芬戈莫德增效多粘菌素B抗銅綠假單胞菌活性的發現

吳夏麗,黃 維,典靈輝

(1. 廣東醫科大學藥學院, 廣東 東莞 523000;2. 深圳市人民醫院檢驗科,暨南大學附屬第二臨床醫學院,南方科技大學第一附屬醫院,廣東 深圳 518020)

耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌(CarbapenemresistantPseudomonasaeruginosa,CRPA)已被世界衛生組織列為迫切需要開發新抗生素的最優先級關鍵性病原體之一[1]。多粘菌素B(Polymyxin B,PB)對包括CRPA在內的耐藥革蘭陰性菌具有良好的抗菌效果,被認為是治療其感染的“最后一道防線”[1]。然而,PB的毒性及臨床上出現的多粘菌素耐藥是阻礙其臨床應用的兩個重要因素[2]。開發新的替代PB的抗生素是解決上述問題最有效的方式,但周期較長且成功率極低,而開發其增效劑則是一種很好的替代方案[3]。本研究通過對已知靶點化合物庫的篩選發現芬戈莫德可增強PB的抗PA活性,具有與PB形成聯合用藥方案的潛能。

芬戈莫德(Fingolimod)的中文化學名稱:2-氨基-2-[2- (4-辛烷基苯基) 乙基]-1, 3-丙二醇,分子式為C19H33NO2,分子量為307.5[4]。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器pEX18Tc質粒(本實驗室);PB(批號: 155223,純度: 8331 u·mg-1)、芬戈莫德(批號: 120173,純度: 99.83%)、四環素(上海陶術,批號: 44913,純度: ≥ 98.0%);肉湯培養基(批號: I718KA5488)、腦心浸出液肉湯(Brain Heart Infusion Broth,批號: 1021D031)培養基,噻唑藍(MTT,批號: I720BA0002,純度: ≥ 98.0%)、10%蔗糖平板(Tryptone yeast extract and sucrose,TYS10)、MgSO4(批號: F418BA0002,純度: ≥ 98.0%)、E.coliDH5α感受態細胞(批號: B528413,上海生工);細菌總RNA提取試劑盒(批號: Y1510)、質粒提取試劑盒(批號: R7022)、細菌DNA提取試劑盒(批號: Y1626,天根生化);逆轉錄試劑盒(批號: HY-K0511A)、熒光定量PCR試劑盒(批號: HY-K0523,MedChemExpress)。

1.2 方法

1.2.1菌株和生長條件 菌株PA ATCC 27853購自美國典型培養物保藏中心,除特別提及外,液體培養基培養條件均為37 ℃ 220 r·min-1過夜振蕩,固體培養基均為37 ℃靜置培養。

1.2.2藥物聯合作用 棋盤滴定法檢測藥物聯合作用。芬戈莫德與PB以不同比例混合后接種至過夜培養的PA培養液(濃度稀釋至OD600=0.001),計算部分抑菌濃度指數(fractional inhibitory concentration index,FICI),FICI ≤ 0.5被定義為具有協同作用[5]。

1.2.3PAsr的篩選 過夜培養的PA培養液接種至含1 mg·L-1PB及2 mg·L-1芬戈莫德的LB培養基至終濃度OD600=0.001培養過夜;將上述培養液繼續接種至含1 mg·L-1PB及4 mg·L-1芬戈莫德的LB培養基至終濃度OD600=0.001培養過夜;如此反復,每一輪的PB濃度相同,芬戈莫德濃度加倍,直至細菌無法生長[6]。

1.2.4全基因組測序及數據分析 細菌基因組提取試劑盒提取基因DNA,使用 Illumina HiSeq 2500 平臺搭配 de novo SPAdes Genome Assembler (版本3.12.0)[7]和Snippy (版本4.6.0)進行基因組比對及差異注釋(https://github.com/tseemann/snippy)。

1.2.5點突變株的構建 使用pEX18Tc質粒,利用同源重組的方法構建攜帶G75T突變pmrB基因的點突變株PA-pmrBG75T。

1.2.6實時逆轉錄熒光定量PCR(Real-time reverse transcription fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR) 細菌總RNA提取試劑盒分別對處于對數期(OD600=0.8)的PA,PA-pmrBG75T及PAsr提取總 RNA后進行RT-qPCR實驗。

1.3 統計學處理GraphPad Prism軟件8.0版(La Jolla, California)進行統計分析,P<0.05被認為具有統計學意義。

2 結果

2.1 芬戈莫德增強PB的抗PA活性PB與芬戈莫德聯用時,其在PA中的FICI ≤ 0.188,表明兩者具有協同作用;而芬戈莫德本身對PA無抗菌活性(MIC>200 mg·L-1)。

2.2 PAsr的全基因組測序如Tab 1所示,PAsr相對于野生株來說,其pmrB基因的第75位由G突變為了T,導致其編碼蛋白的第25位發生了色氨酸對半胱氨酸的替代。

Tab 1 Whole genome sequencing of PAsr

2.3 芬戈莫德與PB在PAsr及PA-pmrBG75T中的聯合作用在PAsr與PA-pmrBG75T中,芬戈莫德與PB聯用時的FICI均為 ≥ 1.5,表明其增效作用消失。

2.4 受PmrB調控的基因表達水平與野生株相比,PAsr與PA-pmrBG75T的arnA、arnB、arnC、arnD、arnE、arnF、arnT、pmrA及pmrB基因的表達水平均顯著增加,表明突變后導致PmrA/B的調控功能增強。

3 討論

芬戈莫德是冬蟲夏草提取物通過結構改造而成的一種新型免疫抑制劑[8]。本研究首次發現芬戈莫德可明顯增強PB對PA的抗菌活性,聯合使用后可明顯降低PB的使用濃度,而其本身并不具備抗菌活性。由于芬戈莫德屬于已上市藥物,其安全性和可靠性已經過驗證。因此,芬戈莫德與PB的聯合使用方案具有良好的臨床應用前景,有望克服PB因毒副作用而臨床應用受限的難題。我們在對芬戈莫德與PB聯合條件下的耐藥株篩選并結合全基因組測序后發現,由pmrB基因的G75T突變導致的Trp25Cys氨基酸取代是個新的介導PA對PB耐藥的突變形式,芬戈莫德對PB抗菌活性增效作用也同時消失。

綜上所述,本研究發現了一個非抗生素類已上市藥物芬戈莫德可增強PB的抗PA活性,為開發基于兩者的聯合用藥方案提供了依據。