淫羊藿次苷 Ⅱ 改善APP/PS1 雙轉基因小鼠認知功能的研究

聞彩名，肖洪賀，田 雨，李 賀，趙宇萌，田晉明，楊靜嫻

（遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116000）

阿爾茨海默病（Azhemer disease AD）是一種以進行性認知障礙和記憶能力衰退為主要癥狀的中樞神經系統退行性疾病[1]，其病理特征主要包括腦內Aβ 淀粉樣蛋白沉積、Tau 蛋白過度磷酸化導致的神經纖維纏結，以及神經元的退變性丟失等，其中Aβ淀粉蛋白沉積被認為是主要原因[3]。研究[4-5]表明，作為中樞神經系統（Central nervous system，CNS）的固有免疫細胞，星形膠質細胞、小膠質細胞參與炎癥和神經損傷，是神經退行性疾病的始動因子，在Aβ 介導的神經損傷過程中扮演著重要的角色。因此減輕腦內炎癥反應，改善腦內氧化應激水平是治療AD 的有效途徑。

淫羊藿次苷Ⅱ （IcarisideⅡ，ICS Ⅱ）是中藥淫羊藿的主要活性成分之一[6]，具有抗炎、抗腫瘤、抗雄性激素活性、神經保護等藥理作用[7-9]。本課題組前期研究發現，以ICS Ⅱ為主要藥效成分的參棗健腦口服液能有效抑制APP/PS1 小鼠腦內海馬神經元凋亡，促進海馬神經軸突再生[10]。基于上述研究結果，我們推測ICSⅡ具有改善APP/PS1 小鼠認知功能的作用，因此，采用筑巢實驗，Morris 水迷宮實驗、病理染色、免疫熒光染色，探究ICSⅡ改善Aβ 損傷引起的炎癥反應進而改善APP/PS1 小鼠認知功能的作用。

1 實驗材料

儀器：水迷宮分析系統（MS-1 型，成都儀器廠）；冰凍切片機（HM525NX，ThermoFisher）；熒光倒置顯微鏡（Ti-s，日本尼康公司）；超低溫冰箱（DW-86L386，青島海爾公司）；通用電泳儀（Power Pac Universal Power Supply，美國Bio-Rad 公司）；半干式蛋白轉膜儀（Trans-Blot SD，美國Bio-Rad 公司）；凝膠成像儀（5200Multi，天能公司）。

主要藥品與試劑：淫羊藿次苷 Ⅱ，購于四川省維克奇生物有限公司，批號：Wkq19050410；尼氏染色試劑盒、H&E 染色試劑盒，購于碧云天生物技術有限公司，批號分別為：C0117、C0105S；PBS粉末，購于索萊寶公司，批號：P1010；SOD 試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒（TBA 法），購于南京建成生物工程研究所，批號分別為：A001-1-2、A003-1-2；Rabbit Anti Aβ、Goat Anti-rabbit IgG/FITC、Rabbit Anti GFAP、AIF1 Polyclonal Antibody，購于博奧森生物有限公司，批號分別為：bs-0036R、bs-23379R、bs-0295G-FITC、bs-0199R、bs-1363R。驢抗兔Cy3 標記二抗，購于Jackson 公司，批號：88067。

實驗動物：3 月齡SPF 級APP/PS1 小鼠（雄性）購于江蘇華創信諾醫藥科技有限公司，合格證號為SCXK（蘇）2020-0009。動物使用許可證編號；SYXK（遼）2019-0004。同齡SPF 級C57BL/6 小鼠（雌性）購于遼寧長生生物有限公司，合格證號為SCXK（遼） 2017-0001。飼養于溫度20～25℃，相對濕度 40%～60%環境中，每日 12 h 光照維持，晝夜循環，自由攝食、飲水。雄性APP/PS1 小鼠和雌性C57BL/6 小鼠合籠繁殖，鑒定APP/PS1 陽性小鼠，飼養至7 月齡用于實驗，同窩出生的陰性C57BL/6 小鼠作為空白對照組。

2 實驗方法

2.1 動物分組與給藥

取7 月齡雄性APP/PS1 小鼠30 只，隨機分為模型對照組和ICS Ⅱ 給藥組，每組15 只；另取15 只同窩出生的雄性C57BL/6 小鼠作為空白對照組。根據課題組前期實驗結果確定ICS Ⅱ的灌胃給藥劑量為10 mg·kg-1[11]，每日1 次，連續灌胃28 d，空白對照組和模型對照組灌胃等體積的CMC-Na。

2.2 筑巢實驗檢測 APP/PS1 雙轉基因小鼠的日常生活能力

給藥第20 天，將小鼠單籠飼養，籠中墊料更換為玉米芯墊料，在小鼠適應2 d 后開始實驗。實驗開始時更換新的玉米芯墊料，并在投料口處放置2 疊衛生紙片（5 cm×5 cm），每疊10 張，拍照跟蹤小鼠筑巢情況，參照 5 分法原則進行評分[12-13]，連續觀察3 d。評分標準：1 分，沒有明顯的觸碰和撕咬紙片；2 分，撕碎部分紙片；3 分，撕碎大部分紙片，但沒有形成明顯巢狀；4 分，紙巾撕成碎片，并聚集形成1 個巢狀結構；5 分，紙片撕成碎片，并聚集在形成1 個完整或接近完整的巢狀結構。

2.3 Morris 水迷宮檢測APP/PS1 雙轉基因小鼠的學習和記憶能力

筑巢實驗結束后進行Morris 水迷宮實驗。水迷宮系統由1 個黑色圓形水池（直徑120 cm× 高60 cm）、1 個可移動的圓形平臺（直徑10 cm）、自動圖像采集分析系統組成。將桶內分成東、西、南、北4 個象限，將平臺置于其中1 個象限內，水面沒過平臺0.5～1.0 cm，溫度控制在21℃左右。Morris水迷宮實驗包括定位航行實驗和空間探索實驗。在定位航行實驗中，將小鼠從任一象限 1/2 弧度處面向池壁輕放于水中，如果小鼠 60 s 內無法找到平臺，則引至平臺停留 20 s，每個象限訓練 1 次，連續訓練 5 d，記錄小鼠找到平臺所用的時間（逃避潛伏期）評估小鼠的學習能力。定位航行實驗結束后撤去平臺進行空間探索實驗，選擇原平臺所處象限的對側作為小鼠的放入點，測定小鼠60 s 內穿越原平臺的次數以及在原平臺所在象限停留的時間，并記錄整個運動軌跡。根據穿越原平臺的次數、在原平臺所在象限停留時間百分比及第1 次穿越平臺前的游泳距離，評估小鼠的空間記憶能力[14-16]。

2.4 HE 染色法檢測小鼠腦組織病理損傷情況

采用 20%烏拉坦深度麻醉小鼠，暴露心臟，4%多聚甲醛（PFA）灌注固定，隨即剝離腦組織，去除嗅球和小腦，置于30%蔗糖溶液中，4℃脫水至沉底后吸干表面水分，冰凍包埋劑包埋，行厚度為10 μm 的連續冠狀切片，4%多聚甲醛固定15 min，蘇木素染色5 min，流水去浮色，1% 鹽酸乙醇分化10 s，0.5%氨水反藍10 s，dd H2O 潤洗，伊紅染色3～5 s，洗去浮色，經 70%、80%、90%、無水乙醇脫水各5 min，二甲苯 I、二甲苯 Ⅱ各透明10 min，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察皮層和海馬區域腦組織病理改變情況。

2.5 Nissl 法檢測皮層和海馬組織尼氏體數量

腦組織冰凍切片，4%多聚甲醛固定15 min，雙蒸水潤洗2 min，置于37℃尼氏染液中15 min，鏡下觀察，待尼氏體清晰后終止反應，雙蒸水潤洗5 s。依次經 90%、無水乙醇脫水，二甲苯透化5 min，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，拍照記錄，并統計皮層、海馬CA3 尼氏體數量。

2.6 免疫熒光染色法檢測腦組織Aβ、GFAP、IBA-1的表達情況

腦組織冰凍切片，4%多聚甲醛固定 15 min，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）潤洗3 次；1% Triton X-100透化30 min，5% 牛血清白蛋白（BSA）溶液封閉1 h，加入兔抗鼠Aβ（1:200）、兔抗鼠GFAP（1:200）、兔抗鼠IBA-1（1:150）置于濕盒中，4 ℃孵育過夜；PBS 潤洗3 次，然后加FITC 標記山羊抗兔二抗（1:200）、Cy3 標記的二抗稀釋液（1:200），室溫避光孵育1 h，PBS 潤洗3 次；DAPI 染核5 min，防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

2.7 TBA 法、羥胺法檢測小鼠腦內氧化應激指標

取各組小鼠的海馬及皮層組織，剪碎組織，冰水浴制備勻漿，加入適量的預冷PBS 溶液進行勻漿，4℃10 000 rpm，離心10 min，取上清液測定。按照SOD、MDA 檢測方法試劑盒說明書進行。

2.8 統計學方法

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統計分析，實驗數據以均數±標準差（±s） 表示，逃避潛伏期多組間不同時間點比較采用重復測量雙因素方差分析（Two-wayANOVA），其他數據多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 ICS Ⅱ 改善APP/PS1 小鼠日常生活能力

筑巢行為能夠反映小鼠的日常生活能力。結果如圖1 所示，空白對照組小鼠在投放紙片的 24 h 內即出現筑巢行為，在72 h 之內紙片被撕成小碎片，并筑成完整的巢狀結構，模型組的 APP/PS1 小鼠沒有將紙片撕成碎片，在 72 h 內紙片散落在鼠籠里，沒有筑成完整的巢狀結構，筑巢評分明顯低于空白對照組（P＜0.01）；ICS Ⅱ給藥組小鼠在 24 h 內出現筑巢行為，72 h 內大部分紙片被撕成碎片，形成較為完整的巢狀結構，筑巢評分明顯高于模型組（P＜0.01）。以上結果提示，ICS Ⅱ能夠改善APP/PS1 小鼠生活能力。

圖1 筑巢實驗檢測各組小鼠的日常生活能力（n=10）

3.2 ICS Ⅱ 改善APP/PS1 雙轉基因小鼠學習和記憶能力

Morris 水迷宮實驗結果如圖2、圖3 所示，從訓練的第3 天開始，與空白組比較，模型組小鼠的逃避潛伏期明顯增加（P＜0.01），目標象限停留時間減少（P＜0.01），游泳距離增加（P＜0.01），穿越平臺次數顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，給藥組小鼠找到平臺前游泳距離明顯縮短（P＜0.01）穿越平臺次數和目標象限時間百分比明顯升高（P＜0.01）。各組小鼠的游泳速度無統計學差異（P＞0.05），說明以上指標的改變并不是游泳速度不同導致的。以上結果提示，ICS Ⅱ 能改善 APP/PS1 小鼠學習和記憶能力。

圖2 定位航行實驗第 5 天的游泳軌跡典型圖（n=10）

圖3 Moriss 水迷宮實驗檢測各組學習和記憶能力（n=10）

3.3 ICS Ⅱ 改善APP/PS1 小鼠腦組織病理損傷

HE 染色結果顯示，空白組神經細胞數量多、層次清晰、排列整齊、胞質豐富，細胞核大而圓，胞核染色均勻，組織形態結構正常；模型組神經細胞則明顯減少、排列松散、形態不規則，細胞核皺縮明顯，說明模型小鼠腦組織明顯受損；與模型組比較，給藥組神經細胞數目明顯增多，層次較為清晰，胞漿、胞核染色均勻，細胞核固縮明顯減輕，以上結果提示ICS Ⅱ 能夠減輕APP/PS1 模型小鼠腦組織的病理損傷。HE 染色結果見圖4。

圖4 HE 染色檢測各組鼠皮層和海馬病理損傷情況

Nissl 染色結果顯示，空白組小鼠的皮層、海馬CA3 和DG 區神經細胞排列整齊且緊密，尼氏體呈塊狀或虎斑狀，尼氏體數量較多。模型組小鼠的皮層、海馬CA3 和DG 區的尼氏體數量都較空白組明顯減少（圖5）；給藥組小鼠的上述區域尼氏體數量明顯增多，與模型組比較差異顯著（P＜0.01，圖6）。以上結果表明，ICS Ⅱ 對APP/PS1 小鼠腦的組織具有明顯保護作用，顯著減輕了APP/PS1 小鼠腦內神經元的損傷。

圖5 Nissl 染色代表圖（n=10）

圖6 Nissl 染色檢測各組小鼠皮層和海馬的尼氏體病理損傷情況（n=3）

3.4 ICS Ⅱ 減少APP/PS1 小鼠腦內Aβ 淀粉樣蛋白沉積

免疫熒光結果顯示，空白組小鼠皮層和海馬部位少見Aβ 淀粉樣蛋白沉積，模型組小鼠皮層和海馬區域Aβ 斑塊數目顯著增多，ICS Ⅱ 給藥后Aβ 沉積明顯減少。結果說明ICS Ⅱ 能減少小鼠腦內Aβ沉積。見圖7。

圖7 免疫熒光染色法檢測各組海馬區Aβ 沉積情況（n=3）

3.5 ISC Ⅱ 抑制APP/PS1 小鼠海馬星形膠質細胞的過度活化

免疫熒光法檢測各組小鼠腦內GFAP 的表達情況，結果見圖8，與空白組比較，模型組小鼠海馬GFAP 蛋白表達明顯增多，提示模型組小鼠海馬部位星形膠質細胞過度活化；經ISC Ⅱ治療后，GFAP的表達較模型組明顯下降，結果說明ISC Ⅱ抑制了APP/PS1 小鼠海馬部位星形膠質細胞的過度活化。

圖8 免疫熒光 染色法檢測小鼠海馬星形膠質細胞的表達情況

3.6 ISC Ⅱ 抑制APP/PS1 小鼠海馬膠質細胞的過度激活

免疫熒光法檢測IBA-1 表達情況識別各組小鼠海馬部位的小膠質細胞數量，結果見圖9，與空白組比較，模型組小鼠的小膠質細胞胞體變大，呈現阿米巴蟲樣，其IBA-1 表達量明顯增加，提示模型組小鼠海馬部位膠質細胞過度活化。與模型組比較，ICS Ⅱ給藥組IBA-1 表達量明顯減少，并且小膠質細胞胞體變小，說明ISC Ⅱ能有效抑制 APP/PS1 雙轉基因小鼠海馬小膠質細胞的過度活化。

圖9 免疫熒光染色法檢測各組海馬小膠質細胞的活化情況

3.7 ICS Ⅱ 減輕APP/PS1 小鼠腦內的氧化應激損傷

為探索ICSⅡ對APP/PS1 小鼠腦內氧化應激反應的抑制作用，本研究檢測了小鼠腦組織SOD 與MDA 含量。結果見圖10，與空白組相比，模型組小鼠腦內SOD 的活性明顯降低（P＜0.01），MDA水平明顯升高（P＜0.01），說明模型組小鼠腦內存在明顯的氧化應激損傷；經ICS Ⅱ治療后，小鼠腦內SOD 的活性明顯升高，MDA 水平顯著降低。以上結果說明ICS Ⅱ 能減輕小鼠腦內氧化應激損傷。

圖10 TBA 法、羥胺法檢測各組腦內氧化損傷情況（n=6）

4 討論

AD 是一種由于自身中樞神經系統變性所致的慢性神經退行性疾病。隨著我國人口老齡化進程的加快，AD 患者急劇增多，預計到2030 年AD 患者數量將達到6 500 萬[17]。目前，科學家提出多種廣為認可的 AD 發病機制假說，如Aβ 級聯假說、膽堿能假說等[18]。

星形膠質細胞和小膠質細胞相互影響、密切關聯，二者的相互作用參與AD 的病理改變。突觸可塑性損害是AD 患者認知功能減退的重要原因。活化的小膠質細胞通過分泌神經毒素（如IL-1α 和TNF-γ）和補體成分（如C1q、C3）促使星形膠質細胞轉化為具有神經毒性的A1 表型，從而導致神經元死亡、突觸損害[19-20]。

APP/PS1 雙轉基因小鼠是AD 動物模型的典型代表。APP/PS1 基因病理表現為6～8 月齡出現斑塊沉積，膠質增生，突觸和神經元丟失，腦血管淀粉樣變性，7 月齡時出現空間和學習記憶障礙[21]。

本實驗結果表明模型組小鼠展示了更長的逃避潛伏期與航行距離，并且穿越平臺的次數與停留在原平臺所在象限的時間明顯減少，無法完成筑巢，小鼠海馬細胞排列稀疏，尼氏體模糊不清，Aβ 沉積過多、有炎癥反應、有氧化應激損傷，證明APP/PS1 小鼠已經出現癡呆癥狀。經過ICS Ⅱ 給藥后，APP/PS1 小鼠不僅能夠縮短平均逃避潛伏期與航行距離，而且延長穿越平臺的次數與停留在原平臺所在象限的時間。ICS Ⅱ 能提高小鼠的筑巢行為，改善小鼠腦內細胞形態，減輕小鼠腦內Aβ 沉積情況，改善小鼠腦內海馬區得炎癥反應與小鼠腦內氧化應激損傷。本實驗結果證明，ICS Ⅱ對APP/PS1 小鼠能起到一定的神經保護作用。

綜上所述，ICSⅡ能夠改善 APP/PS1 小鼠學習記憶能力，減少腦內炎癥反應、抗氧化應激與Aβ 的沉積所致的病理損傷。