桔梗-姜半夏配伍促進小鼠NK細胞在肺臟募集并抑制腫瘤肺臟轉移

王 悅,張 玥,孔令婉,張 珊,楊雯越,姚成芳,

[1. 山東中醫藥大學中醫藥創新研究院,山東 濟南 250355;2. 山東第一醫科大學(山東省醫學科學院)臨床與基礎醫學院,山東 濟南 250117;3. 山東中醫藥大學中醫學院,山東 濟南 250355]

肺臟腫瘤是一種高發病率、高致死率疾病[1],在發展早期主要依賴NK細胞等淋巴細胞發揮抗腫瘤作用[2],其中CXCR3+NK細胞可依賴CXCL9/10等趨化因子的招募作用[3]而快速遷移,并大量分泌IFN-γ和穿孔素等效應因子,發揮免疫監視等作用[4]。

桔梗-姜半夏配伍(the combination ofPlatycodonGrandiflorumandPinelliaTernata, PG+PT)常用于腫瘤的臨床治療中[5]。本研究旨在探討PG+PT對肺臟腫瘤微環境中NK細胞、特別是CXCR3+NK的免疫藥理作用,以明確該配伍發揮抗腫瘤作用的部分藥理機制。

1 材料

1.1 實驗動物與藥物SPF級雌性6～7周齡C57BL/6小鼠購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司;桔梗(PlatycodonGrandiflorum, PG)、姜半夏(PinelliaTernata, PT)藥材均購于山東建聯盛嘉中藥有限公司。

1.2 主要試劑與儀器Fc阻斷劑、流式抗體(美國BD公司),TRIzon Reagent、RNase Inhibitor、dNTP (北京康為世紀有限公司),RevertAid Reverse TranscriPtase (美國Thermo Scientific公司),SYBR? Green master (美國Bio-Rad公司),濃縮煎藥機(東華原醫療設備有限責任公司),FACS Aria Ⅲ流式細胞儀(美國BD公司),PCR擴增儀(德國Biometra公司),熒光定量PCR儀(瑞士羅氏診斷產品有限公司)。

2 方法

2.1 PG+PT提取液制備PG+PT按照《圣濟總錄》桔梗半夏湯所載1 ∶1配比,各取250 g,冷水浸泡4 ℃過夜,2次煎煮,所得水煎液經醇沉、回收、濃縮,得PG+PT提取液。

2.2 動物模型構建、分組處理方法

2.2.1正常動物灌胃分組處理 小鼠隨機分為對照組(CTRL)、PG+PT提取液灌胃組(PG+PT),每組5只,PG+PT組灌胃給藥,劑量為1.3 g·kg-1·d-1、約0.2 mL,連續10 d。

2.2.2B16黑色素瘤肺臟轉移模型構建及分組處理 小鼠隨機分為正常對照組(CTRL)、B16黑色素瘤肺臟轉移模型組(B16)、腫瘤模型PG+PT治療組(B16-PG+PT),每組5只,B16組、B16-PG+PT組尾靜脈注射B16黑色素瘤細胞(2×105/只)構建腫瘤肺臟轉移模型,造模前3 d起,B16-PG+PT組灌胃給藥,劑量為1.3 g·kg-1·d-1、約0.2 mL,連續17 d。

2.3 流式細胞術取小鼠肺臟,制備單細胞懸液,去除紅細胞,進行細胞計數,每個樣本取1×106個細胞,Fc阻斷劑阻斷細胞表面非特異性結合,加入外標抗體,4 ℃避光孵育1 h,流式細胞儀檢測肺臟NK細胞及其CXCR3表達。

2.4 RT-qPCR取小鼠肺臟,提取肺組織總RNA,進行RNA反轉、合成cDNA,以cDNA為模板,進行qPCR,以GAPDH為內參,2-ΔΔCt計算CXCL9相對表達量。

2.5 10×Genomics單細胞測序取小鼠肺臟,制備單細胞懸液,檢測細胞活性,構建cDNA文庫,區分目標序列的樣品來源,Cell Ranger軟件進行數據質量統計,采用SingleR包基于immgen參考數據集進行細胞類型注釋,Seurat軟件包篩選差異基因、進行富集分析,結果使用Loupe Brower進行分析。

3 結果

3.1 PG+PT促進小鼠NK細胞在肺臟的募集與CTRL組對比,PG+PT組小鼠肺臟CD45+淋巴細胞的比例(P<0.01)和數量(P<0.05)均明顯升高,其中NK細胞比例(P<0.05)上升尤為突出。

3.2 PG+PT促進小鼠CXCR3+NK細胞在肺臟募集與CTRL組對比,PG+PT組CXCR3+NK細胞比例(P<0.001)和數量(P<0.01)明顯升高,肺組織中趨化因子CXCL9的基因表達水平明顯上升(P<0.01)。

3.3 PG+PT抑制小鼠B16黑色素瘤肺臟轉移與CTRL組對比,B16組腫瘤肺臟轉移灶明顯;與B16模型組對比,PG+PT處理組肺臟腫瘤克隆數明顯減少(P<0.01)。

3.4 PG+PT促進小鼠肺臟腫瘤微環境中NK細胞募集與CTRL組對比,B16組肺臟CD45+淋巴細胞比例下降(P<0.01),PG+PT提取液治療后CD45+淋巴細胞比明顯上升(P<0.05),且B16-PG+PT組NK細胞的比例明顯高于B16組(P<0.05)。

3.5 PG+PT提高小鼠肺臟腫瘤微環境中NK細胞的殺傷能力與CTRL組對比,B16組的NK細胞數量明顯降低(476vs653),并且低表達IFN-γ、穿孔素等抗腫瘤效應因子;與B16組對比,B16-PG+PT組NK細胞數增多(521vs476),上調IFN-γ和穿孔素的基因表達。

3.6 PG+PT促進小鼠CXCR3+NK細胞在肺臟腫瘤微環境中的募集與CTRL組對比,B16組小鼠肺臟腫瘤微環境中CXCL9基因表達水平降低,B16-PG+PT組肺組織CXCL9基因表達水平明顯升高。與B16組對比,B16-PG+PT組CXCR3+NK細胞比例和數量均明顯上調(P<0.05)。

4 討論

NK細胞通過分泌IFN-γ[6]、穿孔素[7]等發揮抗腫瘤作用,其中CXCR3+NK細胞對比CXCR3-NK細胞具有增殖能力強、快速大量產生IFN-γ的特點[8],并受組織微環境中CXCL9/10的招募[2]。

本研究發現,PG+PT能夠抑制B16黑色素瘤肺臟轉移,在生理狀態下和腫瘤微環境中均可上調肺組織CXCL9的表達,優勢招募CXCR3+NK淋巴細胞在肺臟募集,在腫瘤微環境中促進NK細胞分泌IFN-γ、穿孔素等抗腫瘤因子,為NK細胞的腫瘤防治提供了免疫輔助治療的可能性。