紅花羊蹄甲花瓣花色苷的組分鑒定及其穩定性研究

龍勇益,陳玉嬌,郭松,周永升,嚴其偉,盧祥,張鵬*

1(廣西科技師范學院 食品與生化工程學院,廣西 來賓,546199)2(廣西科技師范學院 壯瑤藥品質生物學 重點實驗室,廣西 來賓,546199)

紅花羊蹄甲(BauhiniablakeanaDunn.)又稱為洋紫荊、艷紫荊,是我國嶺南一帶的一種綠化觀光樹種,也是羊蹄甲屬中較為常見的一個品種[1]。紅花羊蹄甲的葉、根、樹皮和花可做藥用,其具有止血、健脾燥濕、潤肺止咳、消炎的功效,可治療咯血、消化不良、咳嗽、便秘、肝炎、肺炎等疾病[2]。紅花羊蹄甲的花期長、花量大、花色艷、花味香,花瓣含有豐富的花色苷類物質,水溶性好、色值高,具有抗氧化及清除自由基、抗突變、抗癌、抗炎及抗病毒等多種生物活性[3]。在每年的冬季至次年的春季間紅花羊蹄甲的花瓣自然飄落而廢棄,寶貴的天然色素資源被浪費掉。研究紅花羊蹄甲花色苷類物質的組成和種類及其穩定性,對提高紅花羊蹄甲資源的綜合利用率及深加工技術和應用產品的開發具有重要意義。

目前關于紅花羊蹄甲花色苷的提取方法[4-5]、抗氧化活性[6]和水提取物毒理學研究[7]已有文獻報道,但紅花羊蹄甲花呈色的物質基礎、花色苷類型和組成、分子的化學和空間結構等缺少研究。因此,本文從紅花羊蹄甲花瓣中提取天然色素,利用HPLC分析鑒定紅花羊蹄甲花色苷組分,并探討pH值、溫度、光照、金屬離子等對紅花羊蹄甲色素的影響,為紅花羊蹄甲色素應用于功能性食品、生物醫學和制藥等行業提供理論基礎,旨在擴大紅花羊蹄甲的應用領域。

1 材料和方法

1.1 材料

紅花羊蹄甲花瓣采自廣西來賓,原料通過恒溫鼓風干燥箱45 ℃烘干,粉碎之后過60目篩,放置于干燥陰涼處避光保存備用。

乙醇、鹽酸、KCl、醋酸鈉、檸檬酸、檸檬酸三鈉、Na2HPO4、Na2CO3、NaHCO3、NaCl、CaCl2、MgCl2、FeCl2、乳糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨醇,均為分析純,北京化工;矢車菊素-3-葡萄糖苷標準品(純度≥98%),南京源植生物科技有限公司;試驗過程中使用的水均為去離子水。

1.2 儀器

FA-2004B電子天平,上海越平科學儀器有限公司;HH-S2數顯恒溫水浴鍋,金壇市醫療儀器廠;FW-135超微粉碎機,天津市泰斯特儀器有限公司;R-1001VN旋轉蒸發儀、SHB-IIIG循環水式多用真空泵,鄭州長城科工貿有限公司;XH-MC-1微波合成儀,北京翔鵠科技發展有限公司;STA250熱重分析儀,德國NETZSCH;UV-5100紫外分光光度計,上海元析儀器有限公司;FD5-3真空冷凍干燥機,美國SIM International Group;CR-5色彩色差儀,柯尼卡美能達控股公司;U3000液相色譜,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;FOCUCY球磨儀,湖南弗卡斯實驗儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 色素的提取

參照焦淑清等[8]的方法并做適當修改。原料經粉碎,過60目篩,準確稱取4.0 g的花瓣粉末置于250 mL的三角燒瓶中。按料液比1∶30(g∶mL)加入120 mL酸性乙醇,放置于微波合成儀中。600 W功率微波下處理90 s,抽濾,旋轉蒸發減壓濃縮至80 mL,用pH 3.0的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液定容至250 mL,即得花瓣花色苷提取液,濃縮、凍干,于-18 ℃避光備用。

1.3.2 總花青素含量

采用pH示差法[9-10]測定總花青素的含量:準確稱取紅花羊蹄甲色素凍干粉0.25 g,先用60%(體積分數)乙醇溶解,后用蒸餾水定容至25 mL容量瓶中制成待測液。分別取0.3 mL的待測液于10 mL容量瓶中,用pH 1.0的緩沖液(125 mL 0.2 mol/L KCl與375 mL 0.2 mol/L 鹽酸混勻)和pH 4.5的緩沖液(400 mL 1 mol/L醋酸鈉、240 mL 1 mol/L 鹽酸與360 mL雙氧水混勻)定容至刻度,避光反應30 min,分別在525 nm和700 nm處測定吸光值。平行測定3次,根據公式(1)計算花青素含量。

(1)

式中:A=[(A525-A700)pH 1.0]-[(A525-A700)pH 4.5];MW,矢車菊-3-葡萄糖苷的相對分子質量(449.2 g/mol);DF,稀釋因子;V,萃取物體積,mL;ε,矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數[26 900 L/(mol·cm)];L,比色皿徑長度(1 cm);m,樣品的質量,g。

1.3.3 色度的測定

取0.25 g色素凍干粉用檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH 3.0、5.0、7.0)溶解,另取0.25 g色素凍干粉用Na2CO3-NaHCO3緩沖液(pH 9.0、11.0)溶解,兩者均定容至25 mL棕色容量瓶中,制得質量濃度10 mg/mL的色素溶液。色素緩沖液溶液于室溫下放置30 min后,取10 mL的色素溶液于試管中用色彩色差儀測定其色度值。色度值采用CIEL*a*b*色度空間表示,其中L*代表明亮度,a*代表紅綠度,b*代表黃藍度。

1.3.4 高效液相色譜法鑒定色素組分

1.3.4.1 樣品前處理

采用高效液相色譜串聯質譜技術測定色素提取物中花青素和花色苷的含量。參照XU等[11]的方法并略加改動。取出超低溫(-20 ℃)保存的色素凍干粉,球磨儀(30 Hz,1.0 min)研磨至粉末狀;稱取100 mg的粉末,溶解于10 mL提取液[V(無水乙醇)∶V(水)∶V(鹽酸)=15∶4∶1],40 kHz 超聲30 min,沸水浴水解60 min,用提取液補足體積至10 mL,離心(12 000 r/min、3 min),吸取上清液,用0.45 μm微孔濾膜過濾樣品,置于進樣瓶中,供液相色譜分析。

1.3.4.2 色譜條件

液相色譜條件:AQ C18(5 μm,4.6 mm×150 mm);流動相A:超純水(含0.1%甲酸),流動相B:乙腈(含0.1%甲酸);洗脫梯度:0.00 min B相比例為8%,2.00 min增至12%,保持3 min,10.00 min 增至20%,12 min增至25%,18 min增至45%,20 min增至80%,30 min降至8%,并平衡2 min;流速1 mL/min;柱溫35 ℃;進樣量10 μL。

1.3.4.3 標準曲線的繪制及樣本含量

配制15、30、60、150、300 μg/mL不同質量濃度的標準品溶液,獲取各個濃度標準品的對應定量信號的液相色譜數據,以標準品濃度為橫坐標,標準品峰面積為縱坐標,繪制不同物質的標準曲線,相關系數R>0.99。采用一標多定的方法測定對應的花色苷衍生物。樣品中花青素含量按公式(2)計算:

(2)

式中:c,樣本中色譜峰的峰面積代入標準曲線得到的質量濃度值,ng/mL;V,提取時所用溶液的體積,μL;m,稱取的樣本質量,g。

1.3.5 穩定性試驗

1.3.5.1 熱重分析試驗

稱取一定質量的色素凍干粉,置于氧化鋁坩堝中,采用熱重分析儀進行熱分析測試。初始溫度25 ℃,升溫速率10 ℃/min,終止溫度1 000 ℃。得到熱重(thermogravimetric,TG)圖譜,及微商熱重(derivative thermogravimetry,DTG)曲線。

1.3.5.2 熱穩定性試驗

(3)

1.3.5.3 光照對色素穩定性的影響

參照于文娟等[12]的方法進行適當的修改。用0.1 mol/L的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH 3、pH 7)配制不同的色素溶液(0.8 mg/mL)。取100 mL配制好的色素溶液于具塞刻度試管中,分別置于室內自然光和避光條件下保存,每1 d測定1次色度值,共測定5 d。色度值按照1.3.3節的方法測定,ΔE計算參照公式(3)。

1.3.5.4 金屬離子對色素穩定性的影響

用0.1 mol/L的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH 3、pH 7)配制0.1 mol/L KCl、NaCl、CaCl2、MgCl2、FeCl2溶液,取0.2 g色素凍干粉,用金屬鹽溶液溶解,定容至100 mL的容量瓶中,振搖均勻,放置于室溫陰暗處保存,每1 d測定1次色度值,共測定5 d。色度值按照1.3.3節的方法測定,ΔE計算參照公式(3)。

1.3.5.5 甜味劑對色素穩定性的影響

參考楊雁等[13]的方法進行稍作修改。用0.1 mol/L的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH 3、pH 7)配制5%(質量分數)的乳糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨醇、木糖醇溶液,取0.2 g色素凍干粉,用糖溶液溶解,定容至100 mL的棕色容量瓶中,振搖均勻,室溫下避光保存,每1 d測定1次色度值,共測定5 d。色度值按照1.3.3節的方法測定,ΔE計算參照公式(3)。

在物流作業這一環節中，針對作業時間以及貨物遺失等來說，訂單處理、分揀與驗貨等都是其關鍵控制點。要控制關鍵點，必須明確安全和不安全產品之間的界限，要保證產品安全性，必須嚴格管理關鍵控制點，使其處于特定臨界范圍。可以將臨界范圍分為三種類型，分別為化學范圍、微生物范圍以及物力范圍。

1.3.6 數據分析

所有試驗均重復測定3次,結果以平均值±標準差表示。采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。采用方差分析(ANOVA)和鄧肯檢驗(Duncan’s test)確定顯著性差異(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 色度的影響

從表1可見,隨著pH的增加,紅花羊蹄甲色素由紅色變藍黑色,色度值基本呈現下降的趨勢。pH=3時,色素溶液的色度值最大,其L*、a*、b*值分別為29.74、59.55、21.06,色素呈鮮紅色;pH=7時,色素溶液的L*、a*、b*值分別為18.28、23.22、0.42,色素呈暗紫色;當pH=9、pH=11時,L*、b*值最小分別為為1.26、1.72、2.18、2.96,顏色最暗,呈現出藍黑色。紅花羊蹄甲色素溶液的L*、a*、b*值隨著pH值的增加而不斷減小,其顏色逐步從紅色、暗紫色向黑色轉變。紅花羊蹄甲色素在不同pH值下所呈現出的顏色變化趨勢,可能在智能包裝膜及在食品工業中有關鍵應用[14]。

表1 pH值對紅花羊蹄甲色素色度影響Table 1 Effect of pH on the color indexes of pigment from B. blakeana flower

2.2 花青素定量定性分析

圖1為花青素標準品色譜圖。

圖1 標準品色譜圖Fig.1 Chromatogram of the standards

由表2可知,紅花羊蹄甲中花色苷總的花青素含量為11.28 mg/g,主要含有4種花青素單體化合物。其中,飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、芍藥素-3-O-葡萄糖苷是所有提取物中的主要化合物,含量最高,為6 801.12、2 069.49 μg/g,顯著高于矮牽牛色素和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(84.65、667.9 μg/g)。

2.3 穩定性試驗結果

2.3.1 熱重分析

由圖2和表3可以看出,紅花羊蹄甲的熱分解根據質量損失可以分為3個階段,在54.6～111.3 ℃時,主要是紅花羊蹄甲色素的自由水和結合水揮發導致質量下降,說明色素經過冷凍干燥后仍然含有3.59%的水分。經過一段時間的升溫后,溫度達到111.3～257.9 ℃時,色素開始有少量的損失,損失率為27.16%,這可能是由于色素中殘余的小分子物質發生熱解吸[15]。當溫度由257.9 ℃升至600 ℃時,色素可能存在其他的熱穩定相,質量損失達到最大值,為43.20%;隨著溫度的上升過程中,色素分解繼續,剩余色素的質量為25.79%。伴隨著溫度的升高,色素的DTG曲線呈現出3個峰形,峰形的拐點分別為173.3、279.2、461.0 ℃。另外,色素的DTA曲線有一個放熱峰,峰值為150.1 ℃,溫度范圍為79.3～183.6 ℃,峰面積為421.9 J/g。以上結果表明紅花羊蹄甲的色素在54.6～111.3 ℃具有良好的熱穩定性。

表2 紅花羊蹄甲花色苷中總花青素含量和花青素單體組成Table 2 Salt sneakhoe nailor pigment pigmentation and cosmetic course content and humanin monochrome

圖2 紅花羊蹄甲色素TG曲線、DTG曲線和熱差分析曲線Fig.2 TG, DTG and DTA curves of pigment from the B. blakeana flower

表3 紅花羊蹄甲花色苷熱重分析表Table 3 Thermogravimetric stabilities of pigment from the B. blakeana flower

2.3.2 溫度的穩定性影響

從圖3可知,50 ℃時,pH=3的色素溶液的ΔE隨時間的延長增長幅度較小,最高值為2.06,顏色呈粉紅色;pH=7的色素溶液的ΔE增長幅度較大,最高值達9.76,色素呈淡紅色向淡黃色變化的趨勢。75 ℃時,色素隨著熱處理時間的延長,pH=3和pH=7條件下色素溶液ΔE增長幅度變大,其最高值分別為8.54、17.46,色素在酸性溶液中呈粉紅色,堿性溶液中呈淡粉紅色向淺黃色過度的現象。當100 ℃時,pH=3的色素溶液的ΔE呈現快速上升的趨勢,在10 h時達到峰值,為24.04,色素顏色逐漸從粉紅色向淡黃色過渡。在pH=7的色素溶液中也呈現類似的趨勢,其顏色從淡紫色向黃色轉變。由此可見,色素在酸性溶液(pH=3)中的穩定性強于中性溶液(pH=7)。此外,溫度對紅花羊蹄甲色素有較大的影響。當溫度超過75 ℃后溫度對色素緩沖液影響較大,且色素的顏色隨著加熱時間的延長逐漸變淺。這可能是該色素緩沖液在加熱過程中發生氧化反應,導致的共價鍵斷裂以及在此基礎上的進一步反應引起的[16]。因此在制備和儲存紅花羊蹄甲色素時應盡量在低溫酸性條件下進行。

a-50 ℃;b-75 ℃;c-100 ℃圖3 不同溫度條件下紅花羊蹄甲色素溶液的色差值(ΔE)Fig.3 The total color difference(ΔE) of the B. blakeana flower at different temperatures注:圖中色卡表示色素溶液的顏色變化情況(下同)。

2.3.3 光照的穩定性影響

如圖4-a所示,在室內光照射下,隨著光照時間的延長,色素溶液ΔE在最初的1 d內迅速增大,隨后緩慢上升。其中,在pH=3溶液中,ΔE變化幅度相對較小,為2.79;在pH=7溶液中,ΔE變化幅度相對較大,為6.83。避光條件下(圖4-b),紅花羊蹄甲色素溶液的ΔE變化幅度有類似的趨勢,在酸性溶液中色素溶液ΔE最高為1.83,中性溶液中ΔE最高為6.66。

在pH=7的溶液中,無論是光照還是避光下,色素溶液的ΔE變化幅度較明顯,都呈現褪色的趨勢。這與姜紅[17]對黑胡蘿卜花青素的pH和光照穩定性研究結果相同。在pH 3溶液中,色素溶液受光照影響較小。光照會加速花色苷的降解,應避光保存。

2.3.4 金屬離子的穩定性影響

由圖5可知,當pH=3時,在紅花羊蹄甲色素溶液中添加K+、Na+和Ca2+,隨著時間的延長,ΔE在最初的1 d內迅速增大,隨后緩慢上升,其ΔE最高分別為4.55、5.55、6.43,溶液呈較穩定的粉紅色。而添加Mg2+和Fe2+時,ΔE值變化幅度較大,ΔE值最高分別為9.49、16.21。添加Mg2+時,溶液顏色仍為粉紅色,添加Fe2+時,溶液顏色呈棕黃色。說明在酸性溶液下,Fe2+對紅花羊蹄甲色素有較大影響,K+、Ca2+、Na+和Mg2+影響較小。

a-室內光;b-避光圖4 光照條件下紅花羊蹄甲色素溶液的色差值(ΔE)Fig.4 The total color difference (ΔE) of the B. blakeana flower at different light

a-K+;b-Na+;c-Ca2+;d-Mg2+;e-Fe2+圖5 金屬離子對紅花羊蹄甲色素溶液的色差值(ΔE)Fig.5 The total color difference (ΔE) of the B. blakeana flower at different metal ions

當pH=7時,添加K+、Ca2+、Na+和Mg2+后,色素溶液ΔE值隨時間的延長呈上升趨勢,變化趨勢較明顯,其最大值分別為17.68、9.79、19.28和6.85,溶液顏色從但紫色向淡黃色轉變。而添加Fe2+時,隨時間的延長,色素溶液ΔE值變化極小,最高值為4.31,色素溶液變暗變黑。

在酸性條件和堿性條件下加入Fe2+的色素溶液顏色加深,表明加入Fe2+對不同色素溶液的穩定性影響都較大,其原因可能是Fe2+會與色素反應,使色素褪色或生成其他顏色的物質[18]。也可能是Fe2+與花青素物質的酚羥基反應生成有色配合物并沉淀。因此在制備和開發紅花羊蹄甲色素時應盡量避免與Fe2+接觸。

2.3.5 甜味劑的穩定性影響

由圖6可知,在pH=3時,添加甜味劑,避光放置1 d后,5種色素溶液的色差值都有所增加。添加乳糖和蔗糖后,在第1天,色差值為2.53和2.78,隨后呈緩慢下降趨勢,達到第5 d后,色差值為1.97和1.68,溶液的顏色緩慢變化;添加葡萄糖后,在第3天達到最高值,色差值為4.82,隨后呈下降趨勢。加入麥芽糖、山梨醇后,在貯藏3 d后,色差值為3.94、2.25。隨后2 d內,色差值增加到5.28、3.04,溶液的顏色為深紅色。因此在酸性條件下甜味劑對色素溶液的影響依次為乳糖<蔗糖<山梨醇<葡萄糖<麥芽糖。

a-乳糖;b-蔗糖;c-葡萄糖;d-麥芽糖;e-山梨醇圖6 甜味劑對紅花羊蹄甲花色苷溶液的色差值(ΔE)Fig.6 The total color difference (ΔE) of the B. blakeana flower at different sweeteners

當pH 7時,添加乳糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖和山梨醇后,在最初的1 d內,色度值都快速上升,其色差值為3.97、3.43、4.13、3.69、3.89,在貯藏5 d后,溶液的色差值為6.78、5.41、5.79、5.53、7.17。加入葡萄糖后,色差值在第1天時達到最高值,為4.13,隨后緩慢下降,在第2天時,下降到最低點,為4.71。色素溶液顏色普遍趨于由深變淺,這可能是因為色素在pH 7溶液中結構被破壞,顏色變淺,而糖又起到保護作用,減緩了色素的降解。在中性溶液中,麥芽糖和蔗糖對色素的影響最小,而山梨醇對色素的影響最大,乳糖次之。

3 結論

本研究旨在探討紅花羊蹄甲花色苷的組成和其穩定性影響,以期擴大紅花羊蹄甲的應用領域。 結果表明,紅花羊蹄甲花瓣色素中主要含有矮牽牛色素(84.65 μg/g)和飛燕草素-3-O-葡萄糖苷(6 801.12 μg/g)、芍藥素-3-O-葡萄糖苷(2 069.49 μg/g)、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(667.9 μg/g);紅花羊蹄甲色素pH穩定性與簡單花色苷一致,酸性條件下較穩定,隨著pH的增加穩定性下降;紅花羊蹄甲色素在54.6～111.3 ℃具有良好的熱穩定性;色素溶液在高溫光照條件下不穩定,在開發應用以及儲藏時應避免高溫光照。K+、Ca2+、Na+和Mg2+對紅花羊蹄甲色素的影響較小,Fe2+影響較大,在使用制備紅花羊蹄甲色素過程中應盡量避免與鐵器皿接觸;葡萄糖和麥芽糖對酸性條件下的色素溶液具有一定的穩定性。紅花羊蹄甲色素含量高,是一種值得開發的新型花色苷色素資源。