澤瀉醇A保護血腦屏障改善腦缺血/再灌注損傷的作用和機制研究

鄧云飛,李惠紅,魏 偉,周陽杰,薛偕華,3,4

(1.福建中醫藥大學康復醫學院, 福建 福州 350122; 2.福建中醫藥大學附屬康復醫院, 福建 福州 350003; 3. 福建省康復技術重點實驗室, 福建 福州 350122; 4. 福建省認知功能康復重點實驗室, 福建 福州 350003)

腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)是缺血性腦卒中再灌注治療后缺血腦區血流再通和復氧引發的腦組織繼發性損傷,其機制與炎癥、氧化應激和蛋白水解等相關[1-2],且難以完全避免,其改善對缺血性腦卒中的治療具有重要意義。

CIRI主要由血腦屏障(blood brain barrier, BBB)破壞介導,腦缺血/再灌注(cerebral ischemia-reperfusion , CI/R)時BBB破壞導致外源性免疫細胞和炎癥因子等進入腦組織,加重CIRI[3-4]。BBB由腦毛細血管的基膜、內皮細胞、周細胞和星形膠質細胞終足構成,是腦組織和血液之間的物理屏障,阻擋了神經毒性物質、血細胞和病原體等進入腦組織,同時調控腦組織的代謝,對維持中樞神經系統的穩態具有重要意義[4]。基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)是CI/R過程中破壞BBB的重要病理因素,其屬于基質金屬蛋白酶家族,為一種Zn2+依賴的蛋白水解酶,可降解和重塑細胞外基質。通過酶解IV型膠原蛋白、層黏連蛋白和纖維連接蛋白等,可破壞腦血管基底膜導致BBB損傷[5]。研究發現在CIRI過程中MMP-9生成增多,而抑制MMP-9水平可有效改善CIRI[6]。

目前臨床上主要采用消炎和抗氧化應激藥物治療CIRI[7],但其具有療效單一、用藥條件嚴格和副作用明顯等局限。近年來,天然藥物的研究引起人們越來越多的關注,使用具有抗炎、抗氧化作用的中藥改善CIRI被廣泛研究[8]。澤瀉具有抗炎[9]、抗氧化[10]和保護內皮細胞[11]的功能,其主要成分澤瀉醇A(Alisol A, AA)屬于生物堿四環三萜類化合物,可減少小鼠動脈MMP-9水平[12]。同時,分子對接結果發現AA可與MMP-9結合,其可能具有抑制腦組織MMP-9的功能。

故本研究擬探討AA干預是否可抑制CI/R過程中的MMP-9升高,從而保護BBB、減輕CIRI。

1 材料與方法

1.1 實驗動物C57BL/6小鼠,雄性,33只,體質量25～30 g,購于廣東藥康生物科技有限公司,許可證編號:SCXK(粵)2020-0054。飼養于福建中醫藥大學動物實驗中心SPF級實驗室,許可證編號:SYXK(閩)2020-0002,自由進食、進水,12 h晝夜交替飼養。本研究已通過福建中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準(審批號:FJTCMIACUC2020091)。

1.2 主要儀器與試劑曠場、Y迷宮實驗設備(上海欣軟信息科技有限公司);9.4T小動物磁共振系統(Bruker Bio-Spec70/20 USR);HT7800高反差型透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司); YGQ-3126D型切片機、YT-7FB型生物組織攤烤片機(亞光醫用電子技術有限公司); ChemiDoc XRS+型化學發光成像系統(美國Bio-Rad公司);PowerPac HC蛋白質電泳及轉印裝置(美國Bio-Rad公司)。AA(純度>98%,上海源葉生物科技有限公司); MMP-9抗體(10375-2-AP)、β-actin抗體(60004-1-lg)(武漢三鷹生物技術有限公司);KIT-9720型免疫顯色試劑(福州邁新生物技術開發有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1實驗動物分組、造模與干預

1.3.1.1 實驗動物分組 33只小鼠隨機分為假手術組(Sham)、GCI/R組和AA干預組(GCI/R+AA),每組11只,造模后死亡4只,每組剩余9只用于后續實驗。

1.3.1.2 模型構建 GCI/R是一種研究CIRI的公認有效造模方式,操作簡單且不局限于單一腦區[13]。小鼠術前禁食12 h,根據體質量用1%戊巴比妥鈉(3 mL·kg-1)麻醉后置于仰臥位,固定四肢和牙齒使其充分暴露頸部,脫毛、消毒后沿正中線縱向剪開一小口,用顯微鑷分離頸部筋膜和肌肉,在氣管和胸鎖乳突肌之間的深部可見頸總動脈和其外側的迷走神經,分離出頸總動脈并用手術縫合線打活結結扎并計時20 min。計時結束后解開活結,確保血流恢復供應后用可吸收手術縫合線縫合傷口。Sham組小鼠僅分離頸總動脈而不結扎。

1.3.1.3 AA干預 術后第1天開始,GCI/R+AA組小鼠根據體重進行30 mg·kg-1的AA灌胃干預,Sham組和GCI/R組給予等量生理鹽水灌胃,每日1次,連續7 d。

1.3.2神經功能評定

1.3.2.1 改良神經功能缺損評分(modified neurological severity score,mNSS) mNSS評分是一項量化實驗動物運動、感覺、平衡和反射功能的評分方法,被廣泛應用于CIRI模型的神經功能缺損評價[14]。采用盲法在術后的第1、3、5、7天進行評估,當小鼠不能完成某項任務時記1分,總分 0～18分,分數越高表明神經功能損傷越嚴重。

1.3.2.2 曠場實驗 造模后第8天,采用曠場實驗評價小鼠的自主運動能力和探索行為,反映運動能力和焦慮程度[15]。將小鼠從中心點放入曠場(50 cm×50 cm×45 cm),讓其自由探索10 min。實驗過程錄像并使用相應的計算機軟件捕捉小鼠運動路徑,后期運用 Supermaze 軟件計算小鼠的運動總路程和中心區域路程。

1.3.2.3 Y迷宮實驗 造模后第8天采用Y迷宮實驗檢測小鼠工作記憶和探索活動。其由3條長35 cm、寬5 cm、高15 cm,相互呈120°夾角的臂組成。小鼠被放置于三條臂的交叉區域,自由探索8 min,使用視頻成像系統捕捉小鼠進入各條臂的順序。統計正確交替的次數,連續進入 3個不同的臂為 1次交替。使用交替率評價小鼠的工作記憶,交替率=正確交替次數/(進入臂的總數-2)×100%[16]。

1.3.3磁共振波譜(magnetic resonance spectroscopy, MRS)檢測大腦皮層相關神經代謝物水平 采用9.4T小動物磁共振波譜掃描儀檢測3組小鼠大腦皮層肌酸(creatine, Cr)、N-乙酰天門冬氨酸(N-acetylaspartate, NAA)、膽堿(choline, Cho)、肌醇(myo-inositol, mI)、牛磺酸(taurine,Tau)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)的代謝水平。小鼠經 2%～3% 異氟烷麻醉后,俯臥位置于掃描床上。選取皮層作為感興趣區域,大小為1 mm×1 mm×1 mm。采用PRESS序列獲取MRS, MRS參數為TR=1 500 ms, TE=144 ms,平均次數為256次,體素=5 mm×4 mm×4 mm。每種代謝物的參考值如下: Cr:3.05 ppm; NAA:2.02 ppm; Cho:3.22 ppm; mI:3.56 ppm; Tau和GABA:3.02 ppm。Cr作為內參用于計算其他代謝物的相對水平。使用TOPSPIN (V3.1, Bruker Biospin, Germany)對相關圖像和數據進行分析,計算Cho、NAA、mI、Tau、GABA的相對代謝水平。

1.3.4透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)檢測皮層BBB超微結構 用4%多聚甲醛灌注后取出小鼠腦組織,去除嗅球后向后切取1.5 mm～2.5 mm薄片,沿正中線向左、右各切取1～2 mm區域,取皮層1 mm范圍得到1 mm×1 mm×1 mm的立方塊, 于4 ℃、4%多聚甲醛和2.5%戊二醛中浸泡固定。用0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液洗滌3次后在1%四氧化鋨中固定2 h。漂洗后脫水、包埋、切片、3%檸檬酸鉛染色后,透射電鏡下觀察各組小鼠皮層BBB超微結構。

1.3.5免疫組織化學法檢測皮層MMP-9表達水平 4%多聚甲醛灌注后取材,將腦組織脫水、石蠟包埋并切片。二甲苯和梯度乙醇脫蠟入水, 100 ℃ Tris-EDTA抗原修復后依次破膜、內源性過氧化物酶阻斷、封閉和一抗孵育(MMP-9 1 ∶200, 4 ℃過夜),PBS清洗后二抗37 ℃孵育1 h。鏈霉菌抗生物素過氧化物酶37 ℃孵育1 h后進行DAB顯色、蘇木精染核、分化、脫水透明和封片。顯微鏡下觀察并于相同倍數和參數下拍照。使用ImageJ圖像分析軟件檢測陽性細胞,使用平均陽性染色面積百分比法(Area %)分析MMP-9表達量。

1.3.6蛋白免疫印跡法檢測皮層MMP-9表達水平 小鼠麻醉后取大腦皮層低溫保存。向樣本加入適量裂解液后研磨并靜置30 min,4 ℃高速離心后取上清液BCA定量。SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、封閉、一抗(MMP-9 1 ∶2 500、β-actin 1 ∶3 000)4 ℃過夜, TBST清洗后二抗(1 ∶5 000)室溫孵育40 min,TBST清洗后顯影,使用Image LabTMSoftware 軟件分析條帶灰度值并進行統計分析。

1.3.7分子對接預測AA與MMP-9結合 從RCSB PDB網站下載MMP-9蛋白結構(選取“Homo sapiens”且“REFINEMENT RESOLUTION”最小的結構),用Py MOL軟件去水、去配體;從PubChem數據庫下載AA的3D結構。使用Auto Dock Tools軟件對AA結構進行加氫、計算電荷數和確定原子剛性處理,對活性成分進行“Torsion tree”處理后將AA與MMP-9進行對接得到結合能和結合位點。最后用Py MOL軟件進行可視化。

2 結果

2.1 各組小鼠神經功能比較

2.1.1mNSS評分比較 在造模后的第3、5、7天,與Sham組相比GCI/R組小鼠神經功能評分明顯升高(P<0.01),GCI/R+AA組較GCI/R組評分明顯降低(P<0.01)(Fig 1 A)。

2.1.2曠場和Y迷宮結果比較 曠場軌跡圖顯示GCI/R組小鼠運動軌跡明顯減少而GCI/R+AA組小鼠增加(Fig 1 B)。在曠場實驗的總路程、中心區域路程占總路程比值和Y迷宮的交替率方面,GCI/R組小鼠相比于Sham組明顯降低(P<0.01),GCI/R+AA組與GCI/R組相比則明顯升高(P<0.01)(Fig 1 C-E)。

2.2 小鼠皮層Cho、NAA、mI、Tau和GABA的相對代謝水平MRS檢測結果顯示,與Sham組相比,GCI/R組小鼠腦內Cho/Cr、mI/Cr和Tau/Cr明顯上升,NAA/Cr和GABA/Cr水平明顯下降(P<0.01)。與GCI/R組相比,GCI/R+AA組小鼠腦內Cho/Cr、mI/Cr和Tau/Cr明顯下降,NAA/Cr和GABA/Cr水平明顯上升(P<0.01)(Tab 1)。

2.3 大腦皮層BBB超微結構改變TEM觀察發現,Sham組小鼠大腦皮層BBB形態和結構完好。GCI/R組小鼠大腦皮層微血管基膜塌陷、管腔變窄;內皮細胞間隙變大、緊密連接破壞,內皮細胞處于激活狀態、質膜褶皺;星形膠質細胞終足腫脹。GCI/R+AA組小鼠大腦皮層微血管管腔充盈;內皮細胞質膜平整、緊密連接完好;星形膠質細胞終足相對正常(Fig 2)。

2.4 大腦皮層MMP-9免疫組化檢測結果免疫組織化學檢測結果發現,Sham組小鼠大腦皮層MMP9表達量較低,GCI/R組表達量明顯增多(P<0.01);GCI/R+AA組表達量明顯下降(P<0.01)(Fig 3)。

Tab 1 Comparison of ratios of Cho/Cr, NAA/Cr, mI/Cr, Tau/Cr and GABA/Cr in n=5)

Fig 1 Comparison of neurologic function in each group of n=6)

Fig 2 Electron microscope observation of BBB in cortex

2.5 大腦皮層MMP-9 蛋白免疫印跡檢測結果蛋白免疫印跡結果顯示,GCI/R組小鼠皮層MMP-9水平相較于Sham組明顯增高(P<0.01);GCI/R+AA組相較于GCI/R組明顯降低(P<0.05)(Fig 4)。

2.6 AA與MMP-9分子對接結果分子對接結果顯示,AA可與MMP-9的TYR-50和ARG-106兩個基團結合,結合能為-6.24 kcal·mol-1(Fig 5)。

3 討論

CIRI是缺血性腦卒中再灌注治療引起的一種常見繼發性損傷。目前臨床上常采用丁苯酞和依達拉奉等藥物進行抗炎、抗氧化治療[7]。但其副作用大等一系列弊端讓人們越來越多地將眼光放到了具有副作用小和多靶點、多通路起作用等優點的中藥身上。研究發現,福建道地藥材澤瀉具有抗炎[9]、抗氧化[10]和保護內皮細胞[11]等作用,這與CIRI的病理機制相契合。故本研究選取澤瀉的主要成分AA進行研究,并首次發現了其對于CIRI的保護作用。我們通過檢測大腦神經功能和神經代謝物質發現AA治療可改善小鼠CIRI。CIRI之后,小鼠的運動和認知功能受損、出現焦慮,且腦組織相關神經代謝改變。在本研究中,GCI/R后小鼠mNSS評分明顯升高,經AA治療后逐漸降低。同時,GCI/R小鼠在曠場實驗中的自主運動和探索行為明顯減少,提示其運動功能受損、焦慮程度增加[15],Y迷宮結果顯示其工作記憶減退, AA治療后以上表現均明顯改善。本研究使用MRS檢測了各組小鼠大腦皮層的CIRI相關神經代謝指標。其中,GABA是一種抑制性氨基酸,在CIRI時明顯升高[17]。 NAA為神經元代謝標志物,CIRI時其水平降低[18]。Tau也是抑制性氨基酸,在CIRI時表達增多以應對腦組織中的興奮性毒作用[19]。Cho的值代表可溶性膽堿復合物的水平,因主要存在于細胞膜上,其峰值變化反映了細胞膜代謝和細胞更新水平;CIRI時介導 Cho水平的升高[20]。mI主要存在于膠質細胞中,是膠質細胞的標志物,當CIRI發生時,膠質細胞過度激活,引起mI水平升高[20]。MRS結果顯示,GABA、NAA水平在GCI/R小鼠皮層表達明顯降低,而Cho、mI和Tau明顯升高;經AA治療后GABA、NAA表達升高,Cho、mI和Tau表達下降。綜上可知,AA治療可有效改善小鼠CIRI。

Fig 3 Comparison of IHC-staining of MMP-9 in cortex in each group of n=3)

Fig 4 Expression of MMP-9 protein in cortex in each group

Fig 5 The visualization and binding energy of molecular docking

BBB具有隔離有害物質、調節CNS代謝的功能,對于維持 CNS 內環境穩態和腦細胞正常功能具有重要作用[21]。其破壞是CIRI的中心環節和明顯病理學特征[22]。CI/R過程中,氧化應激、炎癥和酶解等因素引起BBB破壞,促使外周血液中的活性氧、炎癥因子和血源性免疫細胞等進入腦組織造成CIRI[3-4]。本研究通過TEM觀察評估BBB的破壞,發現GCI/R小鼠大腦皮層BBB受損嚴重,腦微血管基膜塌陷、管腔變窄,內皮細胞質膜褶皺,緊密連接破壞和星形膠質細胞終足腫脹;經AA治療后血管管腔充盈,內皮細胞質膜平整,緊密連接完好,星形膠質細胞終足腫脹減輕。此結果表明AA減輕了BBB破壞,這可能是其改善CIRI的途徑之一。

MMP-9是一種可降解細胞外基質的蛋白酶,在正常腦組織中水平較低,在某些病理條件下分泌增多從而參與組織的損傷和修復。在CI/R過程中,MMP-9分泌增加,酶解血管基膜和細胞連接,導致BBB破壞[23]。研究發現抑制MMP-9可有效保護BBB、改善CIRI[6]。而AA被證明可降低高脂小鼠血管的MMP-9水平[12]。在本研究中, 蛋白免疫印跡和免疫組化檢測結果顯示,GCI/R小鼠大腦皮層MMP-9表達顯著升高,經AA治療后明顯降低,提示AA可能抑制CIRI后腦組織內增多的MMP-9表達。經分子對接技術分析發現AA可與MMP-9通過TYR-50和ARG-106兩個基團結合,且結合能較低。蛋白位點對于蛋白質結構和功能的維持具有重要意義,其結合將改變蛋白質分子結構和相關生物化學功能。研究發現蛋白質的Tyr-50位點對于抗原抗體的結合和維持起著重要作用[24],AA結合Tyr-50可能是導致MMP-9免疫化學檢測表達量降低的原因;而ARG-106對于MMP-9發揮蛋白酶切作用非常關鍵[25],其結合可抑制MMP-9的酶解作用。由此推測AA可能結合MMP-9并抑制其活性,從而減輕CI/R過程中的BBB損傷。

綜上所述,本研究發現AA可改善小鼠皮層CIRI,這一作用可能是通過抑制CI/R過程中增多的MMP-9對于BBB的損傷作用實現的。其更多機制仍待進一步研究。