薄荷醇對低壓低氧誘導小鼠肺動脈高壓的作用及機制研究

王武帥,胡 陶,楊 耀,何瀅蓉1, ,楊 曦1, ,段清華1, ,杜 萱,4,王 強1,

(1. 西南醫科大學臨床醫學院心血管內科,四川 瀘州 646000; 2. 西部戰區總醫院心血管內科, 四川 成都 610083;3. 西部戰區總醫院藥劑科,四川 成都 610083;4. 成都醫學院,四川 成都 610500)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension, PAH)是由多種原因引起的肺動脈壓異常升高的一大類疾病,其血流動力學診斷標準為:海平面靜息狀態下,右心導管檢測肺動脈平均壓≥25mmHg[1]。根據最新歐洲指南,PAH分為五大類,低氧性肺動脈高壓(hypoxia-induced pulmonary hypertension, HPH)屬于第三類,由于機體慢性缺氧,造成肺血管收縮和重構,肺循環阻力增加,而導致肺動脈高壓,引起右心室肥大,右心功能不全,最終發展為右心功能衰竭,造成患者死亡[2]。我國有大量人群長期居住在青藏高原地區,低氧性肺動脈高壓的患病率居高不下,由此造成的心力衰竭是高原地區人群死亡的重要原因,因此,探討低氧性肺動脈高壓的發生機理和尋找新的治療手段是當前亟待解決的重要問題[3-4]。

瞬時受體電位通道M8(transient receptor potential melastatin 8, TRPM8)是一種陽離子通道,可以被薄荷醇和寒涼性藥物(如:樟腦、桉油素和icilin等)激活,在心血管及代謝功能調控中發揮重要作用[5]。既往發現TRPM8通過調控血管平滑肌細胞RhoA/ROCK-2激酶活性和線粒體氧化應激舒張血管,降低外周血壓[6-7]。然而,TRPM8在肺血管和低氧性肺動脈高壓中的作用尚不完全清楚。本實驗擬通過構建野生型及TRPM8基因敲除(TRPM8-/-)小鼠低壓低氧性肺動脈高壓模型,研究薄荷醇通過激活TRPM8對小鼠低壓低氧性肺動脈高壓的作用,觀察薄荷醇對肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs)增殖和遷移能力的影響,并初步探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級C57小鼠,雄性,10～12周齡,20～25 g,40 只,購自于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,許可證號:SCXK(湘)2019-0004,TRPM8基因敲除(TRPM8-/-)小鼠40只,10～12周齡,體質量20～25 g,購自美國Jackson實驗室,嚴格按照實驗動物3R原則給予人道的關懷,該實驗經西部戰區總醫院倫理委員會批準通過(批件編號:2022EC2-ky038)。

1.2 主要材料薄荷醇(HY-75161)購于美國MedChemexpress生物科技公司,GAPDH(2118S)購于美國 Cell Signaling Technology 公司。PCNA抗體(60097-1-Ig)、KLF4抗體(11880-1-AP)、山羊抗兔Ⅱ抗(SA00001-2)購自中國武漢三鷹生物技術有限公司;BCA蛋白定量(PC0020)及全蛋白提取試劑盒(BC3710)均購于北京索萊寶生物有限公司;多道生理記錄儀及壓力傳感器購自于成都儀器設備有限公司;蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(G1120)購自北京索萊寶科技有限公司;DMEM高糖培養基(SH302343.01)、胰蛋白酶(SH30042.01)購于美國HyClone公司;胎牛血清(10091-148)購自美國Gibco公司。

1.3 主要方法

1.3.1動物實驗分組及處理 將40 只SPF級10～12周齡野生型C57小鼠及TRPM8基因敲除(TRPM8-/-)小鼠隨機分配到對照組(Control)、薄荷醇組(Menthol, Ment)、低壓低氧組(Hypobaric hypoxia)、低壓低氧+薄荷醇組(Hypobaric hypoxia+Ment);所有小鼠均在12 ∶12小時明暗循環,溫度(22～24) ℃,濕度為50%～60%的環境中飼養,并予以充足的水和食物,喂養1周。對照組適應性喂養1周后,繼續常氧常溫環境下喂養6周;薄荷醇組適應性喂養1周后,予以薄荷醇飼料(0.5%薄荷醇)在常氧常溫環境下喂養6周;低壓低氧組適應性喂養1周后,予以放入低壓低氧環境模擬艙中飼養6周,建立低壓低氧下誘導肺動脈高壓模型;低壓低氧+薄荷醇組適應性喂養1周后,連續在低壓低氧環境模擬艙中以含0.5%的薄荷醇飼料喂養6周[8]。

1.3.2低壓低氧暴露條件及模型建立 低壓低氧環境模擬艙的參數設定模擬海拔高度為5500 m,艙內壓力維持達47～48 kpa,溫度為(20～22) ℃,濕度為22%～23%/RH,相對氧濃度為10%～11%。將低壓低氧組及低壓低氧+薄荷醇組放入環境模擬艙中,確保水及飼料充足,環境模擬艙運行時間全天24 h,更換水、飼料及墊料的頻次為3～4 d/次,每次開艙時間為30 min。

1.3.3小動物超聲檢測肺動脈血流頻譜 使用異氟烷吸入麻醉,控制小鼠心率在400～650次/分,予以固定在操作臺,使用超聲探頭記錄肺動脈切面,多普勒超聲測量肺動脈血流頻譜,測量肺動脈加速時間(pulmonary acceleration time, PAT)和肺動脈射血時間(pulmonary ejection time, PET),計算PAT/PET比值,評估各組肺動脈壓力變化情況。

1.3.4肺動脈壓力及右心室指數測定 6周后,腹腔注射4%水合氯醛麻醉并固定小鼠,分離右頸外靜脈,手術線阻塞血回流,通過右頸外靜脈切口緩慢插入連接生物信號采集系統的聚乙烯導管,測量右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure,RVSP),采用RVSP反映肺動脈壓力;測壓結束后,開胸取肺組織,用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)沖洗干凈,將部分肺組織固定在4%多聚甲醛中供后續實驗,其余組織儲存在液氮罐中備用。首先沿室間隔將心室分離右心室(right ventricle,RV)和左心室加室間隔 (left ventricle+septum,LV+S),濾紙吸去組織上多余水分,使用微量秤精準稱量組織干重,計算右心室肥厚指數(right ventricular hypertrophy index, RVHI),RVHI=RV/(LV+S) 。

1.3.5肺組織HE染色 將固定于4%多聚甲醛的肺組織依次進行脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟,進行肺組織HE染色,觀察各組肺血管的病理變化,并使用OLYMPUS OlyVIA采集圖像和計算肺動脈血管壁面積/血管總面積的百分比(WA /TA) 和血管壁直徑/血管總直徑(WT /TT)。

1.3.6蛋白質印跡分析 取各組肺組織100 mg,各滴加裂解緩沖液1 mL,碾磨充分后繼續在冰浴中裂解30 min后移置于EP管,12 000×g4 ℃環境下離心30 min,并對各組樣本進行蛋白定量。將蛋白上樣于電泳道中,通過10% SDS-PAGE分離蛋白, PVDF轉膜,用濃度為5%的BSA進行封閉1 h,將PVDF膜與GAPDH(1 ∶20 000)、PCNA(1 ∶1 000)、KLF4(1 ∶4 000)一抗稀釋液充分結合,4 ℃過夜。24 h后復溫30 min,TBST緩沖液洗膜30 min,二抗孵育1 h,再次TBST緩沖液洗膜30 min,顯影并采圖,ImageJ進行分析。

1.3.7細胞培養及分組 將肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)分為常氧對照組(21%氧濃度,Control)、常氧+薄荷醇組(薄荷醇100 μmol·L-1,Ment)、低氧組(3%氧濃度,Hypoxia)、低氧+薄荷醇組(3%氧濃度+薄荷醇100 μ mol·L-1,Hypoxia+Ment),于37 ℃、5% CO2環境中培養。每間隔兩天進行換液,待細胞密度達到90%左右,加入胰酶消化細胞,按照1 ∶3傳代,分別在低氧環境及常氧環境中誘導小鼠PASMCs增殖和遷移。

1.3.8CCK-8實驗 參照課題組前期方法[9],采用CCK-8檢測薄荷醇對PASMCs增殖能力的影響。待細胞密度達到 80%～90%以上后將其消化,每組6個復孔,將細胞胞懸液以1× 108·L-1接種于 96 孔板中,按條件分別放置于常氧或低氧培養箱中培養 24 h 后,每孔加入 10 μL CCK-8 溶液,在37℃下避光孵育 2 h,將處理好的培養板置于酶標儀中,在 450 nm 波長處測定吸光度值(A),取均值。

1.3.9細胞劃痕實驗 參照課題組前期方法[9],采用劃痕實驗測量薄荷醇對PASMCs遷移能力的影響。將處理后的PASMCs分別接種于 6 孔板中(每孔細胞數目約 1×105個),當細胞密度增至90% 左右進行劃痕實驗,并記錄完成劃痕實驗后0 h的劃痕圖。加入無血清培養液,按照分組要求給予處理,置于常氧或低氧培養箱中孵育,并采集劃痕后24 h圖片。

2 結果

2.1 薄荷醇對低壓低氧誘導小鼠肺動脈血流頻譜的影響多普勒心臟超聲檢測肺動脈血流頻譜,計算PAT和PAT/PET,反映肺動脈壓力變化。經過低壓低氧環境誘導后,小鼠的肺動脈加速時間(PAT)和PAT/PET比值明顯降低(P<0.01,Fig 1),證實低壓低氧誘導小鼠肺動脈高壓建模成功。在野生型小鼠中,與低壓低氧組相比,低壓低氧+薄荷醇組小鼠PAT、PAT/PET明顯升高(P<0.05,Fig 1A,C,D);而在TRPM8-/-小鼠中,低壓低氧+薄荷醇組小鼠PAT、PAT/PET未見明顯變化(P>0.05,Fig 1B,C,D)。提示薄荷醇可能通過TRPM8改善肺動脈壓力。

2.2 薄荷醇對小鼠肺動脈高壓和右心室肥厚的影響本實驗通過右心室收縮壓(RVSP)反映肺動脈壓力。經過低壓低氧環境誘導后,小鼠的右心室收縮壓(RVSP)和右心室肥厚指數(RVHI)明顯增加(P<0.01,Fig 2),證實低壓低氧誘導小鼠肺動脈高壓建模成功。在野生型小鼠中,與低壓低氧組相比,低壓低氧+薄荷醇組小鼠RVSP和RVHI顯著降低(P<0.05,Fig 2);而在TRPM8-/-小鼠中,低壓低氧+薄荷醇組小鼠RVSP和RVHI未見明顯變化(P>0.05,Fig 2)。提示薄荷醇可能通過TRPM8降低小鼠肺動脈壓力和減輕右心室肥厚。

2.3 薄荷醇對低壓低氧誘導肺小動脈重構的影響經過低壓低氧環境誘導后,小鼠的肺小動脈壁增厚,形態不均勻,管腔狹窄(P<0.01,Fig 3)。在野生型小鼠中,與低壓低氧組相比,低壓低氧+薄荷醇組小鼠肺小動脈壁增厚及管腔狹窄程度改善,肺血管病理損傷較低壓低氧組明顯減輕(P<0.05,Fig 3);而在TRPM8-/-小鼠中,低壓低氧+薄荷醇組小鼠肺小動脈壁增厚及管腔狹窄無明顯改善,肺血管病理損傷較低壓低氧組無明顯減輕(P>0.05,Fig 3)。提示薄荷醇可能通過TRPM8減輕小鼠肺小動脈管壁增厚及管腔狹窄。

2.4 薄荷醇對小鼠KLF4和PCNA蛋白表達的影響經過低壓低氧環境誘導后,小鼠肺組織中KLF4表達明顯降低(P<0.01),PCNA表達明顯升高(P<0.01,Fig 4A,B,D)。在野生型小鼠中,與低壓低氧組相比,低壓低氧+薄荷醇組KLF4明顯升高(P<0.05,Fig 4A,C),PCNA顯著下降(P<0.05,Fig 4A,D);而在TRPM8-/-小鼠中,低壓低氧+薄荷醇組KLF4及PCNA無明顯變化(P>0.05,Fig 4B-D)。提示KLF4可能參與薄荷醇激活TRPM8調節肺血管重構的過程。

2.5 薄荷醇對PASMCs增殖能力的影響經過低氧環境誘導后,分別檢測肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)在0、6、12、24、48 h時間段的細胞增殖和活力,結果顯示在低氧24 h內,PASMCs細胞活力隨時間梯度逐漸增加,在24 hPASMCs細胞活力最強,在低氧處理48 h后,PASMCs細胞出現死亡,細胞活力下降;后續實驗選擇24 h為實驗節點。與對照組相比,在低氧環境誘導24 h后,PASMCs增殖能力增加(P<0.01,Fig 5),薄荷醇干預后,PASMCs增殖能力減弱(P<0.01,Fig 5)。提示薄荷醇可抑制PASMCs增殖。

Fig 1 Pulmonary arterial hypertension estimated by doppler echocardiography n=10)

2.6 薄荷醇對PASMCs遷移能力的影響在低氧環境誘導后,低氧組細胞劃痕愈合率顯著加快(P<0.01,Fig 6),薄荷醇干預后,與低氧組相比,低氧+薄荷醇組的劃痕愈合率明顯下降(P<0.05,Fig 6)。提示薄荷醇可抑制PASMCs遷移。

3 討論

低氧性肺動脈高壓(HPH)常見原因包括:高原慢性缺氧、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、間質性肺疾病和睡眠呼吸障礙等。我國西部有近千萬人長期居住在高原地區,近年來隨著青藏鐵路開通、西部建設和國防安全的需要,大量人群移居高原,高原低氧性肺動脈高壓的發病率逐年升高,如不及時干預,將進展為高原性心臟病,導致右心衰竭和死亡[3]。肺動脈高壓的防治一直是研究的熱點和難點,近期研究發現:在野百合堿(monocrotaline, MCT)誘導的肺動脈高壓大鼠中,薄荷醇可降低肺動脈壓力和減輕右心室肥厚,但具體機制有待探索[10]。瞬時受體電位通道家族(transient receptor potential, TRP)是一類非電壓依賴性陽離子通道,參與調控多種生理功能[11]。瞬時受體電位通道M8(TRPM8)是TRP家族成員,在心臟、血管平滑肌和內皮等廣泛表達,也存在于質膜、高爾基體和肌漿網,課題組和國內外前期研究發現,TRPM8在心血管及代謝功能調控中發揮重要調控作用,如:高血壓、心肌梗死后炎癥反應和心肌重構[5-8]。研究發現[12],TRPM8基因的rs9789675、rs9789398和rs1004478位點多態性與COPD患者的肺動脈高壓密切相關,TRPM8可能參與低氧性肺動脈高壓的發生發展。本實驗中為更好模擬高原缺氧,我們選用低壓低氧誘導小鼠肺動脈高壓模型,在野生型小鼠中,薄荷醇增加肺動脈加速時間(PAT)和PAT/PET比值,降低小鼠的肺動脈壓力和右心室肥厚指數;而在TRPM8-/-小鼠中,薄荷醇對小鼠的PAT、PAT/PET、肺動脈壓力和右心室肥厚指數未見明顯影響,提示薄荷醇可能通過TRPM8改善低壓低氧誘導的小鼠肺動脈高壓和右心室肥厚。

肺血管收縮和肺血管重構是低氧性肺動脈高壓的主要病理生理機制,目前治療藥物(磷酸二酯酶5抑制劑和內皮素受體拮抗劑等)主要通過舒張肺血管降低肺動脈壓。前期研究發現[13-14],MCT誘導的肺動脈高壓大鼠肺血管中TRPM8表達降低;TRPM8激活后調節SOCE鈣通道復合體介導的鈣離子內流,從而舒張肺血管和降低肺動脈壓力。最新研究提示[15],有效改善和逆轉肺血管重構可能是治療

Fig 2 Dietary menthol attenuated pulmonary hypertension and RV hypertrophy via n=10)

Fig 3 Dietary menthol ameliorated pulmonary arterioles remodeling via TRPM8 n=10)

肺動脈高壓的關鍵,其中肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)的過度增殖和遷移是肺血管重構的重要環節。本實驗中,我們發現薄荷醇顯著降低PASMCs的增殖能力和遷移能力;在野生型小鼠中,薄荷醇干預后肺小動脈壁增厚及管腔狹窄程度改善,肺血管病理損傷較明顯減輕,肺組織中增殖細胞核抗原(PCNA)表達降低;而在TRPM8-/-小鼠中,薄荷醇干預后小鼠肺小動脈壁增厚和管腔狹窄未見明顯改善,肺血管病理損傷無明顯減輕,肺組織中PCNA表達未見差異;以上結果提示薄荷醇可能通過TRPM8抑制PASMCs的過度增殖和遷移,延緩肺血管重構。

Fig 4 Effect of menthol on protein expressions of PCNA and KLF4 in each group n=10)

Fig 5 Effect of menthol on PASMCs proliferation n=3)

Krüppel樣因子4(Kruppel-like factor 4,KLF4)是一種保守且含有鋅指結構域的轉錄因子,表達于人體多種組織,參與細胞生長、增殖和分化等。大量研究證實[16-18],KLF4參與調控低氧性肺動脈高壓的發生發展,KLF4可與p53相互作用誘導細胞周期蛋白p21表達,從而抑制PASMCs增殖;最新研究證實,KLF4還可通過富含半胱氨酸和甘氨酸的蛋白2(Csrp2)、ERK1/2信號途徑和NDRG1/DRP1信號途徑調節PASMCs增殖、遷移和表型轉換。本實驗中,低壓低氧引起小鼠肺組織中KLF4表達減少,在野生型小鼠中,薄荷醇干預后肺組織中KLF4蛋白表達增加、增殖細胞核抗原PCNA蛋白表達降低;而在TRPM8-/-小鼠中,薄荷醇對肺組織中KLF4和PCNA表達未見影響。因此我們推測,薄荷醇可能通過激活TRPM8上調KLF4表達,從而調節PASMCs增殖和遷移能力。

然而,薄荷醇激活TRPM8后如何上調PASMCs中KLF4的表達,以及TRPM8對KLF4的蛋白修飾影響如何,目前尚不清楚,我們將在進一步的實驗中繼續研究。

Fig 6 Effect of menthol on PASMCs migration n=3)

綜上所述,本探究提示TRPM8可能是薄荷醇在肺組織的重要作用靶點,薄荷醇通過激活TRPM8上調KLF4表達,抑制PASMCs增殖和肺血管重構,改善低壓低氧誘導的小鼠肺動脈高壓和右心室肥厚。研究結果為高原低氧性肺動脈高壓的中醫藥治療提供了理論基礎。