基于PI3K/AKT/GSK-3β信號通路探討EA改善APP/PS1雙轉基因小鼠認知功能障礙的內在機制

仲麗麗,路 鑫,于 穎,趙秦妍,張 靜,劉彤慧,倪雪妍,車艷玲,吳 丹,劉 宏

(1.黑龍江中醫藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫藥大學 附屬第一醫院,黑龍江 哈爾濱 150040;3.黑龍江中醫藥大學 基礎醫學院,黑龍江 哈爾濱 150040)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是老年時期的一種比較常見的中樞神經系統退行性病變,其臨床表現以記憶障礙和行為改變等為主。同時,AD也是老年期最常見的慢性疾病之一,其患病率與年齡有密切關系,年齡平均每增加6.1歲,患病率則升高1倍。世界衛生組織(WHO)估計全球65歲以上老年人群中AD的患病率是4%～7%,在85歲以上的老年人群中,AD的患病率可高達20%～30%[1]。《2021年世界阿爾茨海默病報告》中指出,預計2030年全球將有7800萬人患有失智癥,據2021年大規模的調查 AD已成為我國第五大死亡原因[2]。AD 發病率高、危害大,發病機制尚不明確,迄今尚無特效的治療藥物,因此亟需研發治療AD 的新型藥物。

鞣花酸(ellagic acid,EA)是一種存在于多種水果和堅果(如草莓、石榴、核桃)中的天然酚內酯化合物,具有酚類化合物的結構和性質,分子結構式中含有4個酚羥基,具有較強的提供氫原子或與孤對電子配對的能力,這使鞣花酸擁有較強的清除自由基和抗氧化的能力[3-4]。此外,它還具有多種生物活性,如抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抑制細胞凋亡等。近年越來越多的文獻報道,EA在中樞神經系統疾病中發揮重要作用。然而,EA對AD發生、進展的影響和機制國內外相關文獻報道較少。本實驗組前期研究證實:給予APP/PS1轉基因小鼠灌胃EA后,有效抑制氧化應激誘導的海馬組織中Aβ堆積和tau蛋白磷酸化,保護神經元損傷。改善小鼠學習記憶能力[5]。

1 材料

1.1 動物6月齡SPF級APP/PS1雙轉基因小鼠32只,另外選取8只同月齡SPF級C57BL/6J野生型小鼠(Wild type)作為對照,體重為(22±2) g,由北京華阜康生物科技有限公司提供,動物生產許可證為SCXK(京)2020-0004。小鼠飲水自由,進食標準飼料由北京華阜康生物科技有限公司提供,實驗過程中動物飼養、處死、取材等過程均遵守實驗動物倫理學操作規范,均在SPF級條件下進行。

1.2 藥物二甲基亞砜(DMSO)(批號:EZ2921C395,BioFROXX);EA(貨號:E102710,上海阿拉丁生化科技有限公司) ;LY294002(批號:MB6045,大連美侖生物科技有限公司);PI3K Antibody(批號:abs119725)、AKT Antibody、GSK-3β Antibody(批號:abs119623)(Absin Bioscience );SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒50T(批號:20190904,Solarbio);羊抗小鼠(或羊抗兔)lgG-HRP(批號:SE131,Solarbio);ECL化學發光底物試劑盒(特超敏)(貨號:DCM09090100,biosharp)。

1.3 主要試劑(1)10%DMSO溶液配制:取適量DMSO原液用生理鹽水進行10倍(DMSO ∶生理鹽水=1 ∶9)稀釋,4 ℃保存冰箱存放備用。(2)EA配制:EA購買時為粉末狀,取100 mg EA放置50 mL的燒杯中,加入2 mL 10%的DMSO和18 mL的生理鹽水溶液中充分攪拌至EA完全溶解,配置成5 g·L-1的EA溶液,4 ℃冰箱存放備用。(3)LY294002配制:取5 mg的LY294002粉末,加入0.5 mL的DMSO和4.5 mL的生理鹽水的混合液,攪拌溶解后配置成LY294002母液,取1.5 mL的母液加入生理鹽水配置成0.15 g·L-1的溶液備用,4 ℃冰箱存放備用。

1.4 儀器Morris水迷宮系統(成都泰盟科技有限公司),透射電子顯微鏡HT-7700[日立(中國)有限公司],DYY-6D型電泳儀電源/24DN制膠器(北京六一生物科技有限公司),TY-80B脫色搖床(金壇市榮華儀器制造有限公司),PFS-300塑料薄膜封口機(山東濟寧銀都包裝機械有限公司),WB顯影儀(美國Thermo Scientific公司)。

2 方法

2.1 動物分組及給藥

2.1.1實驗動物分組 將32只SPF級6月齡APP/PS1雙轉基因小鼠隨機分為4組,即:APP/PS1組、APP/PS1+EA組、APP/PS1+LY294002組、APP/PS1+EA+LY294002組,每組8只,另外將選取的8只SPF級C57BL/6J野生型小鼠(Wild type)作為空白對照組,即WT組。

2.1.2實驗動物給藥 APP/PS1+EA組予以50 mg·kg-1·d-1灌胃EA;APP/PS1+LY294002組予以1.5 mg·kg-1·d-1腹腔注射LY294002;APP/PS1+EA+LY294002組予以50 mg·kg-1·d-1灌胃EA,同時按1.5 mg·kg-1·d-1腹腔注射LY294002;WT組和APP/PS1組于相同時間點灌胃等體積10%DMSO。每日給藥1次,連續給藥60 d。

財政部副部長程麗華代表財政部向黑龍江北大荒農墾集團總公司成立表示祝賀。她表示，經國務院同意，授權財政部代表國務院對黑龍江北大荒農墾集團總公司履行出資人職責，標志著黑龍江墾區體制機制的重大轉變，翻開了黑龍江農墾發展嶄新的一頁。希望北大荒農墾集團總公司勇擔重任，繼續為實施鄉村振興戰略作出應有的貢獻；再接再厲，繼續將農墾改革不斷引向深入；不辱使命，全力打造具有全球競爭力的世界一流企業；采取有力措施，切實加強國有資產監管。財政部將認真落實黨中央、國務院決策部署，與黑龍江省委省政府和國家有關部委一道，進一步推動黑龍江農墾的改革發展。

2.2 Morris水迷宮灌胃給藥 60 d 后進行Morris水迷宮實驗,5組實驗動物需要進行4 d定位巡航實驗和1 d空間探索實驗,以評價各組干預方式對實驗動物學習和記憶能力的影響。

2.2.1定位巡航實驗 實驗開始之前在水池中加水,水溫控制在(22±2) ℃范圍內,放入50 g奶粉精,用攪拌棒攪拌至水呈不透明乳白色。液面劃分為 4 個象限,逃逸平臺放于第二象限的固定位置,且隱藏在液平面 1.5 cm以下。選擇距離水池圓心等距離的點作為入水點投放小鼠,隨后將小鼠面向池壁依次從Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限放入,記錄小鼠在60 s內是否能夠找到水池中隱藏的平臺,若小鼠能夠在60 s內找到平臺并在平臺停留5 s即視為成功,系統采集自動停止。若小鼠在60 s內未能找到平臺,將其引到平臺上停留10 s。第二天小鼠投放順序:Ⅱ、Ⅳ、Ⅰ,接下來每天放入順序依次類推。實驗結束后將小鼠放置籠具中,擦干。每天在3個入水點依次放入,連續4天。記錄小鼠第一次找到平臺所用的時間,即為逃避潛伏期。小鼠的游泳過程受到視頻跟蹤系統檢測和分析。

2.2.2空間探索實驗 定位巡航實驗結束24后,撤掉第三象限內的平臺,將小鼠面向池壁依次從Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限放入,記錄小鼠60 s內在原平臺所在象限內的停留時間和穿越平臺次數,觀察小鼠的空間學習和記憶的能力。

2.3 免疫組化檢測取出固定在4%多聚甲醛溶液中的小鼠海馬組織,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋。在切片機上切成5 μm的薄片,將制備好的石蠟切片烤片 65 ℃,12 h。常規脫蠟、水化,檸檬酸鈉抗原修復,過氧化氫孵育,參照免疫組化通用二步法檢測試劑盒說明書進行相關操作,1 ∶100稀釋一抗 PI3K、AKT、GSK-3β,然后按照DAB試劑盒配制DAB染色劑進行顯色,蘇木精復染,鹽酸酒精分化,梯度乙醇脫水,中性樹膠封片。用 Image J軟件進行蛋白定量分析。

2.4 透射電鏡將小鼠海馬部分的腦組織切成1 mm3的小塊,放在2.5%戊二醛中固定2 h。經1%餓酸固定2 h后,依次梯度乙醇溶液洗脫、包埋、切成50 nm的薄片,3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色,然后在透射電鏡下觀察并拍照。

2.5 蛋白免疫印跡法(Western blot,WB)將凍存的海馬組織取出研磨勻漿,抽取上清液進行BCA蛋白濃度測定。根據BCA蛋白測定說明書,調整蛋白濃度為0.5 g·L-1。制備 5% 濃縮膠+10% 分離膠,將樣品與標準品蛋白按 10 μL/孔進行上樣,電泳、封閉 、孵 育 對 應 一 抗(PI3K,1 ∶2 000;AKT,1 ∶2000;GSK-3β,1 ∶2 000),4 ℃過夜。次日待復溫 30 min 后 TBST 洗膜,二抗(1 ∶20 000)室溫搖床孵育1 h,經TBST洗膜后放入凝膠成像系統中進行曝光。使用 Image J 軟件分析目標條帶和內參蛋白灰度值的比值作為目標蛋白相對表達水平。

3 結果

3.1 EA對APP/PS1雙轉基因小鼠的學習記憶能力的影響第1～4天,與WT組相比較,其他4組的逃避潛伏期均較長(P<0.05),穿越平臺次數明顯減少(P<0.01);與APP/PS1組比較,APP/PS1+EA組、APP/PS1+EA+LY294002組小鼠的逃避潛伏期明顯縮短(P<0.01),而APP/PS1+LY294002組小鼠的逃避潛伏期在第4天實驗中較APP/PS1組明顯延長(P<0.01);APP/PS1+EA組小鼠穿越平臺次數增多(P<0.05),APP/PS1+LY294002組和APP/PS1+EA+LY294002組的小鼠在原平臺所在象限內穿越平臺次數無顯著差異(P>0.05)。與APP/PS1+LY294002組比較,APP/PS1+EA+LY294002組小鼠的逃避潛伏期縮短(P<0.05),穿越平臺次數無明顯差異(P>0.05)。

3.2 EA對各組小鼠海馬組織中PI3K、AKT、GSK-3β蛋白表達的影響為了探索EA對信號通路相關蛋白表達的影響,運用免疫組化方法,對各組小鼠海馬組織切片中的PI3K、AKT、GSK-3β表達量水平進行檢測,計算細胞平均光密度(integrated optical density,IOD)。與WT組比較,APP/PS1組、APP/PS1+LY294002組和APP/PS1+EA+LY294002組中的PI3K、AKT蛋白表達量顯著降低(P<0.01),GSK-3β表達量顯著升高(P<0.01);APP/PS1+EA組的PI3K表達量降低(P<0.05),AKT表達量顯著降低(P<0.01),GSK-3β表達量升高(P<0.05)。與APP/PS1組比較,APP/PS1+EA組的PI3K、AKT表達量顯著升高(P<0.01),GSK-3β表達量顯著降低(P<0.01);APP/PS1+LY294002組PI3K、AKT的表達量降低(P<0.05),GSK-3β蛋白表達量升高(P<0.05);而 APP/PS1+EA+LY294002組PI3K、AKT表達量升高(P<0.05),GSK-3β表達量顯著降低(P<0.01)。與APP/PS1+LY294002組比較,APP/PS1+EA+LY294002組PI3K、AKT表達量升高(P<0.05),GSK-3β表達量降低(P<0.05)。見Fig 1～4。

Tab 1 Effect of EA on learning ability of

3.3 EA對各組小鼠海馬區超微結構變化的影響WT組海馬神經元細胞數目較多,線粒體結構清晰,膜完整,線粒體嵴致密,無腫脹,細胞核居中,核仁明顯,微管、微絲排列整齊;APP/PS1組海馬神經元細胞數目較少,線粒體結構破壞,大部分線粒體出現腫脹,線粒體的內膜和外膜不完整,部分線粒體嵴消失,微管、微絲纏結,排列紊亂;APP/PS1+EA組神經元細胞數較APP/PS1組增多,線粒體結構較清晰,可見清楚的線粒體嵴,線粒體輕度水腫。微管、微絲排列較整齊有序;APP/PS1+LY294002組與APP/PS1組相似,神經元細胞數量較少,線粒體嚴重破壞,腫脹明顯,線粒體嵴融合或消失,微管、微絲排列紊亂;APP/PS1+EA+LY294002組神經元數目增多不明顯,線粒體結構不完整,內膜和外模破壞,仍有部分線粒體出現腫脹。見Fig 5。

Fig 1 Expression of PI3K,AKT,GSK-3βprotein in hippocampus of eachgroup of mice (100×)

Fig 2 Expression of PI3Kprotein in hippocampus of each group of mice(100×)

Fig 3 Expression of AKT protein in hippocampus of each group of mice (100×)

Fig 4 Expression of GSK-3βprotein in hippocampus of each group of mice (100×)

3.4 EA對PI3K/AKT/GSK-3β信號通路中PI3K、AKT、GSK-3β蛋白表達的影響與WT組比較,APP/PS1組、APP/PS1+LY294002組和APP/PS1+EA+LY294002組中的PI3K蛋白表達量顯著降低(P<0.01),AKT蛋白表達量降低(P<0.05),GSK-3β表達量顯著顯著升高(P<0.01);APP/PS1+EA組的PI3K、AKT表達量降低(P<0.05),GSK-3β表達量升高(P<0.05)。與APP/PS1組比較,APP/PS1+EA組PI3K表達量顯著降低(P<0.01),AKT表達量顯著升高(P<0.01),GSK-3β表達量顯著降低(P<0.01);APP/PS1+LY294002組PI3K、AKT表達量降低(P<0.05),GSK-3β表達量升高(P<0.05);APP/PS1+EA+LY294002組PI3K、AKT表達量升高(P<0.05),GSK-3β表達量降低(P<0.05)。與APP/PS1+LY294002組比較,APP/PS1+EA+LY294002組PI3K、AKT表達量升高(P<0.05),GSK-3β表達量降低(P<0.05),見Fig 6。

4 討論

AD是一種起病隱匿、進展緩慢的神經退行性疾病。臨床表現為進行性認知障礙,足以影響日常生活,對個人和社會具有很嚴重的影響[11]。中國是世界上患AD人數最多的國家[12],而AD的病因與發病機制比較復雜,因此,尋找安全有效的藥物預防和治療AD是一項刻不容緩的責任。EA作為一種膳食多酚,既可以獨立存在,也可以作為復雜結構的一部分存在,如鞣花單寧類,吸收后釋放EA和其他代謝物[13]。Han等[14]研究發現,鞣花酸有很高的清除自由基和抑制膜脂過氧化能力,在人體骨肉瘤細胞內誘導細胞凋亡,顯著減少細胞增殖。

研究表明,PI3K/AKT/GSK-3β信號通路在嚙齒動物的行為表現及學習和記憶功能中起著關鍵作用[15]。該通路與細胞的生存、代謝及凋亡密切相關,此信號通路轉導紊亂會誘發如癡呆、腫瘤、糖尿病等多種疾病[16]。研究顯示 Aβ引起的神經毒性作用與 PI3K/AKT/GSK-3β信號通路息息相關[17- 18]。PI3K作為第二信使將細胞外的信號傳遞給下游的蛋白激酶 AKT,之后被活化的 AKT,則能夠發揮進一步磷酸化的作用,激活或抑制其下游靶蛋白B淋巴細胞瘤-2基因相關啟動子(BAD)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase 9)、核因子激活的B細胞的κ-輕鏈增強(NF-kB)、糖原合成酶激酶-3(GSK3)、叉頭轉錄因子(FKHR)、周期蛋白依賴激酶抑制因子1A(cyclin dependent kinase inhibitor 1A,p21,Cip1)等,進而調節細胞的增殖、分化、凋亡和遷移。AD 患者的大腦皮層、紋狀體、海馬,都能夠表達GSK-3β。被活化的 AKT 可使磷酸化的GSK-3βN-末端的絲氨酸(GSK3β第 9 位點上絲氨酸或 GSK3α第 21 位點上絲氨酸) 失活,起著阻滯其對下游蛋白的磷酸化而抗凋亡的作用。AKT 是一種及其重要的抗調亡調節因子,在介導多種生物學效應的情況下發揮重要的作用,激活的 AKT 通過磷酸化 GSK-3β,從而抑制 GSK-3β的活性。同時,有研究表明,GSK-3β的活化可引起 tau 蛋白磷酸化水平的異常增高,tau 蛋白的異常磷酸化通過神經毒性作用介導神經退行性疾病 AD 的發生,在 AD 發病中起著至關重要的作用[19-21]。GSK-3β是調控重組與合成蛋白(Nrf2)的活性的蛋白激酶。GSK-3β能促進Nrf2返回胞漿,從而降低Nrf2參與介導抗氧化活性,從而加重機體內氧化應激損傷。近年來,GSK-3β被認為溶酶體的負向調節劑,導致細胞內神經毒素Aβ蛋白的清除率降低。因此,GSK-3β活性的高低是治療神經變性和行為功能障礙疾病的“新靶點”。當機體在不斷受到外界刺激時,會加重GSK-3β對Nrf2的負性調節作用,無法與抗氧化反應元件(ARE)的啟動子結合,激活抗氧化反應的發生[22-23]。信號通路機制模式圖見Fig 7。Qi等[24]發現在 Aβ誘導的 AD 小鼠中牛蒡苷元通過 PI3K/AKT/GSK-3β信號通路降低 tau 蛋白的高度磷酸化,從而降低其對學習和記憶能力的傷害。Kong等[25]發現,尼可地爾通過激活 AKT 來增加 AKT的磷酸化水平并上調結合原件蛋白活性,應用 PI3K 抑制劑 LY294002 阻止這種保護作用。

Fig 5 Ultrastructural changes in hippocampus of each group of mice(18 000×)

Fig 6 PI3K,AKTand GSK-3β protein detectionin hippocampus of each groupof mice

Fig 7 Mode diagram of signaling pathway mechanism

本研究利用Morris水迷宮實驗探討EA是否對AD小鼠的認知功能障礙有所改善。Morris水迷宮實驗是許多疾病模型中有關記憶能力的標準測試。動物是否能準確執行任務依賴于特定的回路和大腦結構,是否能準確回憶位置和導航環境的能力同樣依賴于多種認知機制[26]。實驗結果顯示,WT組小鼠的逃避潛伏期隨訓練天數增長不斷縮短,說明小鼠經過適應性訓練后,開始熟悉周圍環境,這符合正常小鼠對實驗的要求。APP/PS1+EA組的逃避潛伏期時間較APP/PS1組的逃避潛伏期明顯縮短(P<0.01);APP/PS1+EA+LY294002組的逃避潛伏期較APP/PS1+LY294002組的逃避潛伏期縮短(P<0.05)。在空間探索試驗中,APP/PS1+EA組較APP/PS1組小鼠穿越平臺次數增多(P<0.05);APP/PS1+LY294002組和APP/PS1+EA+LY294002組的小鼠穿越平臺次數無明顯差異(P>0.05);與APP/PS1+LY294002組比較,APP/PS1+EA+LY294002組的小鼠穿越平臺次數無明顯差異(P>0.05)。說明EA可以縮短APP/PS1雙轉基因小鼠的逃避潛伏期,延長在目標象限的停留時間,增加穿越平臺次數,改善小鼠的學習和記憶能力。而PI3K抑制劑LY294002對EA對APP/PS1雙轉基因小鼠的改善作用產生對抗作用,并且這種對抗作用要遠小于EA的改善作用。

WT組海馬神經元細胞數目較多,線粒體結構清晰,膜完整,無腫脹,微絲、微管排列整齊;APP/PS1組海馬神經元細胞數目較少,線粒體結構破壞,大部分線粒體出現腫脹,微管、微絲纏結,排列紊亂;其余3組海馬神經元均有不同程度的損傷,APP/PS1+EA組損傷較APP/PS1組明顯減輕。APP/PS1+LY294002組表現與APP/PS1組表現相似。說明EA對APP/PS1雙轉基因小鼠改善作用進行驗證,證實了EA可以減輕APP/PS1雙轉基因小鼠海馬神經元損傷,提高小鼠的學習和記憶能力。

通過免疫組化和WB檢測PI3K、AKT、GSK-3β蛋白表達情況,實驗結果表明APP/PS1+EA組較APP/PS1組的PI3K、AKT表達水平升高(P<0.05),GSK-3β的表達水平較APP/PS1組降低(P<0.05);APP/PS1+LY294002組PI3K、AKT表達量較APP/PS1組降低(P<0.05),但是GSK-3β的表達量較APP/PS1組的表達量升高(P<0.05);APP/PS1+EA+LY294002組PI3K、AKT表達水平較APP/PS1+LY294002組升高(P<0.05),GSK-3β的表達水平降低(P<0.05)。說明EA可以上調PI3K/AKT/GSK-3β信號通路中的關鍵蛋白PI3K、AKT的表達,下調GSK-3β的蛋白表達。PI3K抑制劑LY294002對APP/PS1雙轉基因小鼠的GSK-3β活性有負性的調節作用,其可能是通過激活PI3K/AKT/GSK-3β信號通路,活化后的AKT對GSK-3β進行磷酸化,磷酸化的GSK-3β抑制GSK-3β的活性,從而減輕AD的病例改變。實驗結果表明PI3K抑制劑LY294002對抗EA對AD的改善作用,但EA對AD的改善作用要遠大于抑制劑LY294002的對抗作用。該實驗結果與王耕銀[27]研究PI3K/AKT/GSK-3β通路在萊菔硫烷(Sulforaphane,SFN)調控糖尿病大鼠認知功能減退中的作用中應用PI3K抑制劑LY294002抵消了SFN的神經保護作用一致。

綜上所述,本次研究采用EA觀察應用PI3K/AKT/GSK-3β信號通路抑制劑LY294002對APP/PS1雙轉基因小鼠進行干預性研究,60天后通過Morris水迷宮APP/PS1雙轉基因小鼠的學習和記憶能力得到改善,提示EA具有改善神經元損傷的作用。透射電鏡結果檢測小鼠海馬神經元損傷,發現EA干預后的APP/PS1雙轉基因小鼠神經元數目增加。免疫組化、WB結果顯示信號通路相關蛋白表達水平發生變化,提示EA改善APP/PS1雙轉基因小鼠神經元損傷是通過激活PI3K/AKT/GSK-3β信號通路,上調信號通路相關蛋白PI3K、AKT的表達,下調GSK-3β蛋白的表達,GSK-3β活性降低后,會減輕GSK-3β對Nrf2的負性調節作用,Nrf2與Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白 1(Kelch-1ike ECH-associated protein l,Keap1)解離,離開細胞質后與ARE的啟動子結合,激活抗氧化反應的發生來實現的。