丹酚酸B抑制HuH-7細(xì)胞的Hippo/YAP通路機(jī)制研究

余新梅, 李利利, 張 傲, 鄧 潔, 楊 雁

(安徽醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、2.第一臨床醫(yī)學(xué)院、3.第二臨床醫(yī)學(xué)院,安徽 合肥 230032)

肝癌是最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤之一,是一種高度異質(zhì)性疾病。近年來(lái),肝癌的死亡率和發(fā)病率都呈上升趨勢(shì)[1]。在肝癌的治療藥物中,中藥由于其毒副作用小、安全經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)受到了越來(lái)越多的關(guān)注。丹酚酸B(salvianolic acid B,Sal B)是丹參中含量最豐富、生物活性最強(qiáng)的活性成分。它是一種酚類化合物,含有多種酚羥基,因此具有很強(qiáng)的抗氧化活性[2]。Sal B的抗氧化和抗纖維化特性已在先前的研究中得到證實(shí)[3]。并且Sal B已被證實(shí)能抑制肝癌細(xì)胞(HepG2)的遷移和侵襲,促進(jìn)肝癌細(xì)胞(Bel-7404 和SK-Hep-1)的自噬并誘導(dǎo)其凋亡[4-5]。為了進(jìn)一步明確Sal B的抗肝癌作用,本研究選擇了HuH-7 細(xì)胞探究Sal B是否通過(guò)Hippo/YAP信號(hào)通路抑制HuH-7 細(xì)胞。

Hippo/YAP信號(hào)通路是20年前在黑腹果蠅組織生長(zhǎng)篩選中首次發(fā)現(xiàn)的。它是抑制果蠅組織生長(zhǎng)的關(guān)鍵信號(hào)通路[6]。作為Hippo/YAP信號(hào)通路的核心,轉(zhuǎn)錄共激活因子Yes相關(guān)蛋白(transcriptional co-activators Yes-associated protein,YAP)和帶有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif,TAZ)是Hippo/YAP信號(hào)通路的關(guān)鍵效應(yīng)因子[7]。一旦Hippo/YAP信號(hào)通路被激活,其上游分子絲/蘇氨酸蛋白激酶(mammalian sterile 20-like kinase 1/2,MST1/2)就會(huì)被激活而磷酸化,從而磷酸化其下游分子大腫瘤抑制因子1/2(large tumor suppressor 1/2,LATS1/2)。最后導(dǎo)致YAP和TAZ被磷酸化并滯留在細(xì)胞質(zhì)中,從而抑制組織和細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。相反,Hippo/YAP信號(hào)通路一旦關(guān)閉,YAP和TAZ就被去磷酸化并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中,與TEAD結(jié)合激活細(xì)胞增殖、生存和遷移的轉(zhuǎn)錄程序[8]。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor,CTGF)作為YAP/TAZ/TEAD的關(guān)鍵靶基因,在肝癌組織中過(guò)表達(dá)[9]。近年來(lái),Hippo/YAP信號(hào)通路已成為抑制肝細(xì)胞增殖、存活和肝癌形成的重要途徑之一[10]。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株HuH-7細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供。

1.2 試劑TGF-β1粉末(貨號(hào):100-21)購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司。Sal B (純度≥ 98%,貨號(hào):PS0054-0020)購(gòu)自成都普思生物科技公司。MST1/2抑制劑XMU-MP-1(貨號(hào):T4212)購(gòu)自TargetMol Chemical 公司。p-TAZ(#59971)、TAZ(#72804)、MST1(#3682)、CTGF(#86641)、Smad2(#5339)、p-Smad2C(Ser465/467)(#18338)和PAI-1(#49536)等抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。p-MST1(#AF2367)、YAP(#AF6328)、p-YAP(Ser127)(#AF3328)、c-Myc(#AF6054)和GAPDH(#AF7021)等抗體購(gòu)自江蘇親和生物科技有限公司。p-Smad2L(Ser250/255)抗體由日本關(guān)西醫(yī)科大學(xué)Koichi Matsuzaki教授贈(zèng)送。

1.3 儀器Axio Observer 3型倒置熒光顯微鏡(ZEISS);ImageXpress MicroConfocal高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)平臺(tái)(Moleculaf Devices);DYY-10電泳儀(北京六一儀器廠);BX-53型正置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)HuH-7細(xì)胞,置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中將HuH-7細(xì)胞培養(yǎng)至可傳代的密度時(shí),使用胰酶消化,將細(xì)胞懸液接種在培養(yǎng)皿或孔板中。實(shí)驗(yàn)分組如下:對(duì)照組、TGF-β1組、TGF-β1+Sal B組、5 μmol·L-1XMU-MP-1組、5 μmol·L-1XMU-MP-1+Sal B組、10 μmol·L-1XMU-MP-1組、10 μmol·L-1XMU-MP-1+Sal B組。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組分別加入TGF-β1 (9 pmol·L-1)、Sal B (50 μmol·L-1)、5 μmol·L-1XMU-MP-1和10 μmol·L-1XMU-MP-1處理24 h。隨后,根據(jù)不同的檢測(cè)指標(biāo)分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的處理。Sal B和XMU-MP-1儲(chǔ)備液的配置:將適量的Sal B和XMU-MP-1粉末溶解在DMSO溶液中,制成50 000 μmol·L-1Sal B和10 000 μmol·L-1XMU-MP-1溶液,分裝后放入-80 ℃冰箱中保存。TGF-β1溶液的配置:將10 μg TGF-β1粉末溶于100 μL檸檬酸鹽緩沖液,并用900 μL PBS緩沖液稀釋,制成10 mg·L-1TGF-β1溶液,分裝后放入-80 ℃冰箱中保存。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力將HuH-7細(xì)胞以每孔100 μL細(xì)胞懸液接種在96孔板中,每孔細(xì)胞數(shù)約為5×103個(gè),每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后,每孔分別加入10 μL CCK-8溶液,繼續(xù)置于37 ℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育3 h。用酶標(biāo)儀在吸光度為450 nm處檢測(cè)HuH-7細(xì)胞的吸光度,并記錄各組的吸光度值。

1.6 EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖將HuH-7細(xì)胞以每孔500 μL細(xì)胞懸液接種在24孔板中,每孔細(xì)胞數(shù)約為2.5×105個(gè)。用BeyoClick cells EdU細(xì)胞增殖試劑盒檢測(cè)HuH-7細(xì)胞的增殖情況。將EdU溶液以適當(dāng)比例用DMEM稀釋,加入棄掉一半培養(yǎng)液的24孔板中。孵育2 h后,用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min,用含0.3% TritonX-100的PBS溶液通透細(xì)胞15 min,用click reaction solution避光孵育細(xì)胞30 min,用Hoechst33342對(duì)HuH-7細(xì)胞核進(jìn)行染色,同樣在避光條件下孵育10 min。孵育結(jié)束后用PBS溶液徹底洗滌細(xì)胞,用高內(nèi)涵細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)采集圖像。用ImageJ軟件對(duì)EdU染色檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移將HuH-7細(xì)胞以每孔2 mL細(xì)胞懸液接種于6孔板中,每孔細(xì)胞數(shù)約為1.2×106個(gè)。用無(wú)菌槍頭在細(xì)胞貼壁部分劃出一塊空白區(qū)域,用PBS洗掉脫落的細(xì)胞,置于倒置顯微鏡下拍照記錄0 h的細(xì)胞劃痕寬度。培養(yǎng)24 h后,用PBS洗掉漂浮的細(xì)胞,置于倒置顯微鏡下拍照記錄24 h的細(xì)胞劃痕愈合情況。根據(jù)劃痕寬度計(jì)算劃痕愈合率,劃痕愈合率=(W0 h-W24 h)/W0 h×100%。W0 h、W24 h分別表示0、24 h的細(xì)胞劃痕寬度。

1.8 免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)YAP和TAZ的表達(dá)將HuH-7細(xì)胞接種于置有細(xì)胞爬片的12孔板中,每孔接種1 mL細(xì)胞懸液,每孔細(xì)胞數(shù)約為5×104個(gè)。培養(yǎng)結(jié)束后,用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞30 min,用0.3% Triton X-100溶液通透細(xì)胞15 min,用quickblock 封閉液封閉細(xì)胞60 min,然后與一抗(YAP和TAZ抗體)在4 ℃下孵育過(guò)夜。第2天,加入二抗(Cy3標(biāo)記),在室溫下避光孵育1 h,然后與DAPI溶液在室溫條件下避光孵育10 min。最后用PBS溶液充分洗凈,取出細(xì)胞爬片,將細(xì)胞生長(zhǎng)面置于滴加抗熒光猝滅劑的載玻片上,并于熒光顯微鏡下采集圖像。采用Image J軟件對(duì)免疫熒光染色結(jié)果進(jìn)行分析。

1.9 Western blot檢測(cè)Hippo通路相關(guān)因子的表達(dá)將HuH-7細(xì)胞以每孔2 mL細(xì)胞懸液接種于6孔板中,每孔細(xì)胞數(shù)約為2×106個(gè)。培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加入100 μL裂解液(RIPA ∶蛋白酶抑制劑 ∶磷酸酶抑制劑 ∶EDTA=100 ∶1 ∶1 ∶1),置于冰上裂解30 min,離心取上清液。用BCA試劑盒測(cè)定蛋白樣品濃度后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,然后用印跡技術(shù)將整個(gè)細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂乳液室溫下封閉PVDF膜1 h,一抗孵育PVDF膜,置于4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜。使用以下一抗:YAP(1 ∶5 000),p-YAP(1 ∶5 000),TAZ(1 ∶1 000),p-TAZ(1 ∶1 000),p-MST1(1 ∶1 000),MST1(1 ∶1 000),CTGF(1 ∶1 000),GAPDH(1 ∶5 000)。將PVDF膜與二抗在室溫下孵育1 h(稀釋比例1 ∶5000)。用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光ECL試劑覆蓋PVDF膜后用ChemiDocTMMP成像系統(tǒng)采集圖片。采用ImageJ軟件對(duì)免疫印跡結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 Sal B對(duì)HuH-7細(xì)胞增殖能力的影響CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,TGF-β1和XMU-MP-1均能刺激HuH-7細(xì)胞的增殖。與5 μmol·L-1XMU-MP-1相比,10 μmol·L-1XMU-MP-1對(duì)HuH-7細(xì)胞的作用更為明顯。而Sal B的干預(yù)則可以逆轉(zhuǎn)TGF-β1和XMU-MP-1的促增殖作用(Fig 1B),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí), EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示,經(jīng)TGF-β1和XMU-MP-1處理后,EdU熒光標(biāo)記的增殖的細(xì)胞核數(shù)量明顯增加。但是,Sal B則抑制了這一趨勢(shì)(Fig 2),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 Sal B對(duì)HuH-7細(xì)胞遷移能力的影響細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,TGF-β1能夠明顯地刺激HuH-7細(xì)胞的遷移,Sal B則抑制了TGF-β1的促遷移作用,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但是XMU-MP-1對(duì)HuH-7細(xì)胞的遷移功能幾乎沒(méi)有影響,并且10 μmol·L-1XMU-MP-1對(duì)HuH-7細(xì)胞遷移功能的影響與5 μmol·L-1XMU-MP-1相比,這兩種濃度對(duì)HuH-7細(xì)胞遷移功能的影響差異不大(Fig 3)。

2.3 Sal B對(duì)YAP和TAZ熒光表達(dá)的影響免疫熒光染色結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,TGF-β1和XMU-MP-1顯著促進(jìn)YAP和TAZ的熒光表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。并且與5 μmol·L-1XMU-MP-1相比,10 μmol·L-1XMU-MP-1對(duì)YAP和TAZ熒光表達(dá)的促進(jìn)作用更為明顯。但是,TGF-β1和XMU-MP-1對(duì)YAP和TAZ熒光表達(dá)的促進(jìn)作用均被Sal B逆轉(zhuǎn)(Fig 4A-B)。

2.4 Sal B對(duì)Hippo/YAP信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,TGF-β1顯著增加了YAP、TAZ和CTGF的蛋白表達(dá)水平,而降低了p-MST1、MST1、p-YAP和p-TAZ的蛋白表達(dá)。而Sal B則抑制了TGF-β1的誘導(dǎo)作用,增加了p-MST1、MST1、p-YAP和p-TAZ的蛋白表達(dá),降低了YAP、TAZ和CTGF的蛋白表達(dá)(Fig 5-7)。

Fig 1 Effect of Sal B on viability of HuH-7 cells n=3)

如Fig 5所示,與對(duì)照組相比,XMU-MP-1處理明顯降低了p-MST1和MST1的蛋白表達(dá),成功地驗(yàn)證了XMU-MP-1的作用,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí),與對(duì)照組相比,XMU-MP-1作用后,YAP、TAZ和CTGF的蛋白表達(dá)增加,而p-YAP和p-TAZ的蛋白表達(dá)降低。并且與5 μmol·L-1XMU-MP-1相比,10 μmol·L-1XMU-MP-1對(duì)上述蛋白的作用更為明顯(Fig 5-7)。

3 討論

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Sal B能有效地抑制TGF-β1刺激的HuH-7細(xì)胞的增殖和遷移。此外,本研究還證實(shí)了Sal B對(duì)HuH-7細(xì)胞的抑制作用可能與Hippo/YAP信號(hào)通路有關(guān)。

Fig 2 Effect of Sal B on proliferation of

Fig 3 Effect of Sal B on migration of HuH-7 cells n=3)

HuH-7細(xì)胞系最早是在一名攜帶丙型肝炎病毒的日本男子身上發(fā)現(xiàn)的。從那時(shí)起,HuH-7細(xì)胞為丙型肝炎病毒的詳細(xì)分子研究提供了一條新的途徑[11]。已有研究證明[4],Sal B可以通過(guò)調(diào)節(jié)Hippo/YAP信號(hào)通路抑制肝癌HepG2細(xì)胞。但一種藥物可能對(duì)不同的細(xì)胞系有不同的影響。例如,抗病毒藥物奧司他韋可以促進(jìn)HepG2細(xì)胞的凋亡,但不能促進(jìn)HuH-7細(xì)胞的凋亡[12]。Takuma等[13]對(duì)幾種肝癌細(xì)胞系(包括HuH-7和HepG2細(xì)胞)進(jìn)行體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)了HuH-7細(xì)胞對(duì)雷戈拉非尼最敏感。此外,我們還發(fā)現(xiàn),在鐵代謝、藥物篩選和肝毒性研究方面,HuH-7細(xì)胞可能比HepG2細(xì)胞具有更大的優(yōu)勢(shì)[11,14]。可能是Lin等[15]對(duì)幾種肝癌細(xì)胞進(jìn)行了肝毒性測(cè)試,發(fā)現(xiàn)HuH-7細(xì)胞與人類原代肝癌細(xì)胞具有最高的相似性。因此,本研究選擇了HuH-7細(xì)胞,為Sal B抗肝癌作用的研究提供更全面的證據(jù)。并且本研究也發(fā)現(xiàn)了Sal B對(duì)TGF-β1和MST1/2抑制劑刺激的HuH-7細(xì)胞的遷移能力的影響與HepG2細(xì)胞相比,確實(shí)存在一些差別。在先前的研究中[4],MST1/2抑制劑可以很明顯的促進(jìn)HepG2細(xì)胞的遷移,并且受到不同濃度的MST1/2抑制劑的影響,Sal B則可以抑制MST1/2抑制劑的促增殖作用。但是經(jīng)過(guò)我們多次的實(shí)驗(yàn)論證,MST1/2抑制劑對(duì)HuH-7細(xì)胞遷移能力的影響很微弱,就算加大MST1/2抑制劑的濃度,也無(wú)法起到很明顯的作用。我們猜測(cè)HuH-7細(xì)胞遷移能力對(duì)MST1/2抑制劑的不敏感可能與HuH-7細(xì)胞的高分化特性有關(guān)。

Fig 4 Effect of Sal B on YAP and TAZ expressions in HuH-7 cells n=3)

Fig 5 Effect of Sal B on expressions of p-MST1 and MST1 proteins in HuH-7 cells n=3)

Fig 6 Effect of Sal B on expressions of p-YAP, YAP, p-TAZ, and TAZ proteins in HuH-7 cells n=3)

TGF-β1與肝纖維化、肝癌等肝病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來(lái),它在肝癌組織和癌旁基質(zhì)中的上調(diào)表達(dá)引起了研究人員的興趣[16]。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇TGF-β1誘導(dǎo)HuH-7細(xì)胞建立體外肝癌模型。MST1/2是Hippo信號(hào)通路的上游分子。當(dāng)細(xì)胞受到外界信號(hào)的刺激時(shí),MST1/2被激活從而激活Hippo信號(hào)通路。LATS1/2受激活的MST1/2的影響而被磷酸化,從而促進(jìn)YAP和TAZ的磷酸化和降解。相反,當(dāng)MST1/2缺失或被抑制時(shí),YAP和TAZ進(jìn)入細(xì)胞核并與TEAD結(jié)合,激活增殖和抗凋亡基因,如CTGF基因,以加速肝癌的增殖和發(fā)展[17]。因此,本實(shí)驗(yàn)采用5 μmol·L-1和10 μmol·L-1MST1/2抑制劑來(lái)探討在當(dāng)MST1/2被抑制,Sal B對(duì)HuH-7細(xì)胞的抑制作用是否通過(guò)調(diào)節(jié)Hippo/YAP信號(hào)通路。

YAP/TAZ是Hippo信號(hào)通路的下游效應(yīng)器,在動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中調(diào)節(jié)器官生長(zhǎng),促進(jìn)受損器官的再生。然而,YAP/TAZ的過(guò)度激活可能導(dǎo)致小鼠癌癥的發(fā)生[18]。本研究發(fā)現(xiàn),在HuH-7細(xì)胞中,TGF-β1和XMU-MP-1明顯降低了p-MST1、MST1、p-YAP和p-TAZ的蛋白表達(dá)水平,而增加了YAP、TAZ和CTGF的蛋白表達(dá)水平,其中10μmol·L-1XMU-MP-1的作用更為明顯。而Sal B可抑制TGF-β1和XMU-MP-1的刺激作用,降低YAP、TAZ和CTGF的蛋白水平,增加p-MST1、MST1、p-YAP和p-TAZ的蛋白水平。免疫熒光染色同樣顯示,Sal B可抑制YAP和TAZ的表達(dá)。這些結(jié)果都表明,Hippo信號(hào)通路的上游分子MST1被XMU-MP-1抑制,失活的MST1促進(jìn)YAP和TAZ去磷酸化后入核,進(jìn)而介導(dǎo)靶基因CTGF的表達(dá),促進(jìn)肝癌的發(fā)生。而Sal B可減弱XMU-MP-1的作用,提示Sal B可能通過(guò)增強(qiáng)MST1/2的活性,激活YAP/TAZ的磷酸化,從而減少YAP/TAZ入核。

Fig 7 Effect of Sal B on expressions of CTGF protein in HuH-7 cells n=3)

Fig 8 Diagram of regulatory mechanism of Sal B and XMU-MP-1 in Hippo/YAP pathway in HuH-7 cells

在以上討論的基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步提出了Sal B除了上調(diào)MST1/2的活性外,是否還有其他途徑來(lái)減輕MST1/2抑制劑的影響,如抑制MST1/2的蛋白酶體活性或減少M(fèi)ST1/2的泛素化降解。這些問(wèn)題需要我們?cè)诓痪玫膶?lái)進(jìn)一步探索。

綜上所述,本研究證實(shí)了Sal B能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HuH-7細(xì)胞的增殖和遷移。我們推測(cè)Sal B的抗肝癌作用可能與激活Hippo/YAP信號(hào)通路有關(guān)。然而,關(guān)于Sal B激活Hippo/YAP信號(hào)通路具體的分子機(jī)制還沒(méi)有明確的證據(jù),需要進(jìn)一步研究。本研究為Sal B的抗肝癌作用提供了一些數(shù)據(jù),為其抗肝癌機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。