丙二酸的生物合成及其發(fā)酵優(yōu)化

凌春榕,楊小雁,耿嘉寶,毛銀,趙運英*,鄧禹*

1(江南大學,糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122)2(江南大學,江蘇省生物活性產(chǎn)品 加工工程研究中心,江蘇 無錫,214122)3(山東渤海實業(yè)集團有限公司,山東省油脂油料精深加工技術 重點實驗室,山東 濱州,256599)

丙二酸,又稱胡蘿卜酸,是一種非常重要的二元羧酸,廣泛應用于多種領域,其酯類可用于染料和藥物的基本有機合成材料[1]。當前,丙二酸主要是通過化學法利用非可再生石油原料生產(chǎn)[2-5],化學法生產(chǎn)丙二酸面臨巨大的環(huán)境和價格問題,且存在效率低、污染環(huán)境重和提純步驟復雜問題[1, 6]。因此通過工業(yè)生物技術使用可再生原料制備丙二酸具有更大的競爭優(yōu)勢。

隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展,研究者已經(jīng)開發(fā)了以β-丙氨酸、丙二酰輔酶A和草酰乙酸為前體的3種非天然代謝途徑合成丙二酸[7]。SONG等[8]在大腸桿菌W3110中過量表達6個基因(ppc、aspA、panD、pa0132、yneI和sdh),構建了一種經(jīng)過β-丙氨酸途徑的丙二酸生物合成途徑,通過補料分批發(fā)酵,該工程菌株能夠生產(chǎn)3.60 g/L的丙二酸。付雯宣等[9]通過過量表達ppc、aspC、panD、pa0132、yneI和pyc基因,在大腸桿菌BL21中成功構建了丙二酸生物合成重組菌株;并將ppc和aspC以及pa0132和yneI分別進行融合表達,在5 L發(fā)酵罐中,丙二酸產(chǎn)量最高達5.61 g/L。丙二酰輔酶A途徑基于來自釀酒酵母的EHD3突變基因編碼的酰基輔酶A水解酶,在酵母和大腸桿菌中過表達該基因可合成丙二酸[10]。LI等[11]對線粒體3-羥基異丁酰輔酶A水解酶基因EHD3進行了突變,并進一步探索了突變株和ACC1**與Delta序列位點的整合,通過調節(jié)丙二酰輔酶A途徑中關鍵酶的表達來改善前體供應和抑制其競爭途徑,該重組菌株在5 L發(fā)酵罐中可以生產(chǎn)1.62 g/L的丙二酸。GU等[12]設計了一種新的丙二酸合成途徑,通過體外篩選獲得一種草酰乙酸脫羧酶,使草酰乙酸經(jīng)α-酮基脫羧酶和琥珀酸半醛脫氫酶依次催化轉化為丙二酸;并將該途徑在嗜熱菌絲體中構建,丙二酸的產(chǎn)量為42.5 mg/L。該途徑大大縮短了丙二酸的合成途徑,意義重大。

本文通過過量表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, Ppc)基因(ppc)、天冬氨酸轉氨酶(aspartase, AspA)基因(aspA)、天冬氨酸-α-脫羧酶(aspartate-α-decarboxylase, PanD)基因(panD)、琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase, SdhC)基因(sdhC)、β-丙氨酸丙酮酸轉氨酶(β-alanine pyruvate transaminase, Pa0132)基因(pa0132)和琥珀酸半醛脫氫酶(succinic semialdeyde dehydrogenase, YneI)基因(yneI)構建丙二酸生物合成菌株BL21(PPP),并對該菌株發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化,進一步提高了丙二酸的產(chǎn)量,為生物法合成丙二酸提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

本實驗所用菌株和質粒詳見表1及表2。

表1 本研究所用菌株Table 1 Strains used in this study

表2 本研究所用質粒Table 2 Plasmids used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10;

SOB(super optimal broth)培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨20,酵母粉5,MgCl2·6H2O 2.03,NaCl 0.5,KCl 0.186;

TB(terrific-broth)培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨12,酵母粉24,K2HPO4·3H2O 16.34,KH2PO42.31;

YT(yeast extract tryptone)培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨16,酵母粉10,NaCl 10;

固體培養(yǎng)基需添加20 g/L的瓊脂粉,添加的抗菌素終濃度為1 mmol/L。

1.1.3 試劑

DNA聚合酶、Marker,TaKaRa公司;C115重組酶,諾唯贊公司;DNA純化及質粒提取試劑盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;丙二酸、丁二酸標準品、生物素,Sigma公司;富馬酸,北京伊諾凱科技有限公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG),碧云天生物公司;胰蛋白胨、酵母提取物,英國Oxoid公司;瓊脂粉、葡萄糖、NaCl、MgCl2·6H2O、KCl、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、乙酸、乳酸等試劑購自上海國藥試劑集團。

1.1.4 引物

本研究所有引物合成及測序由蘇州安升達生物有限公司完成,引物序列如表3所示。

表3 本研究所用引物序列Table 3 Primer sequence used in this study

1.2 實驗方法

1.2.1 質粒構建

基因來源:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)、天冬氨酸轉氨酶(aspartase,AspA)基因(aspA)、天冬氨酸-α-脫羧酶基因(panD)、琥珀酸脫氫酶基因(sdhC)來源于BL21(DE3)。β-丙氨酸丙酮酸轉氨酶基因(pa0132)來源于銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、琥珀酸半醛脫氫酶基因(yneI)來源于大腸桿菌K12。

構建:分別用pTrc-aspA-F/pTrc-aspA-R、pTrc-panD-F/pTrc-panD-R、pCDF-PPC-F/pCDF-PPC-R、pCDF-SDHC-F/pCDF-SDHC-R和pRSF-yneI-F/pRSF-yneI-R五對引物以大腸桿菌基因組為模板,擴增獲得aspA、panD、ppc、sdhC和yneI基因;β-丙氨酸丙酮酸轉氨酶基因(pa0132)由蘇州安升達生物科技有限公司合成,用引物pRSF-pa0132-F和pRSF-pa0132-R擴增獲得pa0132基因;用pTrc-bone-F和pTrc-bone-R、pCDF-bone-F和pCDF-bone-R、pRSF-bone-F1和pRSF-bone-R1分別將質粒pTrc99A、pCDFDuet-1和pRSFDuet-1線性化,與相應片段在同源重組酶C115的作用進行同源重組,獲得質粒pTrc-T7-aspA-panD、pCDF-T7-ppc-sdhC和pRSF-T7-pa0132。用引物pRSF-bone-F2和pRSF-bone-R2將pRSF-T7-pa0132線性化,將yneI基因和pRSF-T7-pa0132全質粒片段在同源重組酶C115的作用下進行同源重組,獲得質粒pRSF-T7-pa0132-T7-yneI。

1.2.2 重組菌株的構建

通過電轉化法將質粒pTrc-T7-AspA-panD、pCDF-T7-ppc-sdhC和pRSF-T7-pa0132-T7-yneI轉化至BL21(DE3)感受態(tài)細胞中,通過菌落PCR進行驗證,獲得重組菌BL21(PPP)。

1.2.3 基因表達的鑒定

挑取單克隆于25 mL的LB培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)10～12 h。再將上述菌液轉接至LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng),按2%接種量轉接至LB培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)3～4 h后,添加終濃度為1 mmol/L的IPTG進行誘導,并轉至30 ℃進行培養(yǎng)。隔12 h取樣,樣品處理后進行SDS-PAGE分析。

1.2.4 發(fā)酵實驗

搖瓶發(fā)酵:重組菌株接種至LB培養(yǎng)基中37 ℃?zhèn)鞔鷥纱?發(fā)酵時取傳代結束菌液接種至添加了4 g/L葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中,37 ℃、250 r/min 培養(yǎng)3～4 h,添加IPTG進行誘導,轉移至30 ℃培養(yǎng),發(fā)酵72 h,每隔12 h取樣,測定OD600值和丙二酸合成量。

培養(yǎng)基種類優(yōu)化:選取LB、YT、SOB及TB培養(yǎng)基進行發(fā)酵實驗,探究最適培養(yǎng)基種類。

誘導劑濃度優(yōu)化:在SOB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～4 h后添加不同濃度(0.05、0.1、0.5、1.0、1.5 mmol/L)的IPTG,探究最適誘導劑濃度。

初始糖濃度優(yōu)化:在SOB培養(yǎng)基中添加不同質量濃度(4、8、12、16 g/L)的葡萄糖作為初始糖,探究最適初始糖濃度。

外源添加物質:以添加4 g/L葡萄糖的SOB培養(yǎng)基為基礎,在發(fā)酵4 h后添加不同質量濃度(0、25、50、75、100 μg/L)的生物素或不同質量濃度(0、4、8、16、24 g/L)的富馬酸。

5L發(fā)酵罐發(fā)酵:重組菌株接種至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h,再按2%接種量接種于LB培養(yǎng)基中,37 ℃、250 r/min 培養(yǎng)12 h后,以10%的接種量接種于5 L發(fā)酵罐。發(fā)酵期間用氨水進行pH調節(jié),葡萄糖母液質量濃度為800 g/L。5 L發(fā)酵罐起始裝液量為2 L,起始轉速為200 r/min,每隔2 h提高50 r/min,將溶氧維持在25%左右,直到轉速為400 r/min,一直維持到發(fā)酵結束。

1.2.5 代謝物含量測定及定性分析

細胞的生長情況:通過600 nm處的光密度(OD600)來衡量,上罐前期糖及乙酸等含量使用Y15全自動分析儀(BioSystems,巴塞羅那,西班牙)進行快速檢測,每次取樣時記錄數(shù)據(jù)以繪制菌株生長曲線。

定量:發(fā)酵液以12 000 r/min離心10 min,取上清液用10 mmol/L H2SO4進行稀釋,用0.22 μm水系濾膜過濾,經(jīng)由HPLC檢測代謝物的含量。檢測所用流動相為5 mmol/L H2SO4,流速0.6 mL/min,色譜柱為Bio-Rad HPX-87H色譜柱,柱溫35 ℃,進樣量10 μL。通過示差檢測器對發(fā)酵液中的代謝物進行定量。

定性:本研究采用LC-MS對發(fā)酵液進行分析。

2 結果與分析

2.1 重組菌株的構建

富馬酸可以在AspA、PanD、Pa0132和YneI的共同作用下轉化為丙二酸,如圖1所示,該過程涉及多個酶參與催化反應,為了避免4個基因在一個質粒上共同表達造成質粒負擔過大,我們將其兩兩組合分別構建在2個質粒上進行表達,如圖2-a所示。為了增加前體的供應,同時過量表達ppc基因和sdhC基因。

將上述的3個質粒電轉化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中,重組轉化子經(jīng)菌落PCR(正確的克隆條帶分別是:1 964、3 124、2 934 bp)和SDS-PAGE檢測結果。如圖2-b和圖2-c所示,獲得丙二酸合成菌株BL21(PPP)。

Glucose-葡萄糖;PEP-磷酸烯醇式丙酮酸;Pyruvate-丙酮酸;Acetyl-CoA-乙酰輔酶A;Citrate-檸檬酸;Isocitrate-異檸檬酸;α-KG-α-酮戊二酸;Succinyl-CoA-琥珀酰輔酶;Succinate-琥珀酸;Fumarate-富馬酸;Malate-蘋果酸;OAA-草酰乙酸;L-Asp-L-天冬氨酸;β-Ala-β-丙氨酸;MSA-丙二 酸半醛;MA-丙二酸圖1 大腸桿菌的丙二酸合成代謝途徑Fig.1 Metabolic pathway for the production of malonate acid in Escherichia coli注:粗箭頭表示相應基因通過質粒進行過表達。

a-質粒圖譜;b-菌落PCR驗證;c-SDS-PAGE驗證圖2 質粒圖譜、菌落PCR驗證及SDS-PAGE驗證結果Fig.2 Plasmid mapping, the colony PCR validation and SDS-PAGE validation results

2.2 BL21(PPP)丙二酸生物合成菌株的搖瓶發(fā)酵

將構建好的菌株BL21(PPP)以2%的接種量接種至SOB培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵,以驗證其生產(chǎn)丙二酸的能力,結果如圖3-a所示,該菌株在發(fā)酵72 h可通過高效液相法檢測到0.24 g/L的丙二酸。隨后通過LC-MS檢測對該樣品進行丙二酸定性分析,結果如圖3-b所示,樣品中的特征離子碎片與標品相同,由此可確定該菌株可生產(chǎn)丙二酸。

a-菌株BL21(PPP)的生長曲線及丙二酸產(chǎn)量圖; b-丙二酸標準品及發(fā)酵72 h樣品質譜檢測圖譜圖3 菌株 BL21(PPP) 丙二酸的產(chǎn)量及發(fā)酵液 液質聯(lián)用檢測分析結果Fig.3 Production of malonic acid in strain BL21(PPP) and its LC-MS analysis results

2.3 BL21(PPP)丙二酸生物合成菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

由于獲得的丙二酸的積累量很低,為了獲得更高的產(chǎn)物濃度,對菌株BL21(PPP) 的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化(單因素試驗),包括培養(yǎng)基種類、誘導劑濃度、初始糖濃度和外源添加物等。

2.3.1 培養(yǎng)基種類對丙二酸積累的影響

選取LB、YT、SOB及TB培養(yǎng)基進行發(fā)酵實驗,結果如圖4所示。

圖4 不同發(fā)酵培養(yǎng)基對丙二酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of different fermentation medium on malonic acid production

在不同培養(yǎng)基當中,菌株BL21(PPP)的生長狀況及生產(chǎn)丙二酸的能力均不同,菌株BL21(PPP)在TB培養(yǎng)基中獲得較高的生物量,這可能與TB培養(yǎng)基中含有較多氮源有關,但菌體合成過量的含氮類代謝副產(chǎn)物[13],不利目標產(chǎn)物的合成。菌株BL21(PPP)在SOB培養(yǎng)基中能夠積累較多的丙二酸(0.48 g/L)。因此,在本實驗中以SOB培養(yǎng)基進行發(fā)酵。

2.3.2 誘導劑濃度優(yōu)化

上述3個質粒的啟動子均為誘導型,需要借助IPTG誘導目的基因表達[14],而IPTG濃度對菌體的生長及基因的表達均有一定的影響[15],故選擇合適的IPTG濃度對于合成丙二酸有重要意義。由圖5可知,當IPTG濃度為0.05 mmol/L時,菌株BL21(PPP)生長未受到明顯抑制,并且能夠合成較多的丙二酸(0.39 g/L)。

a-不同IPTG濃度下菌株 BL21(PPP) 的生長曲線; b-不同IPTG濃度下菌株 BL21(PPP) 丙二酸的產(chǎn)量圖5 IPTG濃度優(yōu)化Fig.5 Optimization of the IPTG concentration

2.3.3 初始糖濃度優(yōu)化

葡萄糖作為快速碳源,容易被菌體吸收利用,經(jīng)常被添加在發(fā)酵培養(yǎng)基中供菌體生長及合成目的產(chǎn)物。但是葡萄糖若供給過量,可能會引起“葡萄糖效應”,影響菌體生長,并且可能會產(chǎn)生大量雜酸,抑制目的產(chǎn)物的合成[16],所以需要探究最適合丙二酸合成的初始葡萄糖濃度。由圖6可知,在菌株BL21(PPP)在初始葡萄糖添加量為4 g/L時能合成較多的丙二酸(0.32 g/L),隨著添加葡萄糖濃度的增加,發(fā)酵結束時葡萄糖剩余量越多,并且會積累較多的乙酸,而乙酸過多會影響菌體生長,不利于蛋白的表達,并抑制產(chǎn)物的合成[17]。

圖6 初始糖濃度的優(yōu)化Fig.6 Optimization of the initial glucose concentration

2.3.4 生物素對丙二酸合成的作用探究

磷酸烯醇式丙酮酸在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Ppc)的作用下轉化為草酰乙酸,縮短了代謝路徑,減少碳流失和能量的損耗。但是二元酸代謝產(chǎn)物對Ppc活力有一定的抑制作用,其中天冬氨酸是強抑制劑[18],L-天冬氨酸可與Ppc結合,改變其構像,使其失去催化能力[19]。因此,本文引入T7啟動子上調ppc基因的表達。另外,生物素是多種羧化酶的輔酶[20],陳園園等[21]通過添加生物素使目標產(chǎn)物提高了84.26%。結果如圖7所示,在添加75 μg/L生物素的發(fā)酵條件下,丙二酸的積累量較高(0.34 g/L),比對照組提高了32.59%,說明一定量的生物素添加有利于丙二酸合成。

圖7 生物素對丙二酸產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of biotin on malonic acid production

2.3.5 添加富馬酸對丙二酸合成的影響

富馬酸作為β-丙氨酸途徑的前體物質,提高富馬酸的濃度,可以提高碳通量,進而提高丙二酸的合成。為了探究最適的外源添加富馬酸濃度,以添加了4 g/L葡萄糖的SOB培養(yǎng)基為對照組,分別添加不同濃度的富馬酸,用菌株BL21(PPP)進行搖瓶發(fā)酵實驗。不同濃度富馬酸的添加都有利于丙二酸產(chǎn)量的提高(圖8),隨著富馬酸濃度的提高,丙二酸的產(chǎn)量逐漸提高。綜合考慮生產(chǎn)成本及富馬酸的轉化率,選擇富馬酸添加質量濃度為8 g/L,此時,丙二酸的產(chǎn)量和富馬酸的摩爾轉化率較高,為1.2 g/L和0.17 mol/mol(丙二酸/富馬酸)。

圖8 添加富馬酸對丙二酸產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of fumarate on malonic acid production

2.4 5 L發(fā)酵罐中重組菌株BL21(PPP)發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1 補料方式對重組菌株BL21(PPP)合成丙二酸的影響

為了進一步提高丙二酸的產(chǎn)量,參考搖瓶發(fā)酵優(yōu)化的結果,本文采用5 L發(fā)酵罐進行放大培養(yǎng)對重組菌合成丙二酸的能力進行檢測。首先在初始糖消耗完畢之后,進行葡萄糖的單獨連續(xù)補加,流加速度為7 mL/h,并在37 ℃培養(yǎng)12 h后添加IPTG (0.05 mmol/L)進行誘導,培養(yǎng)溫度降低至30 ℃。結果如圖9-a所示,菌株BL21(PPP)最高OD600值約為11.84,在發(fā)酵72 h可積累1.5 g/L丙二酸。但是我們發(fā)現(xiàn)這種連續(xù)補料方式,在發(fā)酵后期因糖消耗速度下降造成大量的葡萄糖積累,易引起“葡萄糖效應”。

a-連續(xù)補料發(fā)酵結果;b-間歇補料發(fā)酵結果圖9 菌株BL21(PPP) 5 L發(fā)酵罐發(fā)酵結果Fig.9 Results of 5 L fermenter fermentation of strain BL21(PPP)

改用間歇補料的方式進行葡萄糖的補加,在培養(yǎng)物中葡萄糖質量濃度低于約0.5 g/L時進行補加,每次手動補加至終質量濃度為8 g/L;由于在5 L發(fā)酵罐發(fā)酵過程中菌體量比搖瓶發(fā)酵的多,相同的IPTG濃度可能會造成拉動力不夠,所以本文嘗試分別在12 h和36 h都進行誘導劑的添加,每次添加IPTG的終濃度為0.05 mmol/L。結果如圖9-b所示,菌株BL21(PPP)在79 h能合成約2.5 g/L的丙二酸,提高了66.67%;最高OD600值約為17.8,提高了約50.34%。

2.4.2 外源添加富馬酸對重組菌株BL21(PPP)合成丙二酸的影響

在前期的實驗中確定了富馬酸的添加質量濃度(8 g/L),本研究嘗試在12 h誘導時將富馬酸與誘導劑IPTG一起加入,但是發(fā)現(xiàn)丙二酸產(chǎn)量僅為2.9 g/L(圖10-a)。猜測添加的富馬酸可能被用于菌體生長,導致富馬酸進入丙二酸合成途徑的量較少。所以本文嘗試對發(fā)酵溫度進行梯度降溫,以期降低菌株的生長速度,并且增加了富馬酸的添加,進行5次投放。同樣采用間歇補料的方式進行葡萄糖的補加,結果如圖10-b所示,丙二酸的產(chǎn)量提高至12.42 g/L,富馬酸的摩爾轉換率為0.346 mol/mol(丙二酸/富馬酸)。

a-外源添加1次富馬酸發(fā)酵結果; b-外源添加5次富馬酸并進行梯度降溫的發(fā)酵結果圖10 菌株BL21(PPP)外源添加富馬酸的5 L發(fā)酵罐結果Fig.10 Results in 5 L fermenter of strain BL21(PPP) with addition of fumaric acid

3 結論與討論

天冬氨酸可以由草酰乙酸通過天冬氨酸轉氨酶催化的轉氨化反應生成,也可以由富馬酸通過AspA催化的胺化反應生成。但是由草酰乙酸和谷氨酸生成天冬氨酸和α-酮戊二酸的轉氨化反應,會進一步與α-酮戊二酸的還原反應相耦合,以再生谷氨酸[22];同時AspC可以催化丙酮酸生成L-丙氨酸,并且與生成L-天冬氨酸的效率相當[23]。由于此轉氨化特性,AspC路線不易控制,可以通過提供額外的底物實現(xiàn)對AspA路線的有效控制。所以,本文為了實現(xiàn)丙二酸的生物合成,參照β-丙氨酸途徑合成丙二酸[8],以大腸桿菌BL21(DE3)作為底盤細胞,選擇AspA路線,通過過表達6個基因(aspA、panD、ppc、sdhC、yneI和pa0132),構建了丙二酸合成途徑,獲得菌株BL21(PPP),并通過搖瓶發(fā)酵驗證其合成丙二酸的能力。為了進一步獲得更高的丙二酸產(chǎn)量,本文對菌株的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化,我們獲得了有利于丙二酸合成的搖瓶發(fā)酵條件。為了驗證該菌株的丙二酸合成能力,利用5 L發(fā)酵罐對其進行放大培養(yǎng),在5 L發(fā)酵罐中丙二酸的最高積累量為12.42 g/L,富馬酸的摩爾轉換率為0.346 mol/mol(丙二酸/富馬酸),但是我們發(fā)現(xiàn)副產(chǎn)物積累量是非常高的,導致碳源大量流失。產(chǎn)量低的另一個原因是丙二酸合成途徑中的關鍵酶缺失,并且YneI催化丙二酸半醛轉化為丙二酸的效率不高,這可從SONG等[8]的研究結果看出,如何提高丙二酸半醛的轉化效率是提高丙二酸產(chǎn)量的關鍵,后續(xù)可以考慮對該酶進行定點隨機突變,以期獲得對丙二酸半醛有高催化效率的突變體。