雷公藤多苷納米粒的制備及其對關節炎大鼠的治療作用

王志榮,李 嫚,張振強,閆 敏,武香香,曾華輝

(河南中醫藥大學中醫藥科學院,河南 鄭州 450046)

雷公藤在中醫上廣泛用于治療RA,在《中華本草》中描述稱“祛風除濕,消腫止痛,活血通絡,清熱解毒”[6]。半萜類、二萜類化學成分是雷公藤所含的主要成分,這些藥效對肝臟、腎臟、心臟、生殖系統、血液系統等都存在很大的毒副作用,這使得雷公藤及其制劑在治療RA過程中有一定限制[7]。雷公藤多苷(tripterygium glycosides,TG)是從雷公藤根部提取的有效成分,中國最早研究和使用的抗炎和免疫調節中藥之一,被稱為“中國首創植物新藥”,不僅保留了雷公藤的免疫抑制作用,而且還消除了其許多有毒成分,沒有其他中藥可以替代它在RA治療中的主要作用[8-9]。但研究發現隨著日用劑量加大、用藥時間延長,使用雷公藤多苷治療RA毒副作用的發生風險也會隨之增加,對肝、腎會造成一定程度的損傷[10]。因此,我們需要探索一種有效、安全的藥物載體來提高雷公藤多苷的藥理性能。

目前多從藥物炮制、中藥配伍、劑量改變、劑型修飾和常規檢測與預防等方面進行探索,來提高藥物應用的安全性。納米制劑被廣泛用于新劑型研發中,具有明顯的優勢,如增強生物相容性和靶向性,增強生物分布和優化對靶器官的治療效果,提高藥物療效和減輕相關器官的毒副作用[11]。為了降低TG的毒性、在抗RA中更好發揮其免疫抗炎等作用,本研究通過將其制成雷公藤多苷納米粒,建立膠原誘導型(collagen-induced arthritis,CIA)動物模型,研究其對RA的治療作用。

1 材料

1.1 實驗動物♂SD大鼠,6～8周齡,體質量(180±20)g,購自北京華阜康有限公司,許可證號為SCXK(京)2019-0008。購回后在河南中醫藥大學動物中心SPF級條件下飼養。符合動物倫理委員會的認可。

1.2 藥品與試劑聚乙二醇6k-腙鍵-甲氧聚己內酯2k(PCL6k-HYD-MPEG2k)(西安齊岳生物科技有限公司,批號:QM02202103),雷公藤多苷片(上海復旦復華藥業有限公司,國家準字Z31020415),雷公藤多苷(西安昊軒生物科技有限公司,LGTHS20180722,純度99%),雷公藤多苷納米顆粒(實驗室制備)。ELISA試劑盒TNF-α、IL-6和IL-1β(欣博盛生物科技股份有限公司,批號:R220617-102b、R220617-003b、R220617-007b),牛Ⅱ型膠原、完全弗氏佐劑(美國Chondrex公司,批號:210532、210574)。天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)試劑盒,尿素氮(BUN)試劑盒、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)試劑盒和肌酐(CRE)試劑盒(南京建成生物工程所,批號分別為:20220518、20220629、20220519、20220521)。

1.3 主要儀器酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司,型號:1510-02820C)、粒徑分析儀(Brookhaven Instruments,型號:250144),電子天平(梅特勒-托儀多儀器上海有限公司,型號:AL204)、透射電子顯微鏡[型號:JEM-1230(HC)]。

2 方法

2.1 TG-NPs的制備方法和質量控制稱取雷公藤多苷6 mg、PCL6k-HYD-MPEG2k 30 mg分別加入適量丙酮溶解后混合。然后放置于燒瓶中,40 ℃條件下旋轉蒸發直至底部出現均勻薄膜。轉移至真空干燥箱20 ℃條件下放置12 h,除去丙酮。加入3 mL蒸餾水,800 r·min-1磁力攪拌2 h促進薄膜水合,250 W下超聲處理5 min,促進納米粒分散,然后過0.22 μm微孔濾膜,即得雷公藤多苷納米粒(TG-NPs)。用透射電鏡觀察納米粒的形態,動態光散射法檢測納米粒的粒徑,高效液相色譜法(HPLC)測定納米粒中的藥物含量,測定包封率和納米粒性質的穩定性,用于后續實驗。

2.2 CIA模型的建立及分組給藥在冰浴條件下將完全弗氏佐劑與牛Ⅱ型膠原1 ∶1充分乳化。在大鼠的腳趾、尾部、背部3個部位經皮注射混合乳劑,每只0.3 mL[12]。14 d后重復上述步驟。二次免疫后7 d,免疫組大鼠的腳趾腫脹、關節炎癥指標均明顯升高,提示CIA模型建立成功。再隨機將其分為3組,即CIA模型組(Model)、雷公藤多苷組(TG)及雷公藤多苷納米粒組(TG-NPs)。TG組每天灌胃6.25 mg·kg-1的雷公藤多苷片[13],TG-NPs組尾靜脈注射6.25 mg·kg-1的雷公藤多苷納米粒,給藥周期為2天1次,給藥的第1天記為d 0,正常組、模型組給予等量的生理鹽水,持續20 d。

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2.3 一般情況監測從第2次免疫后的第7天開始,每2 d對各組大鼠的進食、精神與活動等進行監測和記錄,并檢測各給藥組對CIA大鼠體質量的影響。

2.4 大鼠足趾腫脹度與關節炎指數的測定免疫后第7天開始,每隔1天用游標卡尺測量各組大鼠雙腳的腫脹情況,進行評分并計算大鼠的關節炎指數(arthritis index,AI),AI由所有關節炎指數之和構成,最高分值為16分。0分:足趾正常,無關節紅腫;1分:足小趾關節紅腫;2分:趾關節、足趾的關節紅腫;3分:踝關節嚴重紅腫,或踝以下足爪紅腫;4分:踝關節和所有足趾腫脹,關節嚴重變形。

2.5 臟器指數的測定將大鼠處死后,取出其心臟、肝、腎、脾和睪丸等組織,用電子天平稱重各臟器的質量。臟器指數=臟器質量(g)/大鼠體質量(g)×100%。

2.6 大鼠臟器組織的病理形態學觀察組織在多聚甲醛中固定24 h,用常規方法制備石蠟切片(厚度為3 μm)后,用蘇木精-伊紅(HE)染色,在顯微鏡下觀察組織的形態學變化。

2.7 大鼠膝關節與踝關節滑膜組織病理形態學觀察用藥20 d后,進行麻醉,腹主動脈采血,將血標本靜置后以3 000 r·min-1離心10 min,取上層血清保存。之后取大鼠左后肢的膝關節和踝關節,用4%多聚甲醛溶液固定,切片并行HE與TUNEL染色,觀察病理變化。

2.8 大鼠血清中ALT、AST、BUN、CRE及TNF-α、IL-1β、IL-6含量的測定ALT、AST用微板法檢測,BUN用比色法,CRE用肌氨酸氧化酶法。TNF-α、IL-1β、IL-6的水平按照ELISA試劑盒的說明書,每項指標檢測均嚴格按照各自試劑盒的說明進行,均用酶標儀檢測。

3 結果

3.1 TG-NPs的制備及質量評價

3.1.1TG-NPs的形態及平均粒徑 在電鏡下觀察到納米粒分布均勻,呈球形,有典型的環狀結構。動態光散射法測定TG-NPs的粒徑為(111.81±1.54) nm,(n=3)。PDI為0.157±0.009,表面帶負電荷,Zeta電位為(-20.85±2.74) mV,見Fig 1。

3.1.2TG-NPs包封率測定 使用高效液相法(HPLC)測定納米粒中的藥物含量,以TP為標準(加標),在1～100 mg·L-1濃度下,TP有良好的線性關系y=18 744x-1 128.7 (r=0.999 9)。將TG-NPs超濾前總濃度及超濾后上層及下層液體濃度代入公式計算,得包封率為(73.22±0.58)%,(n=3)。

3.1.3TG-NPs的穩定性測定 為考察TG-NPs的穩定性,將TG-NPs分別存放在4 ℃冰箱和25 ℃環境下。結果如Fig 2所示,在4 ℃條件下,納米粒的粒徑、PDI及Zeta電位都保持在一個相對穩定的狀態,當納米粒保存在25 ℃條件下,粒徑及PDI變化程度較大,表明7 d內納米粒可以在4 ℃條件下穩定存在,且直至20 d基本上無變化。為模擬體內環境,將TG-NPs分別加入PBS和DMEM培養基(含10%FBS),并置于恒溫搖床中(100 r·min-1,37 ℃),于特定時間點檢測粒徑、PDI及Zeta電位。結果顯示,在PBS中,粒徑與在去離子水中相比有所增加,但還是保持在相對穩定的狀態,Zeta電位均有較為明顯的下降;在DMEM培養基(含10%FBS)中,納米粒的粒徑及Zeta電位在去離子水中有所下降,PDI較在去離子水中明顯升高。

3.2 TG-NPs對大鼠體質量的影響免疫后,大鼠會出現乏力、尿量增多、食欲下降等癥狀。如Fig 3顯示,與正常組相比,其余各組大鼠體質量明顯降低(P<0.01);給藥治療后,TG-NPs組大鼠體質量相較于模型組明顯提高(P<0.05)。

3.3 TG-NPs對大鼠足趾腫脹度及關節炎指數的影響與正常組比較,各組大鼠足趾腫脹度與關節炎指數均明顯增加(P<0.01);與模型組比較,給藥組大鼠腫脹度與關節炎指數降低(P<0.05),其中TG-NPs組療效優于TG組(P<0.05),如Fig 4。

Fig 1 Morphology, size distribution and potential distribution of nanoparticles under transmission electron microscopy

Fig 2 TG-NPs size, PDI, Zeta in different environments n=3)

Fig 3 Changes of body weight in each group n=6)

3.4 TG-NPs對大鼠臟器指數的影響與正常組相比,各組大鼠的脾、腎、睪丸指數均明顯升高,差異具有統計學意義(P<0.05,P<0.01);各組的肝指數均降低,差異沒有顯著性。見Tab 1。

3.5 TG-NPs對大鼠心臟、肝、脾、腎和睪丸組織病理形態學的影響心臟組織病理學觀察結果顯示:大鼠各組的心肌細胞形態正常,排列清晰,無明顯差異。肝臟組織病理學觀察結果顯示:大鼠肝細胞正常組無腫脹變形,肝索排列整齊;模型組排列較紊亂,部分細胞稍腫脹呈空泡狀,炎性細胞浸潤;TG組肝細胞排列紊亂,胞質疏松呈網狀,炎性細胞浸潤明顯;TG-NPs組肝細胞排列較整齊、炎性細胞浸潤不明顯,形態接近正常。脾臟組織病理學觀察結果顯示,正常組脾臟小體呈圓形,結構清晰;模型組白髓結構紊亂,有大量凋亡小體;TG組白髓結構稍紊亂,有部分凋亡小體;TG-NPs組較TG組明顯改善,白髓損傷明顯減少。腎臟組織病理學觀察結果顯示:正常組與模型組腎小管細胞排列緊密,腎臟腎小球結構完整,管腔清晰可見;TG組腎小球萎縮明顯,間質內纖維組織彌漫性增多。與TG組相比,TG-NPs組腎組織病變明顯減輕。睪丸組織病理學觀察結果顯示:正常組大鼠睪丸形態正常,細胞層次寬,間質細胞發育良好,管腔內絲狀精子細胞排列緊密,模型組大鼠管腔內絲狀精子細胞少于正常對照組。在TG的毒性作用下,大鼠曲細精管出現萎縮變形,且管腔內精子細胞數量明顯少于正常組。與TG組相比,TG-NPs組大鼠的睪丸組織病變有所減輕。見Fig 5。

Tab 1 Heart, liver, spleen, kidney and testis indexes of rats in each n=6, %)

Fig 4 Changes in swelling degree of left (A) and right (B) foot and scores of arthritis index (C) in each group n=6)

Fig 5 Pathological micrograph of heart tissue of each group of mice stained with HE (×200)

3.6 TG-NPs對大鼠膝、踝關節滑膜HE染色的影響如Fig 6所示,正常組大鼠足趾正常,模型組大鼠足趾與踝關節腫脹明顯,并伴有嚴重變形。TG組相比模型組腫脹較輕,變形不明顯,TG-NPs組腫脹程度明顯改善。從HE染色觀察膝踝關節病理學變化,正常組細胞排列均勻整齊,細胞核清晰可見,著色均勻,未見滑膜增厚和血管新生;而模型組細胞排列雜亂,滑膜重度增生,部分細胞核壞死,著色不均,可見缺損和血管翳形成;TG相比于模型組,輕度增生,輕度血管新生及部分炎癥細胞浸潤;TG-NPs組細胞排列相對整齊,著色均勻,沒有明顯的增生,血管新生少,炎癥細胞浸潤少。提示經過治療后,TG-NPs組對大鼠滑膜改善作用最為明顯。

3.7 TG-NPs對大鼠膝關節和踝關節滑膜TUNEL染色的影響如Fig 7所示,大鼠滑膜TUNEL染色后,陽性凋亡細胞核為棕黃色。模型組的滑膜細胞有少量的凋亡,TG組相較于模型組滑膜細胞凋亡指數升高(P<0.05),TG-NPs組相較于其他組滑膜細胞凋亡指數升高明顯(P<0.01)。

3.8 TG-NPs對大鼠血清中AST、ALT、BUN、CRE和TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響如 Tab 2所示,與正常組相比,除BUN之外,所有模型組均有明顯增加(P<0.05),TG-NPs組大鼠中的ALT、BUN、CRE水平相較于模型組明顯降低(P<0.05),CRE水平相較于TG組下降明顯(P<0.05)。大鼠血清中的炎癥因子,相比于正常組,模型組大鼠中TNF-α、IL-1β含量均明顯增加(P<0.01),TG-NPs組均明顯低于模型組(P<0.05),且效果優于TG組。見Tab 3。

Fig 6 Photographs of right hind foot and histopathological analysis of knee and ankle (HE,×200)

Tab 2 Levels of ALT, AST, BUN and CRE in serum of each group n=6)

Tab 3 Influence of serum inflammatory

4 討論

RA是一種慢性全身性免疫疾病,通常表現為滑膜組織中炎癥因子的過度分泌、關節軟骨的侵蝕和血管翳的形成。 與其他幾種關節炎模型相比,大鼠膠原蛋白誘導的Ⅱ型關節炎(CIA)模型在病理學上與人類RA相似,目前普遍被作為RA的最佳模型[14]。在本研究中,通過皮下注射混合乳劑,在背部和掌墊的多個部位,建立大鼠CIA模型。 與正常組相比,模擬大鼠表現為體質量減輕,尿量和食物消耗減少,腳趾關節腫脹變形,影響正常的活動,關節炎指數增加,表明CIA模型成功。

滑膜組織中炎癥因子的過度產生是RA免疫病理的一個重要因素。這些因素包括TNF-α、IL-1β和IL-6。TNF-α已被證明可引起RA患者的各種T細胞功能障礙,在RA的活動期和晚期其分泌量增加,導致炎癥反應增加,骨和關節破壞惡化[15]。IL-1β調節幾種炎癥因子的表達,促使炎癥因子的協同增加。另一個重要的促炎因子IL-6作用于中性粒細胞,誘發炎癥并可能導致關節破壞[16]。成纖維滑膜細胞(fibroblast-likesynoviocyte,FLS)凋亡不足在RA的發病機制中起著重要作用:當RA患者的微環境發生改變時,FLS無法凋亡,開始異常增殖,釋放出大量的細胞因子,刺激滑膜細胞增殖、嚴重的炎癥細胞浸潤、血管翳形成和隨后的骨和關節侵蝕[17]。

納米粒是由天然或合成的高分子材料制成。納米載體可以將治療藥物運送到靶點,改善生物分布、藥代動力學、穩定性和可溶性,并減少藥物的毒副作用。本實驗通過制備TG-NPs,得到符合小鼠尾靜脈的理想粒徑[(111.81±1.54) nm],相較TG原藥,納米粒藥物組的生化指標AST、ALT、BUN、CRE均明顯下降,且有效減輕了TG對腎或肝等臟器的有害影響(Fig 5),說明TG以納米粒作為載體后能起到明顯減毒作用,明顯提高TG的用藥安全性。同時,TG-NPs治療組大鼠的足趾腫脹程度和關節炎指數下降,體質量增加。TNF-α、IL-1β、IL-6的表達明顯降低,其表達與大鼠的足趾腫脹、AI指數嚴重程度成正比,而與體質量成負比。此外,還觀察到納米粒組大鼠凋亡指數明顯升高,炎性細胞浸潤減少。表明本實驗制備的雷公藤多苷納米粒可能通過抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達,促進滑膜細胞凋亡,減輕CIA大鼠的炎癥反應,保護軟骨和關節滑膜,達到改善RA的目的。

綜上所述,TG-NPs對CIA有較好的治療作用,單獨使用TG的毒副作用得到改善。這證明了所建立的納米給藥系統與其他常規藥物相比,對RA具有優越的效果和較高的藥物安全性,對今后的研究和開發具有參考價值。