肝星狀細胞特異性Grk2基因敲除小鼠模型的制備及鑒定

王語涵,許雅萍,李 南,陳婷婷,李 玲,高萍萍,王 華,魏 偉,孫嫵弋

(1. 安徽醫科大學臨床藥理研究所,抗炎免疫藥物教育部重點實驗室,安徽 合肥 230032;2. 安徽醫科大學第一附屬醫院腫瘤科,安徽 合肥 230022)

G蛋白偶聯受體激酶2(G protein-coupled receptor kinase 2,GRK2)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,廣泛表達于多種組織中[1]。GRK2蛋白由689個氨基酸殘基組成,其結構包括氨基端結構域、激酶結構域和羧基端結構域。GRK2不僅能磷酸化G蛋白偶聯受體,參與其信號調節,還可以磷酸化多種非受體底物,并以激酶活性依賴的方式與其他底物相互作用[2]。GRK2也可與細胞內激酶信號分子直接作用并調節其活性,如PI3K/Akt、MEK1/2、p38 MAPK[3]。此外,GRK2還可結合并磷酸化細胞骨架蛋白,包括tubulin、ezrin、synuclein[4]。提示GRK2參與多種細胞內信號轉導,進而影響疾病的發生發展。

1996年,Jaber等[5]提出,Grk2基因敲除純合子(Grk2-/-)小鼠具有胚胎致死性。Grk2-/-胚胎在妊娠15.5 d之后無法存活,而Grk2基因敲除雜合子小鼠(Grk2+/-)在妊娠期之后正常存活,但小鼠體質量和體型與野生型小鼠相比較小,生長速度減慢[6]。GRK2在肝臟中表達豐富,肝臟中非實質細胞之一肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)位于肝竇的內皮間隙,占總肝細胞群的8%～10%[7]。由于HSC在肝臟中占比較低等特點[8],本研究通過Cre-loxP重組酶系統特異性敲除C57BL/6J小鼠HSC中Grk2基因,為探究HSC中GRK2在肝臟疾病中的作用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物Grk2fl/fl小鼠與Lrat-Cre小鼠,均購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。實驗動物飼養繁殖于安徽醫科大學臨床藥理研究所SPF屏障環境[實驗動物使用許可證號:SYXK(皖)2020-001]。飼養環境為恒溫(22±2)℃,濕度50%±5%,12 h/12 h晝夜交替。所有操作經安徽醫科大學臨床藥理研究所實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2主要試劑 蛋白酶K,購自美國Sigma公司;2×Taq PCR Master Mix,購自北京博邁德基因技術有限公司;引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司;Super Red核酸染料,購自北京蘭杰柯科技有限公司;抗β-actin抗體,購自Affinity公司;抗Desmin抗體,購自武漢愛博泰克生物科技有限公司;抗GRK2抗體,購自美國Santa Cruz公司;Alexa Fluor 647山羊抗兔熒光二抗、Alexa Fluor 488山羊抗鼠熒光二抗,均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.3儀器 通用型電泳儀(北京六一生物科技有限公司,型號DYY-7C);全自動化學發光圖像分析系統(上海天能科技有限公司,型號Tanon 5200);正置光學顯微鏡(德國LEICA公司,型號DM4B);冰凍切片機(德國LEICA公司,型號CM 1950);PCR儀(美國BIO-RAD公司,型號T100)。

1.2 方法

1.2.1HSC特異性敲除Grk2小鼠的構建策略與流程Grk2位于小鼠19號染色體,在其2號外顯子的兩端插入loxP位點(Fig 1A)。根據Cre-loxP原理,將帶有loxP位點的Grk2fl/fl小鼠與HSC特異性表達Cre重組酶的Lrat-Cre小鼠交配,Cre酶在HSC內特異性識別loxP位點,實現在HSC內特異性敲除。將Grk2fl/fl小鼠與Lrat-Cre+/+小鼠進行交配得到Grk2fl/-/Lrat-Cre+/-的小鼠,將其與Grk2fl/fl小鼠進行雜交,對其子代進行鑒定并篩選得到Grk2fl/fl/Lrat-Cre+/-(Grk2ΔHSC)實驗組小鼠和Grk2fl/fl/Lrat-Cre-/-對照組小鼠(Fig 1B)。

1.2.2HSC特異性敲除Grk2小鼠的基因型鑒定 將4周齡的小鼠進行編號,剪下3～5 mm的鼠尾,加入相應鼠尾裂解液和蛋白酶K,置于55 ℃恒溫水浴鍋消化過夜。次日3 000 r·min-1離心5 min,取200 μL裂解后產物,使用乙醇提取法獲得小鼠DNA樣本。依據引物(Tab 1)進行PCR反應。PCR體系的構成:12.5 μL 2×Taq Mix、9.5 μL去離子水、正反向引物(10 μmol·L-1)各1 μL和DNA模板(100 mg·L-1)1 μL,總體積25 μL。取13 μL擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結束后在凝膠掃描成像系統顯影,根據觀察到的擴增片段長度進行基因鑒定。

Tab 1 Primer for genotyping of Grk2ΔHSC mice

1.2.3觀察小鼠的基本情況和繁育能力 觀察實驗組Grk2ΔHSC小鼠和對照組Grk2fl/fl小鼠的體質量、生長發育狀態、繁殖能力等。

1.2.4Grk2ΔHSC小鼠原代HSC的分離 小鼠禁食12 h,麻醉后置于解剖臺上,消毒后剪開腹腔,撥開腸道,暴露肝臟、肝門靜脈與下腔靜脈,于肝門靜脈平行插入留置針,將Hank’s液用蠕動泵以合適的速度通過肝門靜脈灌入肝臟,待肝臟變成淡白色,將Hank’s液替換為Ⅳ型膠原酶溶液,繼續灌注。剝離肝臟,去除膽囊,把肝臟放入裝有Ⅳ型膠原酶溶液的培養皿中。將肝臟剪碎并制成細胞團塊懸浮液,置于37 ℃恒溫水浴鍋中消化30 min。消化完成后用濾網過濾肝臟懸浮液,然后4 ℃、2 000 r·min-1離心15 min,取沉淀棄上清液,用Hank’s液清洗沉淀,離心棄上清液。DMEM培養液重懸后,用25% Percoll和100% Percoll梯度離心分離,4 ℃、3 000 r·min-1離心15 min。吸取中間層的細胞,再次4 ℃、2 000 r·min-1離心10 min,下層沉淀即為HSC。

Fig 1 Establishment strategy (A) and flow chart (B) of Grk2ΔHSC

1.2.5免疫熒光雙染檢測HSC中GRK2的表達 將小鼠肝臟用4%多聚甲醛固定24 h后,用15%蔗糖脫水24 h,再用30%蔗糖脫水24 h,最后用OCT包埋。冰凍切片機切片,厚度為6 μm。用PBS清洗3 min,重復3遍后,用0.5% Triton X-100通透30 min,再用50×EDTA冷修復10 min,PBS清洗3 min,重復3遍后,用5% BSA封閉1 h,加入Desmin抗體和GRK2抗體,4 ℃孵育過夜。次日復溫1 h后,用PBS清洗5 min,重復3遍后,熒光二抗室溫孵育1.5 h。PBS清洗后,DAPI孵育10 min,使用抗熒光淬滅劑封片,正置光學顯微鏡觀察拍照。

1.2.6檢測Grk2ΔHSC小鼠HSC中GRK2蛋白表達 將小鼠原代HSC加入裂解液(RIPA ∶PMSF=99 ∶1)研磨后,冰上裂解30 min,吸取裂解液,12 000 r·min-1離心20 min,取上清,加入上樣緩沖液,煮沸10 min。進行SDS-PAGE電泳,轉膜,PVDF膜用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,分別加入GRK2抗體和β-actin抗體4 ℃孵育過夜。加入對應二抗室溫孵育2 h,用ECL發光顯影液于凝膠成像系統中檢測目的蛋白條帶。采用ImageJ軟件定量分析條帶灰度值,根據GRK2與β-actin條帶灰度值的比值,計算其相對表達量。

1.2.7檢測小鼠心臟、脾、肺和腎臟組織中GRK2蛋白表達 稱取適量小鼠肺、脾、腎臟和心臟組織于1.5 mL EP管中,加入裂解液后冰上裂解,12 000 r·min-1離心20 min,取上清棄沉淀,加入上樣緩沖液,煮沸10 min,進行Western blot檢測,步驟同“1.2.6”。

1.2.8肝臟及其它器官組織HE染色 將小鼠肝臟、肺、脾、心臟和腎臟組織石蠟包埋、切片,石蠟切片于二甲苯中脫蠟10 min,依次用梯度乙醇水化,使用蘇木精染色,經流水洗去染料,0.1%的鹽酸乙醇分化,流水沖洗后,0.5%伊紅染液浸泡,流水沖洗多余染液,依次經梯度乙醇脫水,再經二甲苯浸泡,最后中性樹脂封片。待樹脂風干后,使用正置熒光顯微鏡觀察并拍照。

2 結果

2.1 HSC特異性敲除Grk2小鼠的一般情況Grk2fl/fl/Lrat-Cre小鼠與Grk2fl/fl小鼠每日正常飲水,體質量無明顯差異,生長發育良好,性情無變化。Grk2ΔHSC雌鼠每胎產4～9只小鼠,成活率>90%。

2.2 HSC特異性敲除Grk2小鼠基因鑒定6～8周的Grk2fl/-/Lrat-Cre小鼠與Grk2fl/fl小鼠交配產生子代基因型鑒定結果見Fig 2。使用flox引物和Cre引物進行PCR擴增,瓊脂糖凝膠電泳對基因型進行鑒定。若有Lrat-Cre重組酶基因,可擴增出391 bp的目的片段。若小鼠基因型為Grk2fl/fl純合子,則僅擴增出431 bp的目的片段,若小鼠基因型為Grk2fl/-雜合子,則能同時擴增出431 bp和326 bp的片段。Fig 2中1、2、3、4、5均為帶有391 bp的Lrat-Cre基因目的條帶,其中1、3帶有431 bp的Grk2fl/fl基因目的條帶。結果提示,1和3為Grk2ΔHSC小鼠,2、4、5為Grk2fl/-/Lrat-Cre雜合子小鼠。

2.3 免疫熒光雙染與Western blot驗證HSC中GRK2的表達HSC為肝臟非實質細胞,其中Desmin是HSC標記蛋白之一[7]。Fig 3免疫熒光結果顯示,Grk2fl/fl小鼠肝組織中Desmin(綠色熒光)與GRK2(紅色熒光)具有明顯共定位(白色箭頭),而Grk2ΔHSC小鼠肝組織中未見明顯的Desmin和GRK2共定位,提示Grk2ΔHSC小鼠HSC中GRK2的表達明顯降低。為進一步確證HSC中GRK2已被敲除,分離Grk2ΔHSC小鼠的原代HSC,提取蛋白,利用Western blot檢測GRK2蛋白表達。Fig 4結果顯示,Grk2fl/fl對照組小鼠原代HSC中表達GRK2;與Grk2fl/fl小鼠相比,Grk2ΔHSC小鼠HSC中GRK2蛋白的表達明顯降低,提示成功構建了Grk2ΔHSC小鼠模型。

2.4Grk2ΔHSC小鼠其他器官GRK2蛋白水平為了觀察HSC中特異性敲除Grk2對其他器官組織中GRK2表達的影響,Western blot檢測了其他主要組織中GRK2的表達情況。如Fig 5所示,在肺、脾、腎臟和心臟組織中,兩組小鼠GRK2蛋白的表達差異無顯著性。提示HSC中敲除Grk2基因對小鼠其他器官組織中GRK2蛋白的表達無明顯影響。

2.5Grk2ΔHSC小鼠肝臟及其他組織HE染色為分析HSC中Grk2敲除對小鼠肝臟組織的影響,HE染色觀察Grk2ΔHSC小鼠肝臟組織形態。如Fig 6所示,Grk2ΔHSC和Grk2fl/fl小鼠肝組織中,均以中央靜脈區為中心,呈放射狀排列,肝小葉結構、形態正常,肝板排列整齊,肝細胞排列緊密,未見有變性、壞死、脂肪滴異常累積以及炎性細胞浸潤。提示HSC特異性敲除Grk2對肝組織無明顯影響。

Fig 2 Results of genotype identification of mice by PCR

Fig 3 Expression of GRK2 in HSC of Grk2ΔHSC mice by immunofluorescence double staining (×200)

Fig 4 Expression of GRK2 in HSC of Grk2ΔHSC mice n=6)

Fig 5 Expression of GRK2 in other tissue n=6)

Fig 6 HE staining results in liver tissue of Grk2ΔHSC and Grk2fl/fl mice

為進一步明確HSC特異性敲除Grk2對其他組織是否有影響,HE染色觀察小鼠肺、脾、心臟和腎臟組織。如Fig 7所示,Grk2ΔHSC小鼠與Grk2fl/fl小鼠肺組織中肺泡未見有增大,組織結構正常,間質無明顯增寬等病變;兩組小鼠脾組織中紅、白髓邊界清晰,生發中心清晰可見,脾索網絡結構良好;心肌細胞排列整齊,大小無明顯差異;兩組小鼠腎小球形態完整無損傷,腎小管排列緊密無異常,未見炎性細胞浸潤。以上結果表明,Grk2ΔHSC小鼠與Grk2fl/fl小鼠中其他器官組織學形態無明顯改變。提示HSC特異性敲除Grk2基因小鼠并未影響肝臟及主要器官組織學形態。

3 討論

由于小鼠和人類之間的遺傳和病理生理學的相似性,基因工程小鼠模型通常是研究人類疾病的首選。然而,某些基因的全身性敲除小鼠可能會引起胚胎發育異常,純合子致死等問題,導致沒有存活的小鼠進行基因功能研究。由于基因的改變可能在不同的細胞和組織中發揮不同的作用,產生復雜的表型[9]。因此,細胞特異性敲除小鼠模型正逐漸成為研究的重要工具。Cre-loxP重組酶系統因其操作簡單而被廣泛應用于生物醫學研究的基因編輯。Cre重組酶是整合酶家族的位點特異性重組酶,于1984年在噬菌體P1中發現,且是由噬菌體P38進行編碼的單體蛋白[10]。單個38 ku的Cre重組酶識別兩個重復的34個堿基對的loxP位點,介導相同方向的兩個loxP位點之間的DNA片段缺失,或兩個倒置的loxP位點之間的DNA片段翻轉[11]。

Fig 7 Histopathological examination results of lung, spleen, heart and kidney tissues in Grk2ΔHSC and Grk2fl/fl mice (×200)

肝臟是維持全身生理穩態的中樞器官,是一個高度結構化的器官,其最小結構單位是呈六邊形的肝小葉。肝細胞占肝組織大部分,排列在沿小葉軸徑向延伸的肝板中[12]。肝臟內的間質細胞包括HSC、成纖維細胞和血管平滑肌細胞等。HSC位于肝細胞和血竇之間的竇周間隙。在正常肝臟中,HSC有助于協調肝臟發育,維持細胞外基質正常結構[13]。HSC也分泌生長因子和細胞因子,并作為類維生素A或含維生素A代謝物的主要儲存庫。肝損傷后,HSC會失去含類維生素A的脂滴,分化為肌成纖維細胞?；罨蟮腍SC表達α平滑肌肌動蛋白,并合成大量的膠原纖維,進而促進肝纖維化形成[14]。如果肝損傷得到改善,HSC數量將由于細胞凋亡而減少,剩余的將少部分去分化變為未激活的HSC,這些靜止的HSC有助于去除纖維化瘢痕并重建HSC基底細胞外基質支架[15]。

本課題組前期研究發現,豬血清誘導的免疫性肝纖維化大鼠肝臟組織和原代HSC中GRK2表達水平隨造模時間的延長有下降趨勢,提示GRK2的表達變化可能在肝纖維化發生發展中具有重要的調控作用[16]。有研究表明,腺苷A2A受體的激活促進HSC產生膠原,從而參與肝纖維化的發生發展[17]。結合Khoa等[18]研究發現,GRK2磷酸化腺苷A2A受體使其脫敏,提示GRK2可能通過調節腺苷A2A受體脫敏從而參與肝纖維化。本研究采用兩個方向相同的loxP位點標記在Grk2基因的兩端,Lrat-Cre酶在HSC內識別并切除在兩個loxP位點間的目的基因,產生Grk2基因缺失的重組DNA。選用Lrat-Cre工具鼠與Grk2fl/fl小鼠進行多代繁育和基因鑒定,最終得到Grk2ΔHSC小鼠。

本實驗采用免疫熒光雙染和Western blot檢測小鼠HSC中GRK2的表達,結果顯示與對照組相比,實驗組小鼠HSC中GRK2水平明顯降低,而在肺、脾、腎臟和心臟的表達變化差異無顯著性,表明HSC特異性敲除Grk2基因小鼠表型符合預期。Grk2ΔHSC小鼠生長發育良好,子代存活率高。HE染色顯示肝臟及主要器官組織(肺、脾、心臟和腎臟)結構正常,未見細胞變性、壞死和炎性細胞浸潤等病變,與Grk2fl/fl小鼠組織形態學無明顯差異。本研究為后續研究GRK2在肝臟疾病中的潛在作用提供了小鼠模型,后續研究將繼續探討HSC特異性敲除Grk2基因對肝臟疾病進程的影響,以進一步明確GRK2在肝臟疾病中的功能機制。