COPD細(xì)胞微環(huán)境體外模型建立的思路與方法

秦燕勤,劉 含,李建生

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué) 河南省中醫(yī)藥防治呼吸病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,河南 鄭州 450046 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院,河南 鄭州 450046;3. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科,河南 鄭州 450003)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種以持續(xù)性呼吸道癥狀和不完全可逆性氣流受限為主要特征的疾病,其病理機(jī)制復(fù)雜,包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、黏液高分泌、血管損傷等,涉及多種細(xì)胞及介質(zhì)。細(xì)胞微環(huán)境改變是COPD病理生理的重要組成部分。模擬細(xì)胞病理微環(huán)境是COPD機(jī)制研究及藥效藥理評價的重要方法。單層細(xì)胞培養(yǎng)無法模擬細(xì)胞間的相互作用,在應(yīng)用方面有一定的局限性。細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)可較大限度模擬COPD多細(xì)胞相互的微環(huán)境,為COPD的病理機(jī)制及藥效研究提供模型工具。鑒于上述,本文基于近年來研究背景,總結(jié)現(xiàn)有模擬COPD病理微環(huán)境的細(xì)胞模型,分析模型的適用性,提出COPD細(xì)胞微環(huán)境病理模型建立的思路與方法,旨在為COPD的病理及藥物作用機(jī)制研究提供參考。

1 肺內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境的構(gòu)成

肺內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境由細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、可溶性分子及物理因子構(gòu)成,以維持肺的正常生理功能。細(xì)胞主要包括肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞。細(xì)胞外基質(zhì)是分布于細(xì)胞外空間、由細(xì)胞分泌的蛋白和多糖所構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),如膠原蛋白、彈性纖維、糖蛋白、纖維連接蛋白等,對細(xì)胞形態(tài)、生長、分化起調(diào)控作用。可溶性分子由營養(yǎng)物質(zhì)和可溶性信號分子組成,如細(xì)胞因子、生物活性物質(zhì)等。物理因子主要包括細(xì)胞外基質(zhì)物理結(jié)構(gòu)、微環(huán)境力學(xué)特性和其他物理特性等。

肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞主要有上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等。支氣管上皮細(xì)胞是保護(hù)氣道-肺組織免受外源性物質(zhì)侵襲的第一道生理屏障。肺泡上皮細(xì)胞主要包括Ⅰ型和Ⅱ型細(xì)胞,Ⅰ型上皮細(xì)胞與基底膜、血管內(nèi)皮細(xì)胞組成氣血屏障,維持氣體交換和屏障功能。Ⅱ型上皮細(xì)胞內(nèi)含豐富的板層小體,主要合成、分泌和儲存肺泡表面活性物質(zhì),維持肺泡張力。血管內(nèi)皮細(xì)胞是肺血管穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)劑,調(diào)節(jié)血管張力、凝血和血管生成。肺間質(zhì)細(xì)胞主要包括間充質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂質(zhì)成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞,主要產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì),以維持肺的結(jié)構(gòu)和功能。免疫細(xì)胞主要包括巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、肥大細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞,適應(yīng)性免疫細(xì)胞T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞,共同發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。

不同細(xì)胞之間通過直接、間接連接、分泌細(xì)胞因子、細(xì)胞外囊泡等相互作用維持細(xì)胞微環(huán)境穩(wěn)態(tài)。免疫細(xì)胞和肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞的交互作用對維持細(xì)胞微環(huán)境穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。微環(huán)境影響肺泡巨噬細(xì)胞的表型分化和功能,其轉(zhuǎn)錄組的變化完全歸因于微環(huán)境[1]。支氣管上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞協(xié)同作用維持氣道屏障功能,巨噬細(xì)胞釋放的介質(zhì)作用于損傷的氣道上皮細(xì)胞,促進(jìn)氣道上皮修復(fù)[2]。巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡可被上皮細(xì)胞內(nèi)化并抑制炎癥通路的激活[3]。上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞主要參與構(gòu)成氣-血屏障,維持氣-血交換和屏障功能。血管內(nèi)皮生長因子參與維持肺泡上皮細(xì)胞完整性,阻斷其受體誘導(dǎo)肺泡細(xì)胞凋亡和氣腫樣疾病[4]。巨噬細(xì)胞也參與調(diào)節(jié)氣血屏障功能,發(fā)揮屏障免疫和異物清除作用,維持肺內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[5]。上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的相互作用對細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生至關(guān)重要,成纖維細(xì)胞通過釋放炎癥介質(zhì)和生長因子調(diào)控上皮細(xì)胞表型[6]。

2 細(xì)胞微環(huán)境變化是COPD病理生理的重要組成部分

COPD病理機(jī)制復(fù)雜,其特征性病理變化是氣道、肺實(shí)質(zhì)及肺血管的慢性炎癥反應(yīng),由多種細(xì)胞及介質(zhì)參與。由香煙煙霧(cigarette smoke,CS)、細(xì)菌、病毒等微生物、PM2.5等顆粒物及缺氧等激活的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞及上皮細(xì)胞等肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞,釋放炎癥介質(zhì),引發(fā)炎癥反應(yīng),損傷肺實(shí)質(zhì)。激活的巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞等不僅釋放炎癥介質(zhì),還可促進(jìn)中性粒細(xì)胞的募集和活化,增強(qiáng)炎癥信號,產(chǎn)生瀑布樣炎癥反應(yīng),促進(jìn)COPD病理進(jìn)展[7-8]。

COPD炎癥反應(yīng)可作為始動因子,啟動其他一系列病理進(jìn)程。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在COPD病理進(jìn)程中相互作用,相互促進(jìn)[7]。巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞釋放的炎癥因子刺激氣道上皮細(xì)胞向杯狀上皮細(xì)胞化生,促進(jìn)氣道黏液分泌,造成黏液積聚,誘導(dǎo)COPD患者咳嗽、咯痰,加重呼吸道癥狀[9]。炎癥刺激可直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,使其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變,并抑制內(nèi)皮修復(fù),促進(jìn)微血管形成,導(dǎo)致血管重構(gòu),誘發(fā)肺動脈高壓的發(fā)生,增加COPD患者死亡風(fēng)險[10]。炎癥因子的刺激破壞細(xì)胞外基質(zhì),導(dǎo)致蛋白酶/抗蛋白酶失衡,引起膠原沉積,降解的基質(zhì)又會加劇炎癥反應(yīng),加快氣道重塑的進(jìn)程[6]。由于氣流受限,COPD患者長期處于缺氧狀態(tài),血管內(nèi)皮細(xì)胞對缺氧十分敏感,持續(xù)缺氧刺激可損傷內(nèi)皮細(xì)胞,導(dǎo)致氣血屏障結(jié)構(gòu)改變和功能障礙,影響機(jī)體氣血交換,加重氣流受限,加速COPD病理進(jìn)展[11]。COPD發(fā)生發(fā)展中,細(xì)胞微環(huán)境變化復(fù)雜,涉及方面較多,每一方面并不是獨(dú)立的,而是相互作用,共同促進(jìn)COPD病理進(jìn)程。見Fig 1。

3 COPD細(xì)胞微環(huán)境病理模型建立的思考

肺內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境受多種因素影響,COPD疾病進(jìn)展是多細(xì)胞相互作用的結(jié)果。目前,體外多以細(xì)胞為載體,模擬COPD病理微環(huán)境,探討COPD發(fā)病機(jī)制及藥物作用機(jī)制。采用外源性刺激物,如CS、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、細(xì)胞因子、顆粒物、缺氧等誘導(dǎo)肺實(shí)質(zhì)或免疫細(xì)胞,模擬COPD炎癥反應(yīng)、黏液高分泌、肺實(shí)質(zhì)損傷等病理過程,以探討COPD的病理及藥物作用機(jī)制,見Tab 1。

然而,任何病理環(huán)節(jié)都不是單一的細(xì)胞起作用,而是多細(xì)胞相互作用的結(jié)果,借助現(xiàn)有的細(xì)胞培養(yǎng)支持物進(jìn)行多細(xì)胞共培養(yǎng)可建立接近肺內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境的模型。肺是空腔器官,氣道上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞一面是朝向氣管腔或肺泡腔的游離面,一面是朝向深部組織的基底面,呈現(xiàn)出明顯的極性,必須模擬細(xì)胞的生理極性,才能建立符合機(jī)體生理狀態(tài)的體外模型。目前關(guān)于氣道黏液高分泌的模型,多將氣道上皮細(xì)胞培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基液面以下,分泌型粘蛋白生成量不理想,通過檢測黏蛋白基因表達(dá)評價模型[16,23]。這可能是由于該培養(yǎng)方法無法模擬氣道上皮細(xì)胞的生理極性,杯狀細(xì)胞化生受限導(dǎo)致的。可以采用氣-液面培養(yǎng)模擬氣道上皮細(xì)胞的生理極性建立病理模型。氣血屏障是肺進(jìn)行氣體交換的結(jié)構(gòu),是阻止肺泡中外源性物質(zhì)入侵機(jī)體的一道物理屏障,體外可模擬這種肺微環(huán)境特殊生理結(jié)構(gòu)。類器官可再現(xiàn)肺空間結(jié)構(gòu)和肺內(nèi)環(huán)境與細(xì)胞間的相互作用,在肺發(fā)育、生理功能、疾病病理和藥物作用機(jī)制研究中應(yīng)用較多。

Fig 1 Changes of cellular microenvironment promote COPD disease progression

Tab 1 Application of different inducers to induce different cells in COPD study

因此,結(jié)合COPD細(xì)胞微環(huán)境的變化,建立細(xì)胞微環(huán)境的病理模型可為COPD病理機(jī)制研究及藥理藥效評價提供工具,對COPD的防治研究極為重要。基于目前常用的研究方法,提出以下模型建立方法。

3.1 模擬COPD多細(xì)胞相互作用微環(huán)境的細(xì)胞共培養(yǎng)COPD細(xì)胞微環(huán)境涉及多種細(xì)胞及介質(zhì),單層細(xì)胞培養(yǎng)無法模擬多細(xì)胞相互作用的微環(huán)境。將兩種或兩種以上細(xì)胞共培養(yǎng)構(gòu)建體外模型,有利于探討細(xì)胞間相互作用關(guān)系,模擬COPD多細(xì)胞相互作用的微環(huán)境。以往的研究多集中在兩種細(xì)胞類型共培養(yǎng)。Wang等[18]將肺泡上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞共培養(yǎng),研究環(huán)境PM2.5的潛在毒性。脂多糖誘導(dǎo)共培養(yǎng)的上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞模擬COPD炎癥反應(yīng)微環(huán)境,結(jié)果表明與單層細(xì)胞培養(yǎng)比較,共培養(yǎng)可放大脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[19]。Li等[20]用CS誘導(dǎo)共培養(yǎng)的A549細(xì)胞和THP-1細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)CS誘導(dǎo)下,巨噬細(xì)胞可促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。3種及以上細(xì)胞類型共培養(yǎng)更適宜模擬COPD多細(xì)胞相互作用的微環(huán)境。上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞四種細(xì)胞共培養(yǎng)模擬PM10刺激時,肺細(xì)胞間交互作用,發(fā)現(xiàn)四種細(xì)胞共培養(yǎng)可釋放更多的炎癥因子,且肥大細(xì)胞起重要作用,該模型可為研究不同細(xì)胞類型對顆粒物的效應(yīng)機(jī)制提供工具[24]。為模擬COPD病理狀態(tài)下多細(xì)胞相互作用的微環(huán)境,可以將3種或3種以上細(xì)胞類型共培養(yǎng),根據(jù)研究目的,選用CS、LPS、PM、細(xì)胞因子或缺氧為刺激因素,模擬氣道黏液分泌、炎癥反應(yīng)、實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷、巨噬細(xì)胞分化等不同的病理環(huán)節(jié),為疾病發(fā)病機(jī)制研究提供工具。具體實(shí)施可采用直接接觸共培養(yǎng)法,也可借助Transwell將不同類型細(xì)胞接種在培養(yǎng)板和Transwell多孔膜兩面進(jìn)行細(xì)胞共培養(yǎng)。見Fig 2。

Fig 2 Cell co-culture that mimic multicellular interaction

Fig 3 Air-liquid surface cell culture that mimic cell polarity

3.2 模擬上皮細(xì)胞極性的氣-液面細(xì)胞培養(yǎng)氣道上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞存在明顯的極性,模擬這種生理狀態(tài),可建立接近細(xì)胞微環(huán)境的體外模型。氣道上皮細(xì)胞多被用于模擬黏液高分泌微環(huán)境探討COPD黏液高分泌機(jī)制及藥物作用機(jī)制。傳統(tǒng)的氣道上皮細(xì)胞培養(yǎng),細(xì)胞被接種于培養(yǎng)基液面以下,這不能完全模擬氣道生理環(huán)境,氣道上皮細(xì)胞向杯狀細(xì)胞分化受到限制,黏蛋白分泌量較低[16,23]。氣-液面培養(yǎng)的主要特征是細(xì)胞的基底面與液體培養(yǎng)基接觸,其頂端表面暴露于空氣中,模擬細(xì)胞的生長極性,模擬人呼吸道生理環(huán)境,誘導(dǎo)細(xì)胞向黏膜纖毛表型分化。由于氣道上皮細(xì)胞生長于多孔膜的上表面,下表面還可以選擇性的接種巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞,模擬氣道黏液高分泌的多細(xì)胞相互作用微環(huán)境。Schwab等[25]建立了支氣管上皮細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系,通過檢測黏液和炎癥因子分泌探討上皮細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的相互作用。建立該培養(yǎng)系統(tǒng)可采用Transwell小室,將氣道上皮細(xì)胞接種于Transwell小室多孔膜上,細(xì)胞上表面暴露于空氣中,通過多孔膜接觸培養(yǎng)基,誘導(dǎo)其分化為杯狀細(xì)胞。該模型可用于研究COPD發(fā)病機(jī)制及藥物作用機(jī)制,特別是黏液高分泌機(jī)制及藥物抑制黏液高分泌的作用機(jī)制與靶點(diǎn)。見Fig 3。

3.3 模擬肺氣-血屏障的上皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)氣血屏障位于呼吸系統(tǒng)肺泡與循環(huán)系統(tǒng)連接處,是機(jī)體進(jìn)行氣體交換的場所。因頻繁接觸隨呼吸而來的外源性物質(zhì),氣血屏障還是外源性物質(zhì)入侵循環(huán)系統(tǒng)的門戶。COPD病理進(jìn)程中,氣血屏障結(jié)構(gòu)和功能受損,建立模擬肺氣血屏障的肺泡上皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)模型,可為研究氣血屏障損傷機(jī)制及藥物作用機(jī)制提供工具。Lan等[26]采用Transwell建立了氣血屏障,探討氣血屏障對PM2.5的屏障作用及細(xì)胞相互作用在細(xì)顆粒物刺激時的作用。Benam等[27]將內(nèi)皮細(xì)胞和COPD患者肺分離的肺泡上皮細(xì)胞和共培養(yǎng),模擬氣血屏障,以檢測肺內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞對細(xì)胞因子分泌的協(xié)同作用。模擬氣血屏障的生理結(jié)構(gòu),可借助Transwell小室膜模擬基底膜,將內(nèi)皮細(xì)胞與上皮細(xì)胞分別接種在膜的兩面,也可在下層培養(yǎng)基中接種巨噬細(xì)胞等,以模擬氣血屏障結(jié)構(gòu)。見Fig 4。

Fig 4 Cell co-culture mimicking alveolar-capillary barrier

3.4 模擬肺組織結(jié)構(gòu)的肺類器官培養(yǎng)多細(xì)胞共培養(yǎng)雖易操作,可較大限度模擬COPD細(xì)胞微環(huán)境,但不能準(zhǔn)確再現(xiàn)肺空間結(jié)構(gòu)和肺內(nèi)環(huán)境與細(xì)胞間的相互作用。類器官具有與原生器官相似的空間組織和部分功能,是目前最接近人體組織系統(tǒng)的模型,用于模擬器官發(fā)育和疾病病理。

Fig 5 Differentiation of lung organoid

肺類器官用于研究肺發(fā)育、生理功能、疾病病理和藥物作用機(jī)制。肺類器官可主要來源于成熟肺組織的上皮祖細(xì)胞(包括基底細(xì)胞、氣道分泌細(xì)胞、肺泡II型上皮細(xì)胞)和多能干細(xì)胞,根據(jù)研究目的選擇肺不同區(qū)域的細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)中進(jìn)行分化,以更準(zhǔn)確地模擬肺疾病病理生理。肺基底細(xì)胞可產(chǎn)生氣道的主要管腔上皮譜系,其分化的類器官可用于研究肺部疾病的氣道病變病理機(jī)制,如氣道黏液分泌、氣道屏障功能、氣道炎癥和損傷及其潛在治療。肺泡II型上皮細(xì)胞功能障礙是多種肺部疾病發(fā)病機(jī)制的主要原因,以此為來源的類器官應(yīng)用更廣泛,可用于研究多種疾病發(fā)病機(jī)制及藥物篩選。Tan等[28]研究發(fā)現(xiàn)原代支氣管上皮細(xì)胞分化的氣道類器官管腔MUC5AC分泌增加,且隨時間推移,MUC5AC分泌持續(xù)增加,這與氣道類器官中杯狀細(xì)胞和氣道分泌細(xì)胞分化一致。Barkauskas等[29]基于氣道類器官研究基底細(xì)胞中固有免疫通路的持續(xù)激活促進(jìn)杯狀細(xì)胞化生和氣道重塑,該模型可作為研究COPD黏液高分泌和纖毛損傷及其藥物作用通路的工具。Ⅱ型肺泡細(xì)胞分化的肺泡類器官多用于研究肺實(shí)質(zhì)病理損傷機(jī)制。Ng-Blichfeldt等[30]采用原代小鼠和人肺泡上皮細(xì)胞分化的肺類器官探討視黃酸信號通路在COPD上皮損傷修復(fù)中的作用,發(fā)現(xiàn)抑制該通路可促進(jìn)來自小鼠和COPD患者肺組織的肺類器官的增殖。見Fig 5。

4 討論

COPD病理機(jī)制復(fù)雜,涉及多種細(xì)胞類型,細(xì)胞微環(huán)境變化是COPD病理生理的重要組成部分,在COPD病程進(jìn)展中扮演重要角色。細(xì)胞微環(huán)境體外模型建立是研究細(xì)胞間通訊和宿主-病原體相互作用的一種新病理模型,也是研究疾病病理、藥物作用機(jī)制及毒性分析的有力工具。肺泡上皮細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等單層細(xì)胞培養(yǎng)簡單、易操作,被廣泛應(yīng)用于COPD的病理機(jī)制及藥物作用機(jī)制研究。但是,單層細(xì)胞培養(yǎng)無法模擬COPD發(fā)生時,多細(xì)胞相互作用的微環(huán)境。兩種或兩種以上細(xì)胞共培養(yǎng)代替單層細(xì)胞培養(yǎng)建立多細(xì)胞相互作用的COPD病理微環(huán)境模型。特定細(xì)胞的共培養(yǎng)還可以模擬肺的特殊結(jié)構(gòu),如肺泡上皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)模擬氣-血屏障等。這些細(xì)胞共培養(yǎng)模型為COPD的發(fā)病機(jī)制及藥理藥效研究提供了工具。

多細(xì)胞共培養(yǎng)可較大限度模擬COPD細(xì)胞微環(huán)境,但不能準(zhǔn)確再現(xiàn)肺空間結(jié)構(gòu)。肺類器官能模擬組織的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和功能,很大程度上推進(jìn)了COPD的研究,但也有一定的局限性,肺類器官缺乏血管系統(tǒng)、結(jié)締組織、免疫細(xì)胞等微環(huán)境。未來的研究可將不同細(xì)胞來源的類器官進(jìn)行共培養(yǎng)以克服這些局限。

綜上所述,COPD細(xì)胞微環(huán)境的體外模型建立可為COPD的病理機(jī)制及藥理藥效研究提供工具,是推動COPD防治研究的重要組成部分,可為COPD的治療提供新思路。然而,如何建立更接近人體肺生理環(huán)境的模型,如何建立模擬肺生理功能的模型等是需要進(jìn)一步研究的問題。