，蒙醫溫針組及STAT3 siRNA 組STAT3 mRNA 表達顯著低于Normol 組、Sham 組和空載病毒組。表明在脊髓損傷后中樞神經痛形成早期，小膠質細STAT3 信號轉導通路的激活可能發揮重要作用[15-16]，蒙醫溫針治療坐骨神經痛可能通過影響STAT3 信號途徑發揮作用[17]。

綜上所述，小膠質細胞內STAT3 信號轉導通路的激活可能為脊髓損傷后中樞性坐骨神經痛的發病機制之一，蒙醫溫針治療可能通過阻斷脊髓背角小膠質細胞內STAT 信號轉導通路活性而發揮治療作用。