清腎顆粒對(duì)大鼠NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)分化模型miR-23b和PINK1/Parkin通路的影響

金 華,張葉青,呼 琴,張 磊,陳 諾,韓燕全,王億平

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科,安徽 合肥 230031;2.合肥綜合性國(guó)家科學(xué)中心大健康研究院新安醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究所,安徽 合肥 230012;3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,安徽 合肥 230012;4.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,安徽 合肥 230031)

腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis,RIF)是各種類(lèi)型慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)發(fā)展過(guò)程中重要的病理生理改變,以腎間質(zhì)大量成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)堆積、腎小管結(jié)構(gòu)破壞為特征。腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)已被確認(rèn)為是RIF的主要因素。

MicroRNA(miRNA)是一種短鏈非編碼RNA,在機(jī)體的細(xì)胞增殖和組織分化中起著關(guān)鍵作用。miRNA已成為纖維化疾病的重要調(diào)節(jié)劑,其中miR-23b在減輕腎小管EMT和氧化應(yīng)激損傷方面具有重要作用,有可能成為干預(yù)腎臟纖維化研究的新靶點(diǎn)。PINK1/Parkin通路是介導(dǎo)線粒體自噬(mitophagy)的關(guān)鍵信號(hào)通路[1],對(duì)RIF信號(hào)調(diào)控有著密切的關(guān)系。miR-23b和PINK1/Parkin通路之間是否存在靶向調(diào)控關(guān)系,以及在腎小管EMT和RIF中的作用機(jī)制目前尚未得到闡明。中醫(yī)藥在延緩CKD疾病進(jìn)展方面具有一定的作用,清腎顆粒是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的臨床經(jīng)驗(yàn)方,前期研究已證實(shí)[2-3],CKD患者及RIF模型大鼠機(jī)體的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)顯著增強(qiáng),清腎顆粒能夠抑制CKD患者和RIF大鼠的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),延緩腎小管EMT和RIF的進(jìn)展。本文采用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)誘導(dǎo)正常大鼠腎小管上皮細(xì)(normal renal tubularduct epithelial cells in rats,NRK-52E)轉(zhuǎn)分化模型,觀察miR-23b-5p對(duì)PINK1/Parkin通路的靶向調(diào)節(jié)機(jī)制,并闡明清腎顆粒含藥血清對(duì)NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的干預(yù)機(jī)理,為其抗RIF提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑清腎顆粒由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心生產(chǎn),皖藥制字BZ20080011,批號(hào)20210215,規(guī)格10g/袋(約含生藥34g),由茵陳、丹參、生大黃、白花蛇舌草、白術(shù)、薏苡仁、澤瀉、黃連、車(chē)前草組成。重組人TGF-β1細(xì)胞因子(美國(guó)PeproTech);CCK8檢測(cè)試劑盒(BIOSS,批號(hào)BJ05203090);DMEM(cytiva,批號(hào)AG29690389);Trizol(Lifetechnogies,批號(hào)380706);Prime ScriptTMRTreagent Kit with gDNA Eraser(反轉(zhuǎn)錄試劑盒)(TaKaRa,批號(hào)AL50947A);引物合成(SangonBiotech);RIPA細(xì)胞裂解液(強(qiáng))(Beyotime,批號(hào)09271919023);Tris(Solarbio,批號(hào)809C0730);Tween-20(Solarbio,批號(hào)1121S017);PVDF膜(Millipore,批號(hào)R7SA9081E);預(yù)染蛋白Marker(Thermo,批號(hào)00784045);Western一抗二抗去除液(Beyotime,批號(hào)051418180626);ECL超敏發(fā)光試劑盒(Thermo,批號(hào)VC298015);山羊抗小鼠IgG(Zsbio,批號(hào)140193);山羊抗兔IgG(Zsbio,批號(hào)202700514);GAPDH(Zsbio,批號(hào)210040421);P62(proteintech,批號(hào)00079494);Pink1(Bioss);Parkin(Santa Cruz,批號(hào)K1120);Beclin-1(abcam,批號(hào)GR3204186-1);LC3B(CST,批號(hào)13);α-SMA(bioss,批號(hào)AG03286338)。

1.2 儀器離心機(jī)(上海和欣科教設(shè)備有限公司);培養(yǎng)箱(Thermo);超凈工作臺(tái)(蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司);普通PCR儀(杭州晶格科學(xué)儀器有限公司);低速迷你離心機(jī)(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司);高速臺(tái)冷凍離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司);微量移液器(德國(guó)Eppendorf);熒光定量PCR儀(ThermoScientific);微孔板迷你離心機(jī)(杭州奧盛儀器有限公司);電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀(上海天能科技有限公司);自動(dòng)曝光儀(上海培清科技有限公司);Acquity超高效液相系統(tǒng)(Waters公司);色譜柱Luna Omega 1.6 μm C18(100×2.1 mm)。

1.3 方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞

1.3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用SPF級(jí)雄性SD大鼠20只,2月齡,體質(zhì)量(200±20) g,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,均購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SCXK(蘇)2022-0005。

1.3.1.2 細(xì)胞 NRK-52E和HEK-293T細(xì)胞,購(gòu)自賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司。

1.3.2清腎顆粒的指紋圖譜分析 采用超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography,UPLC)法對(duì)清腎顆粒進(jìn)行全指紋圖譜分析[5]。使用C18色譜柱,流動(dòng)相A為乙睛,流動(dòng)相B為0.05%磷酸水,梯度洗脫,流速0.25 mL·min-1,進(jìn)樣量1 μl,柱溫30 ℃。每批次清腎顆粒取0.3 g,用75%乙醇溶解于10 mL中,超聲震蕩30 min,0.22 μm濾膜過(guò)濾檢測(cè)濾液。稱取適量對(duì)照品制備對(duì)照品溶液。

1.3.3大鼠含藥血清制備 將大鼠隨機(jī)分為藥物組和空白組,每組10只。藥物組大鼠給予清腎顆粒20 g·kg-1·d-1灌胃,連續(xù)給藥10 d后處死動(dòng)物,腹主動(dòng)脈無(wú)菌采血,制備含藥血清,置-20 ℃保存?zhèn)溆谩？瞻捉M動(dòng)物給予等量生理鹽水灌胃,并如上法制備大鼠空白血清。

1.3.4細(xì)胞的培養(yǎng) 將NRK-52E細(xì)胞置于DMEM/F12培養(yǎng)液中(DMEM與F12的比例為1 ∶1,培養(yǎng)液中含有青、鏈霉素各100 kU·L-1,10%FBS),在無(wú)菌培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng);將細(xì)胞形態(tài)良好的NRK-52E傳代在6孔板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)到融合度約50%時(shí),將培養(yǎng)液更換為無(wú)血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.5CCK-8法檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞活力 細(xì)胞貼壁后加入適量的TGF-β1,根據(jù)TGF-β1刺激濃度分為6組(TGF-β1濃度分別為0 、5 、7.5 、10 、12.5 、15 μg·L-1),放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)到0 h、24 h、48 h和72 h時(shí)取出。細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)法(CCK-8法)檢測(cè)細(xì)胞活性:在96孔板中每孔加入10 μL CCK-8進(jìn)行檢測(cè),37 ℃孵育4 h,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度(A)值并計(jì)算細(xì)胞活性。另取NRK-52E細(xì)胞,方法同上,待細(xì)胞貼壁后用TGF-β1(10 μg·L-1)刺激,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,根據(jù)加入清腎顆粒含藥血清的濃度不同分為5組(分別更換為正常含藥血清、5%含藥血清、10%含藥血清、20%含藥血清、30%含藥血清的培養(yǎng)基)。邊緣孔加PBS緩沖液,分別在培養(yǎng)0 h、24 h、48 h和72 h時(shí)取出,在96孔板中每孔加入10 μL CCK-8進(jìn)行檢測(cè)細(xì)胞活性。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)篩選出清腎顆粒含藥血清的最佳濃度和時(shí)間分別為20%和24 h,TGF-β1刺激的最佳濃度和時(shí)間為10 μg·L-1和24 h(詳見(jiàn)研究結(jié)果),再進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.6細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 用Lipofectamine 2000試劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,相關(guān)microRNA轉(zhuǎn)染分組:miR-23b-5p模擬物組、模擬物空載對(duì)照組、miR-23b-5p抑制劑組、抑制劑空載對(duì)照組。

1.3.7清腎顆粒含藥血清干預(yù)實(shí)驗(yàn)及回復(fù)實(shí)驗(yàn) 將清腎顆粒含藥血清作用于NRK-52E細(xì)胞(TGF-β1刺激),并轉(zhuǎn)染miR-23b-5p mimic,分組為:①正常組:NRK-52E+無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基;②TGF-β1組(模型組):DMEM培養(yǎng)基+10 μg·L-1TGF-β1;③清腎顆粒組:DMEM培養(yǎng)基+10 μg·L-1TGF-β1+20%清腎顆粒含藥血清;④miR-23b-mimic-NC組:DMEM培養(yǎng)基+10 μg·L-1TGF-β1+miR-23b-mimic-NC;⑤miR-23b-mimic組:DMEM培養(yǎng)基+10 μg·L-1TGF-β1+miR-23b-mimic;⑥miR-23b-mimic+清腎顆粒組:DMEM培養(yǎng)基+10 μg·L-1TGF-β1+miR-23b-mimic+20%清腎顆粒含藥血清。

1.3.8Western blot法檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞中Pink1、Parkin、LC3Ⅱ、Beclin-1、P62、α-SMA蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞,用RIPA裂解液提取總蛋白并測(cè)量蛋白濃度。分離總蛋白,電泳并轉(zhuǎn)膜。封閉2 h,TBST洗膜,加入一抗孵育,4 ℃過(guò)夜。第二天洗膜后,將膜與適當(dāng)?shù)亩故覝剌p搖孵育1 h后洗膜。使用ECL發(fā)光試劑盒來(lái)檢測(cè)蛋白。使用Image J軟件以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參照GAPDH的灰度值比值做統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.9RT-qPCR法檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞中miR-23b、Pink1、Parkin、Beclin-1、α-SMA mRNA表達(dá) 使用TRIzol試劑從NRK-52E細(xì)胞中提取各組細(xì)胞總RNA,按microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。進(jìn)行定量PCR引物設(shè)計(jì)合成(Tab 1)。以cDNA為擴(kuò)增模板,進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。以U6為內(nèi)參,2-ΔΔCt方法分析miR-23b-5p的相對(duì)表達(dá)水平,引物序列見(jiàn)Tab 1。

1.3.10熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-23b與PINK1的靶向關(guān)系 將PINK1的3′UTR全長(zhǎng)克隆到pmirGLO載體中,命名為野生型PINK1(PINK1-WT),同時(shí)將PINK1突變體克隆到pmirGLO載體中獲得PINK1-MUT報(bào)告載體。隨后將293T細(xì)胞以每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種在24孔板中,并通過(guò)lipofectamine 2000將報(bào)告載體和miR-23b mimics或miRNA陰性對(duì)照miR-NC共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞,48 h后收集各組細(xì)胞通過(guò)熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)系統(tǒng)測(cè)定熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 清腎顆粒的指紋圖譜分析UPLC指紋圖譜法鑒定出清腎顆粒中11個(gè)活性成分:綠原酸(Chlorogenic acid)、鹽酸小檗堿(Berberine hydrochlorid)、大車(chē)前苷(Plantamajoside)、濱蒿內(nèi)酯6,7-二甲氧基香豆素(6,7-dimethoxycoumarin)、表小檗堿(Epiberberine)、黃連堿(Coptisine)、丹酚酸B(Salvianolic acid B)、巴馬汀(Palmatine)、益母草堿(Leonurine)、大黃酸(Rheic acid)、丹參酮ⅡA(Tanshinone ⅡA)。(Fig 1)

2.2 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞活力

2.2.1TGF-β1誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的時(shí)間及濃度篩選 不同濃度TGF-β1刺激NRK-52細(xì)胞24h,A值與NRK-52E組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),TGF-β1濃度為10 μg·L-1時(shí),與TGF-β1濃度為7.5 μg·L-1及5 μg·L-1相比差異明顯(P<0.05),與TGF-β1濃度為12.5 μg·L-1及15 μg·L-1相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),故選擇TGF-β1刺激NRK-52細(xì)胞的最佳濃度為10 μg·L-1,時(shí)間為24h(Tab 2、Fig 2A)。

2.2.2清腎顆粒含藥血清作用濃度和時(shí)間的篩選 不同濃度清腎顆粒含藥血清作用時(shí)間為24 h時(shí),與正常血清組相比,清腎顆粒含藥血清各組均明顯減少(P<0.05)。隨著濃度升高,20%含藥血清組A值下降最顯著,其與5%、10%含藥血清組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與30%含藥血清組差異不明顯,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。故選擇清腎顆粒含藥血清作用NRK-52細(xì)胞的最佳濃度為20%,時(shí)間為24h(Tab 3、Fig 2B)。

Tab 1 Primers involved in RT-qPCR

Fig 1 UPLC fingerprint of Qingshen granules

Tab 2 Comparison of OD values of cells in each group at different time

2.3 NRK-52E細(xì)胞中miR-23b-5p對(duì)PINK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響分別將miR-23b-5p mimic、inhibitor轉(zhuǎn)染到NRK-52E細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),miR-23b-5p模擬物組的miR-23b-5p、PINK1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯高于模擬物空載對(duì)照組(P<0.05);miR-23b-5p抑制劑組的miR-23b-5p、PINK1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯低于抑制劑空載對(duì)照組(P<0.05)。以上結(jié)果表明,miR-23b-5p過(guò)表達(dá)后,PINK1 mRNA表達(dá)量也明顯增加;而miR-23b-5p表達(dá)沉默后,PINK1 mRNA表達(dá)量也明顯減少(Tab 4、Fig 3)。

Tab 3 Comparison of OD values of cells in each group at different time

Fig 2 Growth curve of NRK-52E cells stimulated by different concentrations of TGF-β1 (A) and Qingshen granule-containing serum (B)

Tab 4 Effect of miR-23b-5p on PINK1 mRNA

Fig 3 Effect of miR-23b-5p on PINK1 mRNA in 293T cells

2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-23b與PINK1的靶向關(guān)系Rno-miR-23b-5p與Rno-PINK1之間存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)(Fig 4A);雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果顯示(Fig 4B),NC mimics+Rno-PINK1-wt組、Rno-miR-23b-5p+Rno-PINK1-wt組、NC mimics+Rno-PINK1-mu組、Rno-miR-23b-5p+Rno-PINK1-mu組的熒光素酶相對(duì)活性分別為1.000±0.032、0.378±0.046、1.000±0.022、1.043±0.052。與NC mimics+Rno-PINK1-wt組相比,Rno-miR-23b-5p+Rno-PINK1-wt組的相對(duì)熒光素酶活性明顯降低(n=3,P<0.01);而當(dāng)PINK1基因3′UTR的潛在結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生點(diǎn)突變后,與NC mimics+Rno-PINK1-mu組相比,Rno-miR-23b-5p+Rno-PINK1-mu組的相對(duì)熒光素酶活性差異沒(méi)有顯著變化(n=3,P>0.05)。

Fig 4 Rno-miR-23b-5p and Rno-PINK1 target site binding diagram (A) and dual luciferase reporter gene to detect interaction between the two (B)

2.5 清腎顆粒含藥血清對(duì)NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的干預(yù)作用

2.5.1Western blot法檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞中Pink1、Parkin、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、P62、α-SMA蛋白表達(dá) 與正常組比較,TGF-β1組細(xì)胞Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均明顯降低,P62和α-SMA表達(dá)明顯升高(P<0.05)。與TGF-β1組比較,清腎顆粒組、miR-23b-mimic組Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均明顯升高,P62和α-SMA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。與miR-23b-mimic-NC組比較,miR-23b-mimic組Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均明顯升高,P62和α-SMA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。與miR-23b-mimic組比較,miR-23b-mimic+清腎顆粒組Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均明顯升高,P62和α-SMA表達(dá)明顯降低(P<0.05)(Tab 5,Fig 5)。

2.5.2qRT-PCR法檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞中miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1、α-SMA mRNA表達(dá)情況 與正常組比較,TGF-β1組miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1 mRNA表達(dá)量明顯降低,α-SMA mRNA表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。與TGF-β1組比較,清腎顆粒組、miR-23b-mimic組miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1表達(dá)量均明顯升高,α-SMA表達(dá)均水平明顯降低(P<0.05)。與miR-23b-mimic-NC組比較,miR-23b-mimic組miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1表達(dá)量明顯升高,α-SMA表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。與miR-23b-mimic比較,miR-23b-mimic+清腎顆粒組miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1表達(dá)量明顯升高,α-SMA表達(dá)量明顯降低(P<0.05)(Tab 6,Fig 6)。

3 討論

腎小管EMT是引起RIF的關(guān)鍵事件,表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞失去上皮表面標(biāo)記物,轉(zhuǎn)而獲得間質(zhì)細(xì)胞表型、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(如α-SMA)表達(dá)增多,最終轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞,發(fā)展成腎臟纖維化。線粒體自噬(mitophagy)作為一種特殊的自噬,是細(xì)胞持續(xù)清理衰老和損傷的線粒體,確保線粒體循環(huán)利用的重要途徑。線粒體自噬在纖維化疾病的發(fā)展中起關(guān)鍵作用,其通過(guò)減少線粒體釋放活性氧、促凋亡物質(zhì),緩解炎癥和氧化應(yīng)激損傷,減少細(xì)胞凋亡,發(fā)揮抗纖維化的作用[4]。由于腎臟是一個(gè)高耗能器官,而腎小管是腎組織內(nèi)能量消耗較多的部位,且腎小管上皮細(xì)胞(RTEC)富含線粒體,對(duì)缺血缺氧十分敏感,腎小管重吸收及分泌功能均依賴線粒體氧化磷酸化供能。因此線粒體自噬介導(dǎo)的線粒體質(zhì)量控制是調(diào)節(jié)腎臟細(xì)胞穩(wěn)態(tài)極其關(guān)鍵的機(jī)制。

PINK1/Parkin通路是介導(dǎo)線粒體自噬的經(jīng)典信號(hào)通路[5]。當(dāng)線粒體受到應(yīng)激時(shí),PINK1會(huì)在線粒體外膜上富集,隨后PINK1激活泛素(ubiquitin,Ub)和Parkin,生成用于識(shí)別受損線粒體的Parkin-Ub復(fù)合物,此時(shí)P62蛋白(也稱為SQSTM1)在線粒體外膜上積累,并將Parkin-Ub復(fù)合物和LC3蛋白連接起來(lái),使自噬體能夠吞噬降解受損的線粒體。同時(shí)Beclin1作為自噬起始蛋白,在自噬起始時(shí)與PI3k和Atg14形成三聚體,不斷招募自噬相關(guān)蛋白介導(dǎo)線粒體自噬。因此,P62、LC3-Ⅱ和Beclin1是參與自噬過(guò)程的3種主要蛋白質(zhì),在自噬體形成中發(fā)揮至關(guān)重要的作用,是反映自噬活動(dòng)的特異性指標(biāo)。在本研究中我們發(fā)現(xiàn),TGF-β1誘導(dǎo)大鼠NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)分化模型中,Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ表達(dá)及LC3Ⅱ/Ⅰ比值明顯降低,P62和α-SMA表達(dá)明顯升高,提示在腎小管轉(zhuǎn)分化進(jìn)程中PINK1/Parkin通路活性及其介導(dǎo)的線粒體自噬活性是降低的。在其他腎臟疾病的研究中也證實(shí)了線粒體自噬減少是加重疾病進(jìn)展的重要因素。在腎缺血再灌注損傷(IRI)模型中,通過(guò)抑制PINK1/Parkin通路能夠負(fù)性調(diào)節(jié)線粒體自噬,加重了IRI損傷情況[6]。在糖尿病腎病中通過(guò)抑制PINK1介導(dǎo)的線粒體自噬,能夠加重腎纖維化進(jìn)程[7];而通過(guò)介導(dǎo)線粒體自噬活性增強(qiáng),能夠抑制ROS和NLRP3炎癥小體激活,進(jìn)而發(fā)揮抗腎纖維化作用[8]。因此,恢復(fù)線粒體自噬平衡作為治療RIF的藥理學(xué)靶點(diǎn)的可能性,為更有效地抗腎臟纖維化、延緩CKD進(jìn)展提供新思路。

Tab 5 Comparison of Pink1,Parkin,α-SMA,LC3Ⅱ,Beclin-1 and P62 protein expression in NRK-52E

Fig 5 Comparison of protein expression in different

Tab 6 Comparison of miR-23b-5p,Pink1,Parkin,Beclin-1 and α-SMA mRNA expression in NRK-52E cells(Mean±SD,n=6)

Fig 6 Comparison of mRNA expression in different

miRNA作為一種短鏈非編碼小分子RNA,能夠通過(guò)在轉(zhuǎn)錄后水平上完全或部分結(jié)合靶蛋白編碼的mRNAs進(jìn)行降解或翻譯抑制,調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),miRNAs參與RIF的調(diào)節(jié)過(guò)程,成為干預(yù)腎臟纖維化治療的新靶點(diǎn)。Liu 等[9]研究發(fā)現(xiàn)miR-23b在高糖處理的腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)和糖尿病腎病小鼠腎組織中水平明顯降低,miR-23b被確定為糖尿病腎病中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的抑制因子。Wang 等[10]研究也發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的miR-23b通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路來(lái)抑制糖尿病腎病中腎纖維化的發(fā)生。本課題組在前期研究中已通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及尿外泌體Small RNA測(cè)序技術(shù),篩選出慢性腎衰竭患者體內(nèi)97個(gè)差異miRNA(包含84個(gè)上調(diào)miRNA和13個(gè)下調(diào)miRNA),其中miR-23b-5p在慢性腎衰竭患者體內(nèi)的表達(dá)是明顯下調(diào)的(log2 Fold Change=-4.50953,qValue=0.003 782)[11]。

miR-23b和PINK1/Parkin通過(guò)參與多種信號(hào)通路的調(diào)控,抑制腎間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞自噬等反應(yīng),進(jìn)而延緩RIF進(jìn)展。但miR-23b靶向PINK1/Parkin通路研究對(duì)腎纖維化的干預(yù)作用目前報(bào)道較少。本研究通過(guò)TGF-β1誘導(dǎo)大鼠NRK-52E細(xì)胞,探討miR-23b對(duì)PINK1/Parkin通路的靶向調(diào)節(jié)機(jī)制,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾miR-23b-5p表達(dá)后,PINK1通路活性也進(jìn)一步被抑制,NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)分化進(jìn)程進(jìn)一步增強(qiáng);而miR-23b-5p過(guò)表達(dá)后,PINK1通路活性也進(jìn)一步被激活,NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)分化進(jìn)程減弱,提示miR-23b-5p可通過(guò)調(diào)控PINK1通路,進(jìn)而介導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。本研究中雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了此調(diào)節(jié)機(jī)制,我們發(fā)現(xiàn)miR-23b-5p能明顯下調(diào)Rno-PINK1-WT熒光素酶活性,但未能下調(diào)突變PINK1-mut熒光素酶活性,表明miR-23b-5p能與PINK1基因3′UTR結(jié)合,miR-23b可以靶向調(diào)節(jié)PINK1基因的表達(dá)。因此,miR-23b-5p對(duì)PINK1/Parkin通路具有靶向調(diào)控作用。

本課題組團(tuán)隊(duì)立足于“熱能化濕、燥濕為本、化濕攻下、化瘀通絡(luò)”等新安醫(yī)學(xué)理論基礎(chǔ),并針對(duì)慢性腎臟病“濕熱傷腎、濕熱與瘀交結(jié)”的病機(jī),開(kāi)發(fā)出具有清熱化濕祛瘀功效的中藥清腎顆粒并成功應(yīng)用于臨床治療CKD,取得良好臨床療效。多中心、隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)證實(shí)清腎顆粒能夠有效改善CKD濕熱證患者的臨床癥狀、提高生活質(zhì)量、延緩腎衰竭進(jìn)展;有效改善腎性貧血、營(yíng)養(yǎng)不良、鈣磷代謝紊亂、胃腸功能紊亂等CKD并發(fā)癥;且安全性良好[12]。前期研究也發(fā)現(xiàn),清腎顆粒治療慢性腎臟病患者和抗腎纖維化機(jī)制中具有多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、多途徑作用特點(diǎn)[3,13-16]。本研究進(jìn)一步通過(guò)UPLC指紋圖譜法鑒定出清腎顆粒中的11個(gè)活性成分,且這11個(gè)活性成分在抗炎、抗氧化、增強(qiáng)線粒體自噬、抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、抗纖維化方面均有不同程度作用,這些活性成分有可能是清腎顆粒防治RIF的有效靶點(diǎn)[17]。

本研究也進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),清腎顆粒含藥血清可以上調(diào)NRK-52E轉(zhuǎn)分化細(xì)胞模型中miR-23b-5p表達(dá),增強(qiáng)PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬活性,進(jìn)而起到抑制NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)分化進(jìn)程。

綜上所述,TGF-β1介導(dǎo)的NRK-52E轉(zhuǎn)分化細(xì)胞模型中,miR-23b-5p表達(dá)和PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬活性是下降的;miR-23b-5p可以靶向調(diào)節(jié)PINK1/Parkin通路,通過(guò)增強(qiáng)線粒體自噬活性,抑制NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)分化;清腎顆粒含藥血清能夠通過(guò)上調(diào)miR-23b表達(dá),恢復(fù)PINK1/Parkin介導(dǎo)的強(qiáng)線粒體自噬,減輕腎小管EMT進(jìn)程,發(fā)揮抗RIF作用,這為中醫(yī)藥防治腎臟病提供新的思路和方向。