苦參和土茯苓聯用改善小鼠銀屑病樣皮損的作用機制

武興康,王 鷺,李 洋,馬瑜爽,秦雪梅

(1. 山西大學化學生物學與分子工程教育部重點實驗室,中醫藥現代研究中心,2. 地產中藥功效物質研究與利用山西省重點實驗室,3. 名優晉藥再開發山西省重點實驗室,山西 太原 030006)

銀屑病是一種炎癥介導的慢性、復發性、系統性的不可治愈性皮膚疾病,臨床表現為皮膚局限或廣泛分布鱗屑性紅斑或斑塊,在中國其發病率約為0.4%[1]。除皮膚癥狀外,還可以合并其他系統異常,如伴內臟及關節損害,中重度銀屑病患者可合并其他相關疾病,如代謝綜合征、心血管疾病等。銀屑病的確切病因與發病機制尚未完全闡明,遺傳背景、環境誘因等因素相互作用,最終形成角質形成細胞異常增殖與皮膚免疫微環境正反饋環路,主要表現為炎癥、氧化應激、代謝紊亂等[1]。中醫病機為燥濕互化引起的血熱、血毒、血瘀等[2]。由于銀屑病患病人群呈現年輕化,反復發作,經久不愈,其治療以確?；颊甙踩珵槭滓?盡量控制病情和避免復發。國家中醫局規定銀屑病為中醫治療的優勢病種,外用藥物是銀屑病首選治療方法,安全性高,患者依從性好,但患者可選擇藥物少,近30多年全球僅上市1個外用新藥:本維莫德乳膏[3]。本維莫德乳膏療效優于銀屑病外用藥“金標準”卡泊三醇,但仍存在不足,無應答率為30%～70%,不良反應率約38.7%[4]。因此,發展新的藥物用于銀屑病的外用治療是患者的需求。

苦參(SophoraeFlavescentisRadix,SF)和土茯苓(RhizomaSmilacisGlabrae,RSG)都是皮膚科常見中草藥,兩者聯用的方劑中多采用湯劑的方法治療皮膚疾病且比例多為1 ∶1。根據銀屑病的中醫理論可推斷出中藥治療銀屑病應從“清熱涼血解毒”入手從而達到“降燥祛濕”。研究報道使用涼血方治療“血熱型”銀屑病的臨床顯效率達82%[5],在治療銀屑病的中藥方劑中主要歸經為肝、心、胃、肺等[6],苦參、土茯苓主要功效為清熱涼血、清熱燥濕等,主要歸心、肝、胃經,20版藥典中記載兩者都用于治療疥癬等皮膚病,是《中國銀屑病診療指南(2018完整版)》推薦的銀屑病進行期的中藥藥浴療法的常用中藥。藺依等[7]發現苦參-土茯苓組合是中藥外治尋常型銀屑病使用頻次>20的藥物組合之一,然而苦參和土茯苓聯用外治銀屑病的系統研究尚未有文獻報道。本研究采用咪喹莫特乳膏誘導的銀屑病樣皮損小鼠模型,評價苦參和土茯苓聯用外治銀屑病的作用,并利用代謝組學探索其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物BALB/C小鼠(♂,5～6周齡,SPF級)購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,SCXK(京)2021-0006。實驗開始前適應性飼養1周,飼養環境溫度為(25±2)℃,濕度為55%±5%,12 h明暗交替光照,實驗期間動物自由攝食和飲用水。動物實驗遵循山西大學動物倫理委員會的規定并通過動物實驗倫理審查(批號: SXULL2022019)。

1.2 試劑咪喹莫特乳膏(IMQ cream,5%)購于四川明欣藥業有限責任公司,本維莫得乳膏(tapinarof,0.1%)購于廣東中昊藥業有限公司,蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司,Ki67抗體(ab92742)和Goat Anti-Rabbit IgG H&L抗體(ab205718)購于Abcam公司,CD3抗體(60181-1-Ig)和DAB溶液(PR30010)購于武漢三鷹生物技術有限公司。

1.3 藥物制備及成分鑒定苦參和土茯苓藥材采購于北京同仁堂,原料藥粉碎成粗粉,加5倍量雙蒸水,煎煮2次,每次2 h,合并濾液,濃縮至適量,冷凍干燥至粉末。稱取凡士林,水浴加熱熔融后,分別加入苦參、土茯苓和苦參土茯苓1 ∶1混合物的冷凍干燥粉末至5%的濃度[8],攪拌均勻至冷卻,制備而成5%的苦參軟膏、土茯苓軟膏和苦參土茯苓軟膏,4 ℃儲存。使用UPLC-MS對其水提物進行結構鑒定,流動相為0.01 moL·L-1乙酸銨水和0.01 mol·L-1乙酸銨乙腈,流速為0.3 mL·min-1,質譜離子源溫度為500 ℃,掃描范圍為50～1 500 Da,根據Mass Bank、HMDB等數據庫進行化合物的比對離子碎片。

1.4 銀屑病小鼠模型的構建銀屑病進行期的小鼠模型的構建,脫去小鼠背部毛發,面積約為3 cm2,適應2 d后將62.5 mg咪喹莫特乳膏涂抹于小鼠背部,連續涂抹6 d,誘導小鼠銀屑病樣皮損的發生[9]。咪喹莫特乳膏處理后8 h給予藥物治療,將62.5 mg的藥膏涂抹于小鼠背部,連續治療6 d,咪喹莫特乳膏處理前通過PASI評分評價小鼠銀屑病的嚴重程度。

銀屑病復發期的小鼠模型的構建,選取另一批小鼠經上述造模和治療6 d后的小鼠,第7天停止造模和治療,恢復14 d使得小鼠銀屑病皮損自愈。然后,所有小鼠背部涂抹低劑量(20.8 mg)的咪喹莫特乳膏,連續6 d,誘導銀屑病的復發。

兩次取樣前12 h進行空腹處理,采用眼眶取血的方法收集小鼠血清,剪取小鼠被處理部分的背部皮膚分為兩部分,一部分置于-80 ℃保存,另一部分收集在4%的多聚甲醛中。

1.5 實驗分組與藥物處理實驗動物分為6組:健康組(Health)、模型組(Model)、本維莫德組(Tapinarof),苦參組(SF)、土茯苓組(RSG)和苦參土茯苓組(SF+RSG),每組6只小鼠。健康組造模治療過程中均涂抹62.5 mg凡士林;模型組造模時涂抹62.5 mg咪喹莫特乳膏,治療時涂抹62.5 mg凡士林;陽性藥物組、苦參組、土茯苓組和苦參土茯苓組造模時涂抹62.5 mg咪喹莫特乳膏,治療時分別涂抹62.5 mg的本維莫得乳膏、苦參軟膏、土茯苓軟膏和苦參土茯苓軟膏。

1.6 PASI評分PASI評分量表由皮損面積、紅斑程度、厚度和鱗屑程度4個指標組成。根據《銀屑病PASI評分標準小程序》中皮損面積、紅斑程度、厚度和鱗屑程度4個指標的嚴重程度進行選擇,最后計算獲得PASI評分。

1.7 HE染色皮膚組織固定于福爾馬林溶液中,用石蠟包埋后切片,經脫蠟和復水后,HE染色試劑盒進行染色,經過乙醇脫水和二甲苯透明后,封片保存。顯微鏡觀察并拍照分析。

1.8 免疫組化將組織固定于福爾馬林溶液中,石蠟包埋后切片,經過脫蠟復水抗原修復后,ddH2O洗滌,加入透膜封閉液(50 g·L-1BSA)孵育60 min。去除透膜封閉液,TBST(25 mmol·L-1Tris、137 mmol·L-1NaCl、2.7 mmol·L-1KCl、0.5 mL·L-1Tween-20、pH 7.4)洗3遍。切片與一抗工作液4 ℃孵育過夜;去除一抗工作液,TBST洗3遍,加入二抗工作液室溫孵育2 h;去除二抗工作液,TBST洗3遍。滴加適量DAB溶液,染色2～5 min后迅速用ddH2O沖洗干凈;經過乙醇脫水和二甲苯透明后,封片保存。顯微鏡觀察并拍照分析。

1.9 代謝組學樣品制備與檢測將血清從-80 ℃取出,于冰上融化,2 200 r·min-1渦旋5～10 s。取50 μL血清至另一離心管中,加入200 μL甲醇乙腈混合液(甲醇 ∶乙腈=1 ∶1),2 200 r·min-1渦旋混合2 min,13 000 r·min-1、4 ℃離心20 min。取上清液,將上清液用離心濃縮儀進行濃縮或氮吹干燥,用20%甲醇進行復溶后,13 000 r·min-1、4 ℃離心10 min,取上清用LC-MS檢測分析。

色譜柱采用Waters ACQUITY UPLC?HSS T3柱(1.8 μm,2.1×150 mm),柱溫50 ℃,流速0.35 mL·min-1,進樣量5 μL,自動進樣器溫度4 ℃。洗脫條件:流動相A為含0.1%甲酸的水,流動相B為含0.1%甲酸的乙腈;0～1 min,5% B;1～22 min,5%～100% B;22～26 min,100% B;26～28 min,100%～5% B;28～30 min,5% B。

質譜儀采用Triple TOF 5600質譜儀(美國AB Sciex公司),離子源類型為ESI,毛細管電壓5 500 V/-4 500 V,離子源溫度450 ℃,輔助氣N2,氣簾氣(CUR)30 psi,霧化氣(GS1)55 psi,輔助氣(GS2)55 psi,去簇電壓(DP)60 V/-60 V,碰撞能量(CE)45/-50 eV,模式采用數據依賴性采集方案(IDA),TOF MS掃描范圍100～1 500 Da。

1.10 代謝組學數據處理與分析使用HMDB(http://www.hmdb.ca/)數據庫、MSDAIL軟件、SCIEX OS軟件進行代謝物數據收集,峰面積經歸一化處理后,采用SIMCA軟件進行數據主成分分析(principal component analysis,PCA)、偏最小二乘(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)和正交偏最小二乘法(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)分析中的VIP(variable importance in the projection)> 1及t檢驗(P<0.05)進行差異代謝物的篩選,使用MetaboAnalyst 5.0 進行差異代謝物通路分析。

1.11 統計學分析數據分析和圖表制作采用GraphPad Prism 8.0進行,多組間比較用Two-way ANOVA檢驗法分析或One-way ANOVA分析。

2 結果

2.1 苦參和土茯苓成分鑒定結果通過二級碎片質核比(m/z)比對,從苦參中檢測出11個主要成分(Tab 1),分別為苦參堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、金雀花堿、臭豆堿、槲皮素、8-異戊烯基山奈酚、脫氧山奈酚、柚皮素、芒柄花黃素、雞豆黃素。土茯苓中檢測出10個主要成分(Tab 2),分別為落新婦苷、棕櫚酸、胡蘿卜苷、白藜蘆醇、丁香酸、槲皮素、谷甾醇、亞油酸、油酸、阿魏酸。

2.2 苦參和土茯苓聯用改善小鼠銀屑病樣皮損的研究為了探索苦參和土茯苓聯用是否具有治療銀屑病的作用,采用咪喹莫特乳膏誘導的小鼠銀屑病模型評價其藥效(Fig 1A)。第7天小鼠背部圖片顯示,相比于健康小鼠,模型組小鼠背部皮膚紅斑和鱗屑增多,苦參土茯苓聯用組和陽性藥物本維莫德均可以減少皮膚紅斑和鱗屑,而苦參和土茯苓單用對皮膚紅斑和鱗屑無明顯作用(Fig 1B)。PASI評分結果表明,苦參土茯苓聯用可降低小鼠銀屑病的PASI評分,但藥效作用弱于本維莫德(Fig 1C)。采用HE染色評價小鼠皮損處的皮膚結構,結果表明,模型組小鼠皮膚的表皮增厚,表皮突延長,并增多;苦參土茯苓聯用可以減小表皮厚度,但作用弱于本維莫得;苦參和土茯苓單用對表皮厚度無明顯影響(Fig 2)。綜上,苦參和土茯苓聯用改善小鼠銀屑病樣皮損,藥效弱于本維莫德乳膏。

Tab 1 Main ingredients of SF

Tab 2 Main ingredients of RSG

2.3 苦參和土茯苓聯用防治小鼠銀屑病復發的研究為了評價苦參和土茯苓聯用治療銀屑病治愈后疾病復發情況,小鼠于第7天停止造模治療,恢復14 d至皮損自愈后,所有小鼠(包括健康組)給予低劑量(20 mg)咪喹莫特乳膏,誘發小鼠銀屑病的復發(Fig 3A)。在造模和治療期,模型組出現銀屑病樣皮損癥狀,苦參土茯苓聯用緩解小鼠銀屑病樣皮損。由于咪喹莫特乳膏可誘導毛發形成[10],復發誘導過程中,除健康組外,其它組小鼠背部毛發形成,影響背部皮損PASI評分,因而采用皮膚鏡觀察皮損情況。結果顯示,低劑量咪喹莫特乳膏誘導后,健康組皮膚無鱗屑無紅斑,模型組皮膚紅斑和鱗屑明顯增多,本維莫德組和苦參土茯苓聯用組的皮膚鱗屑較少(Fig 3B)。進一步,采用HE染色觀察皮膚結構評價復發誘導后小鼠銀屑病嚴重程度。結果表明,與健康組相比,模型組表皮增厚,表皮突延長(Fig 3C)。給藥本維莫德組和苦參土茯苓聯用后表皮厚度變薄,且兩組的厚度一致,表皮突延長長度減小;而苦參組和土茯苓組的皮膚結構無明顯變化(Fig 3C,D)。因此,苦參和土茯苓聯用治療小鼠銀屑病后,小鼠銀屑病復發程度減緩,且作用效果與本維莫德乳膏相當。

Fig 1 Combination of SF and RSG ameliorated skin lesion of IMQ-induced psoriasis-like

2.4 苦參和土茯苓聯用抑制小鼠表皮細胞增殖外用苦參和土茯苓聯用明顯抑制小鼠銀屑病皮損的表皮增厚,表皮角質形成細胞的過度增殖是引起銀屑病表皮增厚的關鍵。為了評價苦參土和茯苓聯用對表皮角質形成細胞增殖能力的影響,采用免疫組化檢測皮膚中Ki67的表達量。結果表明,與健康組相比,治療后和復發誘導后的模型組小鼠皮膚中Ki67的表達量明顯升高,經本維莫德和苦參土茯苓聯用治療后小鼠皮膚中Ki67的表達量明顯降低,且本維莫得效果較強;單用苦參和土茯苓治療對Ki67的表達無影響(Fig 4)。經復發誘導后,與模型組相比,本維莫德組和苦參土茯苓聯用組的小鼠皮膚中Ki67的表達量明顯較低,且效果相當。綜上,苦參和土茯苓聯用抑制小鼠表皮角質形成細胞的增殖。

Fig 2 Combination of SF and RSG inhibited epidermal hyperplasia in skin of psoriatic mice

2.5 苦參和土茯苓聯用抑制皮膚中T細胞的募集和活化T細胞的募集和活化是銀屑病表皮細胞增殖的關鍵機制,如CD4+T細胞、Th17細胞和γδ T細胞是銀屑病發生發展的關鍵細胞群,CD8+TRM細胞和Vγ4+Vδ4+T細胞是銀屑病復發的關鍵細胞群[11]。結果表明,與健康組相比,治療后和復發誘導后的模型組小鼠皮膚中CD3的表達量明顯升高,經苦參土茯苓聯用治療后小鼠皮膚中CD3的表達量明顯降低,單用苦參和土茯苓治療降低CD3的表達,而本維莫得對CD3的表達無影響(Fig 5)。經復發誘導后,與模型組相比,本維莫德組和苦參土茯苓聯用組的小鼠皮膚中CD3的表達量明顯較低,且效果相當。綜上,苦參和土茯苓聯用減少皮膚中T細胞的數量,表明苦參和土茯苓聯用抑制皮膚中T細胞的募集和活化。

Fig 3 Combination of SF and RSG inhibited recurrent epidermal hyperplasia of psoriasis

2.6 血清代謝組學多元統計分析為了探索苦參和土茯苓聯用延緩小鼠銀屑病復發的作用機制,采用代謝組學技術評價誘導復發后小鼠血清代謝物輪廓的差異。應用OPLS-DA對各組血清樣本進行代謝輪廓分析顯示,健康組、模型組、本維莫德組和苦參土茯苓組明顯分開,表明血清代謝物的變化與銀屑病的發生發展預后相關(Fig 6A)。與模型組相比,苦參土茯苓組和本維莫德組的陰離子模式檢測到的血清代謝物的調節趨勢一致,而陽離子模式檢測到的血清代謝物的調節趨勢不一致,表明苦參土茯苓聯用和本維莫德既有類似的作用機制,也有不同之處(Fig 6A)。

2.7 差異代謝物研究在銀屑病發病中,與炎癥相關的花生四烯酸代謝紊亂,二十二碳四烯酸等濃度發生變化,不飽和脂肪酸合成增加,形成氧化應激,磷脂酰膽堿和磷脂酰肌醇水平降低,必需氨基酸、棕櫚酰肉堿等發生明顯變化[12]。因此進行代謝組學研究,應用OPLS-DA分析苦參土茯苓組和模型組,發現兩組代謝物輪廓明顯分開(Fig 6B),表明苦參和土茯苓聯用明顯改善銀屑病小鼠的代謝異常。分析得到健康組和模型組之間有22個差異代謝物(Tab 3),其中12個代謝物是苦參土茯苓組和模型組之間的差異代謝物(Fig 7)?？鄥⒑屯淋蜍呗撚媚軌蛳抡{銀屑病小鼠血清中的3-吲哚丙烯酸、二氫鞘氨醇、N-棕櫚酰鞘氨醇、L-乙酰肉毒堿、鵝肌肽、馬尿酸、肌醇-6-磷酸和色氨酸,上調銀屑病小鼠血清中的14,15-EET、LPC 22 ∶6、LPC 22 ∶5/0 ∶0和LPC 22 ∶4/0 ∶0(Fig 7),表明苦參和土茯苓聯用明顯調節銀屑病小鼠的代謝異常。

2.8 代謝通路研究應用Metaboanalyst數據庫對差異代謝物進行分析。與銀屑病復發明顯相關的代謝通路主要花生四烯酸代謝、鞘脂代謝、色氨酸代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、苯丙氨酸代謝、組氨酸代謝等,而苦參和土茯苓明顯調節的代謝通路為:花生四烯酸代謝、鞘脂代謝、色氨酸代謝、苯丙氨酸代謝(Fig 8)。

Fig 4 Combination of SF and RSG prevented proliferation of epidermal cells

Tab 3 Differential serum metabolites associated with psoriasis

Fig 5 Combination of SF and RSG reduced T cell frequency in

Fig 6 OPLS-DA score plots of plasma metabolic

Fig 7 Relative peak areas of metabolites in serum regulated by

Fig 8 Metabolic pathways involved in psoriasis development and treatment

3 討論

銀屑病的復發是其治療的難點,苦參和土茯苓聯用治療小鼠銀屑病,雖然治療作用弱于陽性藥物本維莫德,但對治療后小鼠銀屑病復發的減緩作用與本維莫德相當。目前認為銀屑病復發與炎癥記憶有關,治愈的皮損部位存在記憶性CD8+T(CD8+TRM)細胞和炎癥記憶性角質形成細胞,使得角質形成細胞能夠快速響應銀屑病誘導因素的刺激,形成細胞異常增殖與皮膚免疫微環境正反饋環路[13]?？鄥⒑屯淋蜍呓档推つw中總T細胞的數量,說明苦參和土茯苓聯用可能降低CD8+TRM的數量,從而減緩銀屑病復發作用。

代謝途徑可以控制免疫細胞和角質形成細胞的活化和分化,影響銀屑病的發生發展。花生四烯酸代謝參與銀屑病的多種病理過程:表皮細胞的分裂生長、角質形成細胞的炎癥反應、T細胞的激活、中性粒細胞的募集等[14-15]。鞘脂代謝的關鍵產物,鞘氨醇-1-磷酸酯通過激活Ca2+信號通路抑制角質形成生長[16]。黃尿酸、5-羥基色氨酸等體內色氨酸代謝的關鍵產物是AhR的激動劑,激活AhR促進角質形成細胞的正常分化,誘導調節性T細胞的分化抑制Th17活化,已經成為銀屑病外用藥物的一個明顯靶點[17-18]。本研究發現,苦參和土茯苓聯用影響花生四烯酸、鞘脂、色氨酸、苯丙氨酸等代謝通路,表明苦參和土茯苓聯用通過調節這四種代謝通路發揮抗銀屑病作用。然而,本文結果只獲得初步的代謝輪廓的改變,下一步應利用靶向代謝組學技術聚焦研究苦參和土茯苓聯用如何調節這四條代謝通路。

綜上所述,苦參和土茯苓聯用改善小鼠銀屑病樣皮損,藥效強于單用苦參和土茯苓,弱于陽性藥物本維莫德;有效減弱小鼠銀屑病痊愈后復發?？鄥⒑屯淋蜍呗撚靡种菩∈蟊砥そ琴|形成細胞的增殖和減少皮膚中T細胞的數量,其潛在分子機制為:調節花生四烯酸代謝、鞘脂代謝、色氨酸代謝、苯丙氨酸代謝等代謝通路(Fig 9)。本研究提供了一種減緩銀屑病復發的潛在外用治療藥物,并初步闡明其作用機制。然而,本研究仍存在許多不足,針對苦參和土茯苓的配比,以及聯用調節相關代謝通路減弱銀屑病復發的分子機制,還需要進一步深入優化和研究,另外,還需要系統探索進行期和復發期銀屑病小鼠的血清和皮損的代謝輪廓差異并闡明介導銀屑病復發的關鍵代謝物。

Fig 9 Proposed mechanisms for treating psoriasis via combination of SF and RSG