豨薟草提取物對腦缺血/再灌注大鼠的神經保護作用

吳慧玲,吳青青,陳景泉,周彬彬,余正雙,楊澤霖,賴文芳,洪桂祝

(福建中醫藥大學藥學院,福建 福州 350122)

腦卒中是嚴重危害健康的重大慢性疾病,分為缺血性和出血性腦卒中,其中缺血性腦卒中占87%[1],是目前研究腦卒中的主要焦點。組織型纖溶酶原激活劑(tPA)是一種溶栓藥物,也是唯一獲得FDA批準的治療缺血性腦卒中的藥物,但tPA治療時間窗窄,超過4.5h后用藥容易產生出血等不良反應。大量腦卒中候選藥物在臨床試驗階段以失敗告終,其主要原因是藥物作用機制單一(主要為神經保護)。研究普遍認為,基于神經保護與抗炎等多重藥理作用的策略進行腦卒中藥物研發,可提高研發成功的機會[2]。傳統中藥具有多成分、多靶點、多通路的協同調控作用,研究傳統中藥對腦卒中的作用,對從傳統中藥寶庫挖掘腦卒中藥物具有重要的實際應用價值。

豨薟草為我國傳統中草藥,味苦性辛寒,歸于肝腎經。《中國藥典》2020版記載,豨薟草的功能主治為“風濕痹痛,筋骨無力,腰膝酸軟,半身不遂”。豨薟草在古代炮制,從事炮制中醫均言要“九蒸九曬”,以治中風,“蜜酒九蒸九曬”治四肢麻痹,腰膝無力[3]。近年來,國內外學者越來越重視對豨薟草的研究,現代藥理學證明,豨薟草對腦卒中、慢性疼痛、痛風性關節炎等疾病具有良好的治療作用[4]。本文主要研究豨薟草提取物對MCAO大鼠的神經保護作用,并探討其作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物上海斯萊克實驗動物公司購入60只SPF級體質量(250～280)g的♂性SD大鼠(合格證號為2015000510392,實驗動物生產許可證號為SCXK(滬)2012-0002)。大鼠在福建中醫藥大學實驗動物中心按SPF級別飼養,在動物實驗開始前需對大鼠進行適應性喂養1周,可自由飲水與進食(動物使用許可證號為SYXK(閩)2014-0005)。

1.2 實驗藥物與主要試劑豨薟草(安國潤德藥業有限公司,C21103106),經福建中醫藥大學中藥鑒定學教研室鑒定;NeuN抗體(ab177487),Cox IV抗體(ab202554)均購于Abcam;Bax抗體(#2772),Bcl-2抗體((#3498)均購于Cell Signaling Technology;β-actin抗體(Beyotime,AF0003);Tunel染色試劑盒(Promega,G3250);尼氏染色液(Leagene,DK0022)。

1.3 實驗儀器YB-6LF型石蠟包埋機、HM325型石蠟切片機(美國Thermo Fisher公司);Mini PROTEAT Tetra型垂直電泳槽、Mini TransBlot型轉印槽、ChemiDocXRS+型化學發光凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司);LSM 880型激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司)。

2 方法

2.1 MCAO模型制備和分組MCAO模型的制備參照課題組前期研究[5],采用線栓法造模,假手術組除不插入線栓外其余操作同模型組。Zea-Longa評分≥2為成模。成模大鼠隨機分為模型(MCAO)組,豨薟草低、中、高劑量(即XXC-L、XXC-M、XXC-H)組,另設假手術(Sham)組,共5組,于MCAO造模2 h后灌胃。

2.2 給藥治療將豨薟草藥材烘干,粉碎,8倍量70%乙醇浸泡2 h,加熱回流提取3次,過濾,減壓濃縮,得豨薟草提取物浸膏(1 g相當于12 g生藥量)[6]。實驗前用0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液分別配制成濃度為0.025 kg·L-1、0.25 kg·L-1、2.5 kg·L-1的溶液。豨薟草給藥劑量參照臨床每日劑量12 g,以人60 kg體質量換算成大鼠每日劑量為1.82 g·kg-1,豨薟草低、中、高劑量組分別以0.1、1、10倍臨床等效劑量給藥,即0.182 g·kg-1、1.82 g·kg-1、18.2 g·kg-1;假手術組和模型組灌服等體積生理鹽水,連續灌胃7天。

2.3 動物取材與前處理大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉,腹主動脈采血。每組6只動物斷頭取腦,分離左右腦,迅速放入液氮中保存,將缺血側左腦腦組織研磨成粉末,分裝備用;每組6只動物心尖剪口,依次滴注生理鹽水和4%多聚甲醛進行固定,取腦后,于4%多聚甲醛中固定24 h,使用腦模具和切片將腦組織均勻分為6片,置于70%乙醇浸泡保存,進行組織脫水、包埋及切片。

2.4 改良神經功能損傷(mNSS)評分各組大鼠分別在1,3,7天采用mNSS法對大鼠運動、感覺、平衡等方面綜合評估,1～6分輕度損傷,7～12分中度損傷,13～18分重度損傷[7]。

2.5 核磁共振成像(MRI)檢測大鼠缺血側腦梗死體積各組大鼠在第7天使用異氟烷麻醉后,至掃描床上仰臥位固定,安裝頭部線圈。7.0T小動物核磁共振成像儀對大鼠腦部冠狀定位掃描,設置T2W1增強系列[8],ImageJ軟件計算大鼠缺血側腦梗死體積。

2.6 Western blot檢測大鼠缺血側腦組織Bax、Bcl-2、NeuN蛋白表達冰盒上提取各組大鼠腦組織總蛋白,經SDS-PAGE分離,轉膜,封閉2 h,一抗4 ℃孵育過夜,TBS清洗,二抗孵育1.5 h,ECL發光液顯色,凝膠成像系統檢測,分析灰度值,以目標蛋白與β-actin的灰度值比值作為目標蛋白的相對量。

2.7 Nissl染色法檢測大鼠缺血側腦組織Nissl陽性細胞數腦切片脫蠟復水后于恒溫箱56 ℃焦油紫染色30 min,酒精燈加熱至冒泡,去離子水洗滌,尼氏分化液分化,無水乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片,顯微鏡下觀察神經元的情況。

2.8 免疫熒光染色法檢測大鼠缺血側腦組織Tunel陽性細胞數及NeuN的表達腦切片脫蠟復水、抗原修復,蛋白酶Κ工作液孵育20 min,PBS清洗,1×平衡液室溫平衡20 min,TdT酶反應液室溫避光孵育1 h,PBS清洗,DAPI染色4 min,PBS清洗,抗淬滅劑封片,激光共聚焦顯微鏡觀察、攝取圖像。陽性細胞百分比/%=陽性細胞數/總細胞×100%。

經過脫蠟復水、抗原修復的腦切片用5%BSA室溫封閉2 h,PBS清洗,NeuN一抗4 ℃孵育過夜,次日室溫放置40 min,PBS清洗,濕盒孵育熒光二抗2 h(之后均需在避光條件下操作),PBS清洗,DAPI染色4 min,PBS清洗,抗淬滅劑封片,在鏡下隨機選取5個視野觀察、拍照,Zen Light軟件進行分析。

2.9 RT-qPCR檢測大鼠缺血側腦組織mRNA表達采用TRIzol法提取總RNA,逆轉錄成cDNA,用RT-qPCR檢測mRNA表達水平,以GAPDH為內參計算2-ΔΔCt值。所用引物參照GenBank中大鼠IL-1β、TNF-α、IL-6引物序列,由上海尚亞生物技術公司提供,詳細信息見Tab 1。

3 結果

3.1 豨薟草提取物降低MCAO大鼠mNSS評分

mNSS評分結果表明,第1 天,MCAO組大鼠評分顯著高于Sham組(P<0.01),提示MCAO模型成功;第3 天,XXC-H組評分低于MCAO組(P<0.05);第7 天,XXC-M和XXC-H組評分顯著低于MCAO組(P<0.01),提示豨薟草提取物能改善MCAO大鼠神經功能損傷(Fig 1)。

Tab 1 Sequence of primers

3.2 豨薟草提取物降低MCAO大鼠缺血側腦梗死體積經干預7天后,MCAO組大鼠缺血側腦組織梗死體積高于Sham組(P<0.01),XXC-M和XXC-H組能顯著降低缺血側腦梗死體積(P<0.01),作用優于XXC-L組,且XXC-M和XXC-H組間無明顯區別,因此選擇XXC-M組作為后續研究的劑量(Fig 2)。

3.3 豨薟草提取物促進MCAO大鼠缺血側腦組織Nissl陽性細胞數經干預7 天后,Sham組大鼠腦組織神經元的尼氏小體表達較多且細胞形態正常;MCAO組大鼠缺血側腦組織神經元的核出現皺縮,尼氏小體表達降低(P<0.01);XXC-M組大鼠缺血側腦組織神經元形態以及尼氏小體數量均有顯著恢復(P<0.01),提示豨薟草提取物能促進MCAO大鼠缺血側腦組織中神經元形態和數量(Fig 3)。

Fig 1 Effect of Herba siegesbeckiae extract on

3.4 豨薟草提取物抑制MCAO大鼠缺血側腦組織神經細胞凋亡經干預7天后,MCAO組大鼠缺血側腦組織皮質細胞凋亡(Tunel)數目高于Sham組(P<0.01);與MCAO組比較,XXC-M組能明顯減少皮質細胞凋亡數目(P<0.01)(Fig 4a)。同時,MCAO組大鼠缺血側腦組織Bax增加、Bcl-2降低(P<0.05,P<0.01);XXC-M組能明顯逆轉Bax和Bcl-2表達(P<0.01)(Fig 4b),提示豨薟草提取物能抑制MCAO大鼠缺血側腦組織神經細胞凋亡。

Fig 2 Effect of Herba siegesbeckiae extract on volume of ischemic cerebral infarction in MCAO

Fig 3 Effect of Herba siegesbeckiae extract on number of Nissl positive cells in ischemic brain tissue of MCAO

3.5 豨薟草提取物促進MCAO大鼠缺血側腦組織神經元核抗原NeuN表達經干預7天后,Sham組大鼠腦組織皮層NeuN陽性細胞較多;MCAO組大鼠缺血側腦組織NeuN陽性細胞顯著減少(P<0.01);與MCAO組比較,XXC-M組NeuN陽性細胞顯著增加(P<0.01)(Fig 5a)。同時,MCAO組大鼠缺血側NeuN蛋白顯著低于Sham組(P<0.01);與MCAO組比較,XXC-M組NeuN蛋白顯著升高(P<0.01)(Fig 5b),提示豨薟草提取物能改善MCAO大鼠神經元損傷,發揮神經保護作用。

Fig 4 Effect of Herba siegesbeckiae extract on neuronal apoptosis in ischemic brain tissue of MCAO

Fig 5 Effect of Herba siegesbeckiae extract on expression of NeuN in ischemic brain tissue of MCAO

3.6 豨薟草提取物抑制MCAO大鼠缺血側腦組織炎癥因子表達經干預7天后,MCAO組大鼠缺血側腦組織IL-1β、TNF-α、IL-6mRNA表達水平顯著高于Sham組(P<0.01);與MCAO組比較,XXC-M組能降低以上mRNA表達(P<0.01),提示豨薟草提取物能抑制MCAO大鼠缺血側腦組織炎癥因子表達(Fig 6)。

Fig 6 Effect of Herba siegesbeckiae extract on expression of IL-1β,TNF-α and IL-6 mRNA in ischemic brain tissue

4 討論

缺血性中風是一種復雜的腦部疾病,可通過破壞大腦內穩態導致嚴重的神經損傷。MCAO模型是最接近模擬人類缺血性中風的模型之一,因此本研究采用該模型來探討豨薟草提取物對MCAO大鼠的神經保護作用。在實驗過程中,首先采用mNSS評估神經功能損傷程度,MRI測腦梗死體積,研究結果表明,豨薟草提取物干預7天,顯著改善MCAO大鼠mNSS評分,降低梗死灶。同時觀察到中劑量組與高劑量組在藥效上沒有明顯差異,因此選擇中劑量作為后續實驗研究。

腦缺血后,神經元的存活在功能恢復中起著重要作用,NeuN是成熟神經元標記物,常被用于直接評估神經元的死亡或丟失以及成為定量治療效果的可靠標志物[9]。通過免疫熒光和Western blot結果發現,MCAO大鼠缺血側腦組織NeuN表達受抑制,經豨薟草提取物干預7天后,能夠改善MCAO大鼠NeuN表達,表明豨薟草提取物可以減輕MCAO大鼠的神經元損傷。為進一步探討豨薟草提取物發揮神經保護的作用機制,我們檢測了MCAO模型大鼠缺血側腦組織Bcl-2和Bax的表達情況。細胞凋亡是腦缺血神經元損傷過程的關鍵細胞事件,其中Bcl-2家族的抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax是細胞凋亡途徑的重要信號分子,通過調控線粒體功能障礙調節細胞凋亡[10]。研究結果發現,經豨薟草提取物干預7天后,大鼠缺血側腦組織皮質細胞凋亡數目減少,結合Western blot結果,豨薟草提取物能抑制Bax,促進Bcl-2,表明豨薟草提取物對腦缺血/再灌注后誘發的缺血側腦組織神經細胞凋亡有明顯的抑制作用。腦內炎癥是腦缺血后繼發性損傷機制之一,炎癥反應在腦卒中急性期加快缺血性損傷的形成并影響神經元死亡和神經組織再生[11]。本研究發現豨薟草提取物能顯著降低MCAO大鼠缺血側腦組織IL-1β、TNF-α、IL-6mRNA表達,提示豨薟草提取物能抑制MCAO炎癥因子釋放,改善缺血性腦損傷。

綜上所述,豨薟草提取物能降低MCAO大鼠腦梗死體積,改善神經功能損傷,抑制神經細胞凋亡,減輕腦內炎癥反應,對MCAO大鼠具有神經保護作用。