Eicosapentaenoic acid代謝產(chǎn)物促進胰島α細胞轉(zhuǎn)分化為胰島β細胞的作用研究

邢朝鳳,唐敏怡,徐綺華,王 帥,張宗猛,趙子建,穆云萍,李芳紅

(廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥學(xué)院,廣東 廣州 510006)

1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)主要是由自身免疫T淋巴細胞介導(dǎo)胰島β細胞破壞,導(dǎo)致胰島素分泌嚴重不足引起[1]。目前T1DM治療以終身每日注射重組胰島素為主,然而,注射外源性胰島素時常發(fā)生嚴重的低血糖等不良反應(yīng)。大量研究嘗試利用特異的單克隆抗體作為自身免疫的拮抗藥物[2],以干預(yù)自身免疫系統(tǒng)攻擊胰島的進程。但是這類藥物非常昂貴,有各種副作用,不適合長期應(yīng)用于T1DM治療。

自Edmonton Protocol 10公布以來,異體胰島移植曾經(jīng)為T1DM患者終身擺脫胰島素治療,根治糖尿病帶來很大的希望。2000年的研究揭示了使用胰島移植替代胰島素療法治療T1DM的潛力,7名患者持續(xù)1年沒有補充外源性胰島素[3]。然而,由于胰腺供體的匱乏,并且移植的胰島在一年左右開始纖維化[4],長期存活效果欠佳,由于患者需要長期使用免疫抑制劑和抗排異反應(yīng)的藥物等一系列原因,近期實施臨床胰島移植的患者數(shù)量大幅減少,已經(jīng)無法成為擺脫注射胰島素治療T1DM的新型療法。因此,探索低免疫,增加胰島素分泌的療法,成為糖尿病治療倍受期待的選擇。

最近的一系列遺傳學(xué)和臨床研究揭示了ω-3多不飽和脂肪酸(ω-3 PUFAs)在抑制自身免疫以及保護和增強胰島功能方面的機制和治療潛力[5]。在動物研究中,有研究表明,妊娠期和哺乳期母體飲食中ω-6/ω-3 PUFAs的比率較低(3.0),推遲了非肥胖型糖尿病(non-obese diabetes,NOD)小鼠后代糖尿病的發(fā)病時間[6]。兩項大規(guī)模臨床研究顯示,通過對嬰兒和兒童食用富含EPA和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)的藥物進行早期干預(yù),對T1DM的發(fā)生發(fā)展具有明顯的預(yù)防和治療作用。Stene等[7]在一項基于大規(guī)模人群的病例對照研究中報道,在出生后第一年飲食補充魚肝油和維生素D可明顯降低兒童期T1DM的發(fā)病率。越來越多的研究關(guān)注胰腺α細胞的重編程,因為它們在發(fā)育過程中與β細胞密切相關(guān)[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)無論是mfat-1基因(內(nèi)源性的將ω-6 PUFAs轉(zhuǎn)化為ω-3 PUFAs)治療或者ω-3 PUFAs飲食干預(yù)NOD小鼠,小鼠胰腺組織切片都顯示了胰島α細胞與胰島β細胞共定位的現(xiàn)象[8]。mfat-1誘導(dǎo)的ω-3 PUFAs組織富集也被證明可以改善鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的高血糖癥[9]。對mfat-1小鼠胰腺組織中ω-3PUFAs分析發(fā)現(xiàn)EPA的含量明顯上調(diào),揭示EPA在糖尿病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。但EPA的不同代謝物是否在介導(dǎo)胰腺細胞的轉(zhuǎn)分化中起作用仍有待確定。已有研究發(fā)現(xiàn)[10],在人和大鼠胰腺中有大量的環(huán)氧二十碳三烯酸(EET)產(chǎn)生,這提供了CYP環(huán)氧合酶可能調(diào)節(jié)β細胞功能的潛在證據(jù)[11]。CYP450家族酶可以分解PUFAs產(chǎn)生環(huán)氧化物,隨后通過可溶性環(huán)氧化物水解酶(sEH)代謝為相應(yīng)的鄰近二醇,二羥基二十碳三烯酸[12]。值得注意的是,源自EPA代謝物代謝的CYP 450途徑的17(18)-EEQ和17(18)-DiHETE在mfat-1小鼠中急劇升高[14]。最近的一項研究還表明,DHA/EPA的膳食補充劑促進了大鼠胰腺中ω-3衍生的環(huán)氧二十碳水體烯酸(EEQ)的合成,例如17(18)-EEQ[14]。

本研究專注于 ω-3 PUFAs 飲食干預(yù)促進T1DM小鼠血糖和胰島素分泌正常化的能力,進一步探討了EPA代謝物,特別是來自CYP途徑17(18)-EEQ和17(18)-DiHETE的代謝物,在促進胰島α細胞向β細胞反式分化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 SPF級雄性C57BL/6J小鼠(7周)購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司。用于α細胞譜系示蹤的GCGicre小鼠從caygen(B6; 129S-Gcgtm1.1(icre)Gkg/J(The Jackson laboratory stock #030663)購買,并與從上海南方模式生物科技股份有限公司購買的Rosa26tdTomato(B6;Cg-Gt (ROSA) 26Sortm9 (CAG-tdTomato) Hze/J (The Jackson laboratorystock #007909)雜交[15]。實驗小鼠均飼養(yǎng)于華南理工大學(xué)大學(xué)城校區(qū)SPF級實驗動物中心,使用許可證號:SYXK(粵)2017-0178。研究方案獲得華南理工大學(xué)動物實驗倫理委員會批準。

1.1.2主要試劑 STZ(S0130)和鼠抗glucagon(G2654)單克隆抗體購自 Sigma公司;兔抗insulin(4590s)單克隆抗體、兔抗Alexa Flour 488(4412s)熒光二抗和鼠抗Alexa Flour 555(4409s)熒光二抗均購自Cell Signal Technology公司;97%EPA乙酯(批號:02200201)購自成都國為生物醫(yī)藥有限公司;75%魚油(EPA ∶DHA=25% ∶50%)購自上海賀普實業(yè)有限公司;小鼠胰島素ELISA試劑盒(90080)購自Crystal Chem公司。

1.1.3儀器 氣相色譜儀(gas chromatography,GC,美國Agilent);激光共聚焦(德國 Zeiss);酶標儀(瑞士Tecan);低溫離心機(美國Thermo);石蠟包埋機(德國SLEE);冷凍臺(中威電子儀器有限公司);石蠟切片機(美國Thermo)。

1.2 方法

1.2.1T1DM小鼠模型的建立與分組 7周齡野生型小鼠,腹腔注射溶于無菌檸檬酸緩沖液(pH 4.5,0.05 mmol·L-1檸檬酸鈉)的STZ,劑量為60 mg·kg-1,連續(xù)給藥5 d。1周后尾靜脈血糖連續(xù)2周檢測高于11.1 mmol·L-1確認為糖尿病小鼠模型。隨后進行以下實驗分組:STZ組、NC組(只注射檸檬酸緩沖液)、EPA組、魚油組(Fish oil)。

1.2.2ELISA法檢測小鼠血清中胰島素水平 糖耐受實驗過程中分別在0、30、60和90 min取小鼠尾靜脈血,分離血清,按照小鼠胰島素ELISA試劑盒說明書檢測糖耐受過程中各時間點小鼠胰島素水平。

1.2.3小鼠胰島提取及培養(yǎng) 腹腔注射2.5%阿佛丁麻醉安樂死小鼠,向胰腺注射預(yù)冷的膠原酶P(1 g·L-1)(羅氏,11249002001,瑞士)。在38 °C下消化10 min,加入STOP溶液(含有10%胎牛血清的RPMI 1640),離心2 min(300×g)。將沉淀重懸于10 mL室溫Hiatopaque 1100(Hiatopaque 1077和Hiatopaque1119 1 ∶1混合),再加入10 mL RPMI 1640,隨后以離心20 min(900×g),收集組織和培養(yǎng)基界面的胰島。胰島在含有 10% 胎牛血清的RPMI 1640中培養(yǎng)(Gibco,美國),加入100 kU·L-1青霉素和 100 μg·L-1鏈霉素(Hyclone,美國)[16]。

1.2.4細胞培養(yǎng) 利用小鼠胰島α細胞系αTC1進行體外培養(yǎng)。在細胞培養(yǎng)基中分別加入0.3 μmol·L-117(18)-EEQ和0.3 μ mol·L-117(18)-DiHETE,對照組加入相應(yīng)濃度的酒精(EtOH),即分為EtOH組、17(18)-EEQ組、17(18)-DiHETE組。培養(yǎng)48 h之后,經(jīng)過固定,利用熒光染色標記胰島素(insulin)和胰高血糖素(glucagon),并使用熒光共聚焦顯微鏡觀察記錄。

1.2.5免疫熒光法檢測細胞和小鼠胰腺組織中insulin與glucagon表達水平 將細胞系以5×105·L-1的密度接種,EPA代謝產(chǎn)物處理后,PBS洗去殘留培養(yǎng)基,4%多聚甲醛固定30 min,PBS清洗后用1 ∶1 000的Triton-100室溫下穿透20 min,清洗后用1%牛血清白蛋白室溫下封閉1 h,吸去封閉液,加入一抗(1 ∶100 兔抗insulin,1 ∶1 000鼠抗glucagon)4 ℃孵育過夜,PBS清洗3次后,加入二抗(1 ∶1 000兔抗Alexa Flour 488,1 ∶1 000鼠抗Alexa Flour 555),室溫避光孵育1 h,PBS清洗后滴加DAPI室溫避光孵育5 min,PBS清洗,滴加抗熒光淬滅封片劑,在熒光顯微鏡下拍攝。

1.2.6脂肪酸的分離提取 將小鼠胰腺組織研磨后置于玻璃管中,加入4 mL甲醇(美國TEDIA,),2 mL氯仿(TEDIA)和1.5 mL水(TEDIA),渦旋;室溫靜置15 min;離心30 min(16 ℃,1 500×g);吸取下層液體轉(zhuǎn)移至新的玻璃管中;氮吹儀吹干后加入1.5 mL 三氟化硼(上海阿拉丁),90 ℃水浴中孵育30 min;隨后,室溫靜置10 min;加入4 mL戊烷(美國TEDIA),1.5 mL水,渦旋;離心2 min(16 ℃,1 500×g);轉(zhuǎn)移上層液體至新的玻璃管中,放置于氮吹儀吹干,100 μL庚烷,渦旋混勻;混樣品使用GC氣相色譜儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 ω-3 PUFAs飲食干預(yù)對T1DM小鼠隨機血糖和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的影響結(jié)果顯示,與NC組相比,STZ組小鼠隨機血糖水平明顯升高,且隨著造模時間的延長,血糖水平持續(xù)升高;而給予EPA和Fish oil飲食干預(yù)后小鼠血糖水平明顯降低(Fig 1A),表明外源性ω-3 PUFAs對T1DM小鼠有明顯的治療作用。進一步通過葡萄糖耐量試驗(injection glucose tolerance tests,IGTT)檢測ω-3 PUFAs飲食干預(yù)對T1DM小鼠葡萄糖穩(wěn)態(tài)的影響,STZ給藥后第13周,分別向各組小鼠腹腔注射葡萄糖,監(jiān)測血糖水平。結(jié)果顯示,注射葡萄糖后各組小鼠血糖開始升高,從第15 min開始,EPA組和Fish oil組小鼠血糖明顯低于STZ組(Fig 1B),且兩組的曲線下面積(area under the curve,AUC)明顯小于STZ組,雖然Fish oil組和EPA組隨機血糖沒有明顯差異,但是EPA組相較于Fish oil組隨機血糖有下降趨勢,且EPA組的AUC明顯低于Fish oil組,說明EPA在小鼠血糖的過程中可能起著更重要的作用,此結(jié)果也有待進一步的研究。以上結(jié)果顯示ω-3 PUFAs明顯改善T1DM小鼠對葡萄糖的吸收與利用,降低血糖總量(Fig 1C)。此外,無論是空腹狀態(tài),還是給予葡萄糖刺激,EPA組和Fish oil組小鼠血清胰島素分泌水平均明顯高于STZ組(Fig 1D),表明ω-3 PUFAs明顯改善T1DM小鼠胰島β細胞的胰島素分泌功能。

2.2 ω-3 PUFAs飲食干預(yù)對T1DM小鼠胰腺中PUFAs含量和比例的影響利用氣相色譜檢測各組小鼠胰腺中各種PUFAs含量,結(jié)果如Tab 1所示,與STZ組相比,EPA組和Fish oil組小鼠胰腺組織中α-LA、EPA以及C22:5含量均明顯增加(P<0.01);此外,EPA和 Fish oil干預(yù)明顯降低胰腺組織中ω-6/ω-3 PUFAs的比例,為進一步探究ω-3 PUFAs防治T1DM的作用及其內(nèi)在機制奠定了基礎(chǔ)。

2.3 ω-3 PUFAs飲食干預(yù)對T1DM小鼠胰島β細胞再生的影響為進一步探究ω-3 PUFAs飲食干預(yù)改善T1DM小鼠隨機血糖和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的內(nèi)在機制,利用免疫熒光技術(shù)觀察各組小鼠胰島分泌胰島素與胰高血糖素功能的變化。結(jié)果顯示,與STZ組相比,EPA組和Fish oil組小鼠部分胰島細胞恢復(fù)了分泌胰島素的功能,且存在可同時分泌胰島素和胰高血糖素的細胞(Fig 2),表明ω-3 PUFAs飲食干預(yù)可促進胰島α細胞轉(zhuǎn)分化為β細胞,進而維持T1DM小鼠正常的血糖濃度以及糖代謝水平。

Tab 1 Analysis of ω-3 PUFAs and ω-6 PUFAs composition and rations in pancreatic samples of mice n=5)

Fig 1 ω-3 PUFAs normalized glucose metabolism in T1DM mice

2.4 tdTomato熒光蛋白特異性標記胰島α細胞模型鼠的鑒定將GCGicre和R26TdTomato小鼠雜交,得到tdTomato熒光蛋白特異性標記胰島α細胞的小鼠[16],剪取子代小鼠的腳趾提取DNA,通過聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)對小鼠基因型進行鑒定,并區(qū)分野生型和GCGicre;R26TdTomato小鼠(Fig 3)。并通過qRT-PCR檢測胰島α細胞熒光標記小鼠的拷貝數(shù),挑選高拷貝的熒光標記小鼠進行后續(xù)實驗。

2.5 EPA代謝產(chǎn)物對胰島細胞胰島素分泌的影響提取GCGicre;R26TdTomato小鼠原代胰島細胞,培養(yǎng)胰島αTC1細胞系細胞,觀察ω-3 PUFAs體外條件下對胰島細胞功能的影響。結(jié)果顯示,與單獨STZ處理組相比,加入EPA代謝產(chǎn)物17(18)-EEQ或17(18)-DiHETE處理48 h后,兩組小鼠原代胰島細胞均可產(chǎn)生胰島素(Fig 4),并且出現(xiàn)tdTomato熒光蛋白與胰島素共定位的現(xiàn)象;同樣,17(18)-EEQ或17(18)-DiHETE干預(yù)可引起胰島αTC1細胞系細胞分泌胰島素(Fig 5),表明EPA代謝產(chǎn)物在體外培養(yǎng)條件下可促進小鼠原代胰島α細胞和αTC1細胞系細胞分泌胰島素。

3 討論

盡管T1DM的發(fā)病率和患病率存在很大地理差異,但仍然是很多國家中影響兒童和青少年健康的嚴重慢性病之一。β細胞的增殖發(fā)生在人類發(fā)育的早期,在成年人中幾乎退化到檢測不到的水平[17]。近年來,多項研究探索替代療法在T1DM治療中的應(yīng)用,嘗試應(yīng)用干細胞、前體或分化細胞代替惡化的胰島β細胞,并在體外模擬胚胎β細胞發(fā)育領(lǐng)域取得了重大進展,但仍需進一步分析β細胞發(fā)生和發(fā)育的遺傳程序,進而能夠產(chǎn)生完全分化的β細胞。基于此,產(chǎn)生胰高血糖素的α細胞及其轉(zhuǎn)分化為β樣細胞的能力在T1DM治療領(lǐng)域具有很大的開發(fā)應(yīng)用前景。

團隊前期研究表明,營養(yǎng)干預(yù)或基因療法(通過mfat-1基因)增加體內(nèi)ω-3 PUFAs水平可以預(yù)防和逆轉(zhuǎn)由Th1、Th2、Th17和Treg亞群失衡引起的自身免疫和糖尿病的發(fā)生,并存在胰腺α細胞轉(zhuǎn)分化為胰島素分泌細胞的跡象[8]。研究已證實,T1DM患者胰腺中仍有大量具有生理功能的α細胞[7],因此,α細胞可能在修復(fù)糖尿病患者β細胞損傷方面有巨大的潛在作用。本研究發(fā)現(xiàn),EPA和魚油飲食干預(yù)后T1DM小鼠胰腺中,以及EPA代謝產(chǎn)物作用后小鼠原代胰島細胞或αTC1細胞中均出現(xiàn)明顯的胰高血糖素與胰島素共定位,表明ω-3 PUFAs飲食干預(yù)可促進胰島α細胞向β細胞的轉(zhuǎn)分化,從而使一些α細胞顯示出“雙重激素”狀態(tài),分泌胰島素,增強機體對葡萄糖的吸收和利用,改善T1DM小鼠血糖水平和葡萄糖穩(wěn)態(tài)。

Fig 2 Islet and β cell regeneration and colocalization of α cells and β cells in diabetic mice treated with ω-3 PUFAs

Fig 3 Genotype of tdTOMATO fluorescent protein specifically labels produced in pancreatic α cell mice

綜上所述,本研究首次證明ω-3 PUFAs飲食干預(yù)可通過促進胰腺α細胞向β細胞的轉(zhuǎn)分化緩解STZ誘導(dǎo)的高血糖,尤其值得注意的是,EPA代謝物在胰島不同細胞的轉(zhuǎn)分化過程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果為T1DM的臨床治療提供了一種新的潛在干預(yù)策略。

Fig 5 Confocal images of αTC1 (insulin, green; glucagon, red; DAPI, blue)