基于TLR4/NF-κB信號通路探究紅花黃色素對不同月齡APP/PS1小鼠學習記憶能力的影響

張夢玉,鄭艷杰,葉紅霞,王春輝,胡艷麗

(石河子大學藥學院/新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室,新疆 石河子 832000)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種神經退行性疾病,其關鍵的病理變化包括β-淀粉樣蛋白的沉積(β-amyloid precursor protein, Aβ)和神經原纖維纏結(neurofifibrillary tangles, NFTs)[1]。此外,神經炎癥也是AD的早期病理表現,炎癥反應會加重疾病進展,而抑制炎癥反應可能降低AD的風險[2]。

小膠質細胞(microglia, MG)是參與調節慢性神經炎癥反應的重要膠質細胞之一。活化的MG在一定程度上具有保護作用,可降低AD的發病率。活化的M1型MG可誘導促炎因子和趨化因子的表達,引起炎癥反應[3]。M2型MG有助于吞噬細胞碎片,促進組織修復,并通過釋放抑炎因子發揮抗炎作用[4]。因此,促使MG由M1型向M2型轉變被認為是神經炎性疾病的潛在治療方法。TLR4主要在MG中表達,是與M1型MG激活相關的關鍵轉錄因子,能夠誘導促炎細胞因子的轉錄和釋放。研究表明抑制TLR4/NF-κB信號通路的激活可減輕神經炎癥,改善癡呆小鼠的認知損傷[5]。

紅花黃色素(safflower yellow, SY)是中藥紅花水溶性提取物的主要活性成分。研究證明,SY通過抑制炎癥反應和氧化應激來保護心血管系統和神經系統[6]。研究發現,SY可以改善多種AD模型動物的學習和記憶能力[7-8]。然而,SY對不同疾病時期APP/PS1小鼠學習記憶的影響,以及是否通過TLR4/NF-κB通路調節MG表型的轉化發揮神經保護作用有待研究。

本研究評估了SY對不同月齡APP/PS1小鼠認知障礙的影響及對MG M1M2極化和TLR4/NF-κB信號通路的表達,闡明了SY治療AD的最佳治療期及其作用機制,為SY治療AD不同疾病階段提供依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑紅花黃色素(云南通海楊氏天然產物公司,(E=100色價,主要成分紅花黃A和紅花黃B,總色素含量 >90%,批號:YSCMY2020 0710);Arginase-1兔多克隆抗體(Santa);iNOS兔多克隆抗體(CST);小鼠β-actin單克隆抗體(中杉金橋);TREM2兔多克隆抗體(Bioss);TLR4鼠單克隆抗體(Santa);p-NF-κB p65兔多克隆抗體(Affinity);NF-κB p65兔多克隆抗體(Affinity);蛋白酶抑制劑(默克公司);BCA試劑盒(上海碧云天);PVDF膜(Amersham);ECL發光試劑盒(Affinity);IL-6試劑盒(Mlbio);TGF-β1試劑盒(Mlbio)。

精密稱取15 mg SY溶于5 mL無菌氯化鈉注射液中,配制成藥物濃度為3 g·L-1的SY溶液。

1.2 儀器DMS-2型Morris 水迷宮,DTT-2型小鼠跳臺儀(中國醫學科學院);低溫高速離心機(Eppendorf);組織勻漿機(德國IKA公司);酶標儀Thermo 3001(德國ZEISS公司);DYCZ-40D電泳儀,DYY-7C型電泳儀電源(北京六一);UVP化學發光成像系統;萬分之一電子天平(日本A&G有限公司);ZD-9556A 水平脫色搖床(江蘇盛藍儀器制造有限公司)。

1.3 方法

1.3.1實驗動物 3、6、9月齡APP/PS1(APPswe, PSEN1dE9)轉基因小鼠(Tg)共68只及3、6、9月齡C57BL/6J小鼠(WT)共34只,體質量(22～29)g,購自南京君科生物工程有限公司,合格證號:2018000601886。實驗動物飼養于溫度為(23 ± 2)°C并且空氣流通的房間內。實驗期間小鼠自由飲水和攝食,嚴格遵循實驗動物管理相關規定。

1.3.2實驗動物分組及給藥 3、6、9月齡APP/PS1小鼠與同月齡的C57BL/6J小鼠隨機分為3組:WT組(n=12,n=12,n=10),Tg組(n=12,n=12,n=10),Tg+SY 30 mg·kg-1組(n=12,n=12,n=10)。SY 30 mg·kg-1組灌胃給予SY 30 mg·kg-1,WT組和Tg組給予生理鹽水,每日1次,連續給藥3個月至行為學實驗結束。

1.3.3Morris水迷宮實驗 平臺置于水面下約1 cm,置于第一象限中心,水溫保持在(22±2)℃。實驗過程中保持水池邊緣的標識物不變和環境安靜,減少噪音對實驗的干擾。定位航向實驗中,小鼠每日訓練兩次。小鼠從相鄰象限和相對象限的入水點面向池壁入水,記錄小鼠找到平臺的時間為逃避潛伏期。若小鼠未在120 s內找到平臺,則需引導小鼠游上平臺,使小鼠產生記憶,并記錄逃避潛伏期為120 s。在空間探索實驗中,撤去平臺使小鼠從第三象限入水,記錄小鼠首次穿越平臺時間及穿越平臺次數。

1.3.4跳臺實驗 實驗在底部鋪有銅柵的設備中進行。在學習階段,小鼠適應環境3 min后打開電源,銅柵通電。將小鼠放置于絕緣平臺上,當小鼠跳下平臺會受到電擊,正常情況下小鼠會立即跳上平臺,若小鼠不上平臺則需手動將小鼠放上平臺,產生記憶。訓練試驗結束24 h后,進行回憶實驗。記錄每只小鼠首次跳下平臺的時間和3 min內跳下平臺的總次數。

1.3.5ELISA實驗 每組小鼠隨機選取4只進行檢測,稱取一定重量的大腦皮層組織,加入9倍體積的PBS后勻漿。組織勻漿離心后收集上清液。根據試劑盒說明書加入相應試劑,在450 nm波長測定每孔A值,用Excel繪制標準曲線,根據曲線方程計算待測樣品濃度。

1.3.6Western blot實驗 提取各組小鼠皮層與海馬組織總蛋白,用BCA試劑盒測定蛋白質濃度,將蛋白質熱變性并進行SDS-PAGE凝膠電泳。將蛋白質轉移至PVDF膜上,在室溫下封閉1 h。PVDF膜與以下抗體在4 °C孵育過夜:Arginase-1兔多克隆抗體(1 ∶1 000); iNOS兔多克隆抗體(1 ∶1 000);小鼠β-actin單克隆抗體(1 ∶1 000);TREM2兔多克隆抗體(1 ∶1 000);TLR4鼠單克隆抗體(1 ∶1 000); p-NF-κB p65兔多克隆抗體(1 ∶1 000);NF-κB p65兔多克隆抗體(1 ∶1 000)。次日,PVDF膜與相應二抗室溫孵育1 h,將ECL發光液均勻覆蓋于PVDF膜上,并使用UVP化學發光成像系統對條帶進行可視化,用ImageJ對條帶進行分析。

2 結果

2.1 SY改善不同月齡的APP/PS1轉基因小鼠的認知功能障礙通過Morris水迷宮實驗以明確SY對3、6、9月齡APP/PS1小鼠的長期學習記憶能力的影響。定位航行實驗表明,與3、6、9月齡WT組小鼠相比,同月齡Tg組小鼠逃避潛伏期均明顯延長(P<0.01)。3月齡SY組小鼠逃避潛伏期有略微下降的趨勢,但差異并無顯著性,6月齡與9月齡SY組小鼠的逃避潛伏期則明顯縮短(P<0.01,P<0.05),如Fig 1A-C。

在空間探索實驗中,與同月齡WT組小鼠相比,3、6、9月齡Tg組小鼠首次穿過平臺的時間分別延長了95.7%(P<0.05)、203%(P<0.01)和200%(P<0.01),表明各月齡APP/PS1小鼠的學習記憶能力受損。而3、6、9月齡SY組小鼠首次穿過平臺的時間分別減少了33.6%、45.0%(P<0.01)和33.3%。與同月齡WT組小鼠相比,3、6、9月齡Tg組小鼠的穿越平臺次數分別減少了50.4%和400%(且與3月齡Tg組相比差異有顯著性,P<0.05)和74.5%。經過SY治療后各月齡SY組小鼠穿越平臺均增加,3月齡小鼠增加了19.4%,6月齡小鼠增加了650%(明顯高于3月齡SY組小鼠,P<0.01),9月齡小鼠增加了166.7%(Fig 1D,F)。結果表明,SY可以改善不同月齡的APP/PS1轉基因小鼠的認知功能障礙,其中對6月齡APP/PS1小鼠的認知障礙改善最好。

2.2 SY提高不同月齡的APP/PS1轉基因小鼠的短期學習記憶能力跳臺實驗明確SY對3、6、9月齡APP/PS1小鼠的短期學習記憶能力的影響。如Fig 2所示,與同月齡WT組小鼠相比,各月齡Tg組小鼠逃避潛伏期分別減少了6.9%,51.7%(P<0.05)和40.1%,錯誤次數分別增加了73.1%,300%(P<0.01)和260%(P<0.05)。與同月齡Tg組小鼠相比,3月齡SY組小鼠逃避潛伏期僅增加0.043%,錯誤次數增加54.7%,但差異無顯著性,6、9月齡SY組小鼠逃避潛伏期分別增加105.9%和68.9%(均明顯高于3月齡SY組小鼠,P<0.01,P<0.05);錯誤次數分別減少了75.8%(P<0.01)和71.4%(P<0.05)。結果表明,SY可以提高不同月齡的APP/PS1轉基因小鼠的短期學習記憶能力,其中對6月齡APP/PS1小鼠的改善作用最好。

2.3 SY調節了不同月齡小鼠大腦皮層中IL-6和TGF-β1表達水平與同月齡WT組小鼠相比,3月齡Tg組小鼠皮層中IL-6的含量呈現升高趨勢,6、9月齡Tg組小鼠IL-6的含量明顯升高(P<0.05),經給藥治療后6、9月齡SY組小鼠皮層中IL-6的含量明顯降低(P<0.05)。與各月齡WT組小鼠相比,3月齡Tg組小鼠TGF-β1的含量僅有下降的趨勢,6、9月齡Tg組小鼠TGF-β1的含量明顯下降(P<0.05),經SY治療后,3、9月齡SY組小鼠皮層中TGF-β1的含量有上升的趨勢,6月齡SY組小鼠TGF-β1的含量明顯上升(P<0.05)(Tab 1)。

Tab 1 Content of IL-6 and TGF-β1 in cortical tissue of mice at different months of

Fig 1 Effects of safflower yellow on learning and memory ability of 3,6,9-month-old APP/PS1 transgenic mice in Morris water maze

Fig 2 Escape latency and error frequency of mice at different months of age in step-down

2.4 SY誘導了不同月齡小鼠腦組織中TREM2蛋白表達如Fig 3所示,與3、9月齡WT組小鼠比較,同月齡 Tg組小鼠皮層組織中TREM2的表達水平呈現下降的趨勢,在6月齡Tg組小鼠皮層組織中TREM2的表達水平明顯降低(P<0.05)。3、9月齡SY組小鼠TREM2的蛋白表達水平有升高的趨勢,6月齡SY組小鼠TREM2表達明顯升高(P<0.05)。同樣,與WT組相比,在海馬組織中各月齡Tg組小鼠TREM2的表達水平均明顯降低(P<0.05)。經SY治療后,3、9月齡SY組小鼠TREM2的表達水平出現升高趨勢,6月齡SY組小鼠TREM2的表達水平則明顯升高(P<0.05)。

2.5 SY對不同月齡小鼠腦組織中iNOS/Arg-1蛋白表達水平的影響iNOS和Arg-1通常分別被認為是M1和M2極化的標志性蛋白。如Fig 4所示,與WT組相比,在各月齡Tg組小鼠的皮層組織中,3月齡小鼠iNOS的表達水平有升高的趨勢,Arg-1的表達水平有降低的趨勢;6、9月齡Tg組的小鼠iNOS的表達水平明顯升高,Arg-1的表達水平明顯下降(P<0.05)。在海馬組織中,各月齡Tg組小鼠iNOS的表達水平明顯升高,Arg-1的表達水平明顯降低(P<0.05)。SY明顯降低了3月齡小鼠海馬及6月齡小鼠腦組織中iNOS的蛋白表達,提高了Arg-1蛋白的表達水平(P<0.05)。9月齡SY組小鼠iNOS/Arg-1蛋白的表達水平僅有降低/升高的趨勢,差異無統計學意義。

2.6 SY 降低了不同月齡小鼠腦組織中TLR4及p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白的表達水平TLR4信號會激活NF-κB通路并釋放炎癥介質,導致大腦中的炎癥反應,并加快AD疾病進程。如Fig 5所示,與WT組相比,各月齡Tg組的皮層區域TLR4的表達水平有增加的趨勢,海馬中TLR4的表達水平明顯增加(P<0.05)。各月齡SY組小鼠皮層組織中TLR4的表達水平均呈現下降的趨勢,海馬組織中TLR4蛋白的表達水平明顯降低(P<0.05,P<0.01)。在皮層組織中,p-NF-κB p65/NF-κB p65的表達水平在3、9月齡Tg組小鼠中升高,在6月齡Tg組小鼠中明顯升高(P<0.05)。在海馬組織中,各月齡Tg組小鼠p-NF-κB p65/NF-κB p65的表達水平明顯升高(P<0.05),SY有效降低了6月齡APP/PS1小鼠p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白的表達水平(P<0.05)。

Fig 3 Western blot detection of TREM2 protein expression in brain tissue of mice at different months of #P<0.05 vs WT group; *P<0.05 vs Tg group.

Fig 4 SY reduced expression of iNOS protein and induces Arg protein expression in brain tissue of mice at different months of #P<0.05 vs WT group;*P<0.05 vs Tg group.

Fig 5 Western blot detection of TLR4/NF-κB pathway-related protein expression in brain tissue of mice at different months of #P<0.05 vs WT group; *P<0.05, **P<0.01 vs Tg group.

3 討論

AD是常見的中樞神經系統退行性疾病,認知功能伴隨著病程的進展而逐漸下降。APP/PS1小鼠能夠將AD相關的人類突變基因APPswe和PSEN1de9轉移至小鼠體內,使其表現出與AD患者相似的病理特征,很好地模擬AD疾病進展[9]。

研究表明,APP/PS1小鼠在6個月大時出現學習記憶缺陷,并隨著年齡的增長逐步加重[10]。在Morris水迷宮實驗中,與不同月齡WT組相比,3、6、9月齡Tg組小鼠逃避潛伏期和首次穿越平臺的時間均延長,而穿越平臺次數減少,說明3月齡APP/PS1小鼠歷經3個月后,學習記憶能力出現損傷,并隨著月齡增加而加重。SY對3月齡小鼠長期學習記憶有一定的改善效果,但明顯提高了6、9月齡小鼠的長期學習記憶能力。在跳臺實驗中,SY對3月齡小鼠短期學習能力的改善并不理想,對6、9月齡小鼠的短期學習記憶能力有一定的改善作用。行為學實驗表明6月齡可能是SY提高APP/PS1轉基因小鼠學習記憶能力的最佳時期,可能是由于3月齡小鼠處于疾病早期,而9月齡小鼠已處于AD重度病理階段。

MG是一種特殊的吞噬細胞,分布于整個中樞神經系統,是神經膠質細胞的主要類型之一[11]。MG對神經炎癥的調節作用與其活化表型密切相關。目前將激活的MG分為兩種表型:M1型為經典活化狀態,介導MG向淀粉樣斑塊遷移和聚集,同時釋放炎性因子,如iNOS、IL-1β、IL-6等,誘導炎癥反應;M2型為“交替激活”狀態,通過釋放抗炎因子如Arg-1、IL-4、TGF-β等,促進組織修復[12-13]。MG的M1/M2表型僅代表炎癥反應的兩種狀態,并非獨立存在,而是可以相互轉化。研究表明,調節MG從M1型轉化為M2型,有助于減少Aβ的產生,促進Aβ的清除,減少炎性因子的釋放,從而改善APP/PS1小鼠的認知功能障礙[14]。TREM2在MG中高度表達,同時TREM2 在促進MG表型轉化方面起著至關重要的作用。研究表明,敲除BV-2細胞中的TREM2基因會抑制M2型MG的表達,并誘導M1型表達增加,增加炎癥反應,而TREM2 的過表達減輕MG炎癥[15]。因此,調節MG表型轉變有助于減輕炎癥反應,延緩AD進展。在本研究中,SY明顯下調了6、9月齡小鼠IL-6表達水平,明顯增加了6月齡小鼠 TGF-β1的含量。而SY對炎癥因子的調節是否與MG的表型轉化有關?因此,重點研究SY在調節不同月齡小鼠MG極化中的作用。結果表明各月齡APP/PS1小鼠海馬中iNOS的表達水平明顯升高,Arg-1和TREM2的表達水平明顯下調,表明各月齡APP/PS1小鼠M1型MG表達增加。SY明顯降低了6月齡小鼠腦組織和3月齡小鼠海馬中iNOS的表達水平,上調了Arg-1和TREM2的表達水平。因此,SY可能通過提高TREM2的表達水平,促進MG表型轉化進一步調節炎癥因子的水平。

NF-κB在炎癥、免疫和細胞增殖中發揮重要作用,TLR4介導的NF-κB激活是引起促炎介質表達的關鍵因素。TLR4誘導IκB-α的磷酸化和降解,導致NF-κB與IκB解離,釋放NF-κB p65易位進入細胞核,進一步與相關炎癥因子的DNA結合,刺激各種靶基因的轉錄,引起炎癥反應[16-17]。研究表明,TLR4抑制劑可以通過抑制MyD88/NF-κB/NLRP3激活,逆轉MG表型,減少Aβ沉積,減輕APP/PS1轉基因小鼠的腦損傷[18]。本研究發現,TLR4在各月齡APP/PS1小鼠海馬中的表達水平明顯升高,這進一步導致了各月齡小鼠海馬中p-NF-κB p65/NF-κB p65的表達水平升高。經SY治療后,3、6、9月齡APP/PS1小鼠海馬中TLR4蛋白表達水平明顯降低,p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平僅在6月齡小鼠海馬中明顯下調。因此,SY對各月齡小鼠的學習記憶能力的改善作用與其抑制TLR4/NF-κB通路激活,促進MG活化表型轉化以及減輕腦內炎癥反應密切相關。

綜上所述,SY能提高3、6、9月齡APP/PS1轉基因小鼠的學習記憶能力,綜合比較發現SY對6月齡 APP/PS1小鼠的整體改善效果最佳。此外,SY可以調節MG由M1型向M2型轉化,并通過抑制TLR4-NFκB信號通路的激活和調節炎癥因子的水平來減輕慢性神經炎癥反應并發揮神經保護作用。