液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析秦巴硒菇提取物活性成分及其治療慢性粒細(xì)胞白血病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

王東萍,葛萬文,邵 晶,孫延慶

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,甘肅 蘭州 730000;2. 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院, 甘肅 蘭州 730030;3. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,甘肅 蘭州 730000;4. 甘肅省人民醫(yī)院, 甘肅 蘭州 730000)

慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是一種骨髓增殖性造血系統(tǒng)惡性腫瘤,由9號和22號染色體易位所致,易位產(chǎn)生了費(fèi)城染色體[1]。該易位編碼具有酪氨酸激酶活性的蛋白,酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors, TKIs) 的出現(xiàn)明顯改善了CML患者的治療和預(yù)后,但在治療過程中約有33%的患者出現(xiàn)了耐藥[2]。在治療過程中藥物的副作用、停藥后疾病復(fù)發(fā)、耐藥的出現(xiàn)導(dǎo)致治療失敗疾病進(jìn)展等仍是該疾病治療過程中需重點(diǎn)解決的問題。

植物源性天然產(chǎn)物在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中具有顯著的藥理作用,近年來受到廣泛關(guān)注。食用和藥用蘑菇中因含有凝集素、精氨酸、麥角甾醇、β-葡聚糖等多種活性物質(zhì),所以具有促造血,抗炎,抗過敏,抗腫瘤,抗感染等多種生物學(xué)活性[3]。秦巴硒菇(Agaricus blazei Murill, AbM)是一種食藥兼用的真菌,秦巴硒菇提取物是從秦巴硒菇中獲得的酸性RNA蛋白質(zhì)復(fù)合物,在前期的研究中發(fā)現(xiàn),該提取物表現(xiàn)出對多發(fā)性骨髓瘤[4]、白血病[5]等的抗腫瘤活性,與化療藥物3′-疊氮-3′-脫氧胸腺核苷抗胃癌亦有協(xié)同和增敏作用[6]。

隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)為揭示中醫(yī)藥的復(fù)雜機(jī)制以及藥物、靶點(diǎn)和疾病之間的相互關(guān)系提供了一種新的方法,有助于觀察藥物對疾病的治療作用[7]。本研究以液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)分析明確秦巴硒菇提取物中的活性成分,應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接相結(jié)合的方法預(yù)測秦巴硒菇提取物治療CML的可能作用機(jī)制,并通過體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

1 材料

1.1 試劑與儀器胎牛血清:購自以色列BI公司;CCK-8試劑盒:購自奧默生物技術(shù)有限公司;SDS-PAGE試劑盒:購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司;PVDF膜:購自德國Merck millipore公司;Akt、mTOR、β-actin一抗:購自美國Abcam公司;PI3K、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR一抗:購自美國CST公司。超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀1290 UHPLC Q Exactive Focus(美國Agilent公司產(chǎn)品),色譜柱ACQUITY UPLC BEH C181.7 μm 2.1×100 mm Col(美國Waters公司產(chǎn)品),Mulltiskan FC型酶標(biāo)儀(美國ThermoFisher公司產(chǎn)品),Tanon 5200 Multi 全自動化學(xué)發(fā)光圖像處理系統(tǒng)(上海天能科技有限公司產(chǎn)品)。

1.2 細(xì)胞株及其培養(yǎng)K562細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存;K562細(xì)胞置于含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,在37℃、5% CO2且飽和濕度的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長狀況,取細(xì)胞狀態(tài)良好處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 秦巴硒菇提取物秦巴硒菇:購自陜西紫陽有限公司,秦巴硒菇提取物的分離純化由中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成,具體提取方法已有報(bào)道[6]。簡而言之,將500 g干燥除雜的秦巴硒菇粉碎,通過乙醇沉淀、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析對提取物進(jìn)行純化得到4.86 g提取物,滅菌后貯存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 秦巴硒菇提取物主要成分篩選及成分靶點(diǎn)的預(yù)測稱取100 mg樣本,加入500 μL提取液(甲醇 ∶水=4 ∶1);渦旋30 s,45 Hz勻漿4 min,冰水浴超聲1 h;-40 ℃靜置1 h后將樣本在4 ℃,12 000 r·min-1離心15 min;小心地取上清經(jīng)0.22 μmol·L-1微孔濾膜過濾;后上機(jī)檢測。通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www. swisstargetprediction.ch/) 檢索秦巴硒菇提取物中活性成分相對應(yīng)的潛在作用靶點(diǎn),去除重復(fù)項(xiàng),獲得各活性成分的靶點(diǎn)。

2.2 疾病靶點(diǎn)的獲取從GeneCards (https://www.genecards.org/), DisGeNET (https://www.disgenet. org/)數(shù)據(jù)庫檢索與CML相關(guān)的靶點(diǎn),將不同數(shù)據(jù)庫的靶點(diǎn)合并去重,得到CML的相關(guān)靶點(diǎn)基因。將藥物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集和疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集取交集,繪制韋恩圖,即為秦巴硒菇提取物治療CML的共同靶點(diǎn)。

2.3 蛋白-蛋白互相作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建為了進(jìn)一步分析秦巴硒菇提取物治療白血病的關(guān)鍵靶點(diǎn),將獲得的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING (https://cn.string-db.org/)數(shù)據(jù)庫,以combined score >0.9為篩選條件,獲得各靶點(diǎn)相互作用關(guān)系,將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

2.4 基因功能與通路富集分析為明確秦巴硒菇提取物治療CML靶點(diǎn)的基因功能及主要信號通路,將獲取的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp) 進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析。GO富集分析包括三個(gè)主要組成部分生物過程(biological process, BP),分子功能(molecular function, MF)以及細(xì)胞組分(cellular component, CC)。KEGG通路富集分析用于闡明秦巴硒菇提取物治療CML的潛在作用機(jī)制。本研究根據(jù)P值大小,分別選擇前10位的GO條目及前20位的KEGG通路,利用在線工具繪制氣泡圖。

2.5 分子對接從PDB(https://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫獲得蛋白大分子結(jié)構(gòu),通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得藥物活性成分的SDF結(jié)構(gòu),DockThor (https:// dockthor.lncc.br/v2/) 進(jìn)行分子對接[8],對接結(jié)果通過Pymol軟件進(jìn)一步處理。

2.6 CCK-8法測定K562細(xì)胞的IC50取對數(shù)生長期細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度,以每孔5×103個(gè)接種于96孔板中,以本課題組前期研究為依據(jù),設(shè)置實(shí)驗(yàn)組藥物濃度為0.5、1、1.5、2、2.5、3 g·L-1,同時(shí)設(shè)立對照組(常規(guī)培養(yǎng),不加藥物)和空白組(加入培養(yǎng)基,不加細(xì)胞)。細(xì)胞置于37 ℃,5% CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h和48 h。每孔各加入10 μL CCK-8試劑共孵育2 h,Mulltiskan FC型酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度。使用GraphPad Prism 8計(jì)算其IC50值。

2.7 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)水平K562細(xì)胞經(jīng)不同濃度藥物(0、0.5、1 g·L-1)處理后收集,預(yù)冷PBS洗滌,加入細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞,4 ℃條件下,12 000 r·min-1、30 min離心,收集上清,BCA法測定各組蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5% BSA室溫封閉2 h,一抗4 ℃條件下孵育過夜。TBST洗滌后加入二抗,室溫孵育1 h,TBST漂洗。ECL超敏發(fā)光劑顯色后經(jīng)Tanon 5200 Multi全自動化學(xué)發(fā)光圖像處理系統(tǒng)分析相關(guān)蛋白表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 秦巴硒菇提取物化學(xué)成分的篩選秦巴硒菇提取物利用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測。使用控制軟件(Xcalibur, Thermo Fisher Scientific)控制下基于FullScan-ddMS2功能進(jìn)行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。將數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄、分析和處理,結(jié)果見Fig 1。通過LC-MS檢測發(fā)現(xiàn)秦巴硒菇提取物的主要化合物共有126個(gè),運(yùn)用Swiss Target Prediction網(wǎng)站檢索藥物成分靶點(diǎn)并去重后共獲得相關(guān)靶點(diǎn)1 150個(gè)。

Fig 1 Ion flow diagram of LC-MS

3.2 靶點(diǎn)基因的獲取以“CML”為關(guān)鍵詞,在GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索疾病靶點(diǎn),依據(jù)相關(guān)性得分(Relevance score ≥ 1),共檢索到靶點(diǎn)基因數(shù)目357個(gè)。在DisGeNET數(shù)據(jù)庫中共檢索到疾病靶點(diǎn)基因503個(gè),兩個(gè)數(shù)據(jù)庫篩除重復(fù)靶點(diǎn)后共獲得靶點(diǎn)數(shù)718個(gè)。將活性成分的治療靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)取交集,獲得172個(gè)共同靶點(diǎn)。見Fig 2。

3.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將秦巴硒菇提取物靶點(diǎn)基因與CML靶點(diǎn)基因通過繪制韋恩圖,將所得的172個(gè)交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫,獲取靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。運(yùn)用CytoScape軟件,繪制出PPI網(wǎng)絡(luò)圖。見Fig 3。連接相關(guān)靶點(diǎn)最多的前3種成分分別是楊芽黃素、異歐前胡素、歐前胡素。使用cytoHubba插件獲得PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心子網(wǎng)絡(luò)。其中,TP53具有最高的度值,能與272個(gè)蛋白發(fā)生相互作用關(guān)系;其次為GAPDH、STAT3、CTNNB1、AKT1等,揭示這些靶點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用,是秦巴硒菇提取物成分治療白血病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。見Fig 4。

Fig 2 Venn diagram of drug targets and disease targets

Fig 3 PPI network

3.4 GO和KEGG通路富集分析通過DAVID數(shù)據(jù)庫對交集靶基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集分析分別顯示潛在靶點(diǎn)顯著富集的前10個(gè)條目,其中BP與信號傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)磷酸化、細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等過程相關(guān)。參與的MF包括蛋白質(zhì)及ATP結(jié)合,蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等。見Fig 5。KEGG主要涉及癌癥通路、PI3K/Akt、MAPK信號通路、細(xì)胞凋亡等信號通路。見Fig 6。

3.5 分子對接利用分子對接技術(shù),將秦巴硒菇提取物中的主要活性成分分別與PI3K/Akt/mTOR 信號通路中的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行對接:PI3K(PDB:2v1y)、AKT1(PDB:1h10)、mTOR(PDB:6m4u)。結(jié)合能越小提示對接效果越好。結(jié)果顯示三種主要成分與PI3K/Akt/mTOR信號通路中的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白都有良好的結(jié)合能力,可形成結(jié)合能低、活性高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的構(gòu)象。見Tab 1,Fig 7。

Fig 4 Core candidate target genes

Fig 6 KEGG enrichment analysis

Tab 1 Molecular docking binding energies(kcal/mol)

3.6 秦巴硒菇提取物抑制K562細(xì)胞增殖CCK-8法檢測結(jié)果顯示:秦巴硒菇提取物對K562細(xì)胞有抑制增殖的作用,呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性,作用于K562細(xì)胞24 h和48 h的IC50分別為1.86和1.48 g·L-1,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見Fig 8。

3.7 K562細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)比較采用Western blot法檢測PI3K,Akt,mTOR蛋白表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示秦巴硒菇提取物對PI3K、Akt、mTOR蛋白表達(dá)水平影響不大。進(jìn)一步檢測蛋白磷酸化水平,結(jié)果表明在不同濃度的秦巴硒菇提取物干預(yù)作用下,能以劑量依賴性的方式下調(diào)p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白的表達(dá)。見Fig 9。

4 討論

在本研究中,通過液相色譜質(zhì)譜分析秦巴硒菇提取物中的化合物,共發(fā)現(xiàn)126種化合物。在這項(xiàng)研究中,楊芽黃素是最顯著的生物活性化合物,其次是異歐前胡素、歐前胡素等,提示為秦巴硒菇提取物的核心成分。楊芽黃素是來源于植物的一種黃酮類化合物,具有抗腫瘤逆轉(zhuǎn)耐藥、抗氧化、抗菌、抗炎等多種生物學(xué)作用[9]。異歐前胡素和歐前胡素是呋喃香豆素類化合物,在體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)異歐前胡素對人肺癌、卵巢癌、皮膚癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種腫瘤細(xì)胞均具有不同程度的抗腫瘤作用[10]。歐前胡素除了有抗炎、抗氧化作用外,對胃癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤有抗腫瘤作用,其可與化療藥物發(fā)揮協(xié)同效應(yīng),逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性同時(shí)降低化療藥的毒副反應(yīng)[11]。上述活性成分在秦巴硒菇提取物治療CML的過程中起非常重要的作用。

Fig 7 Molecular docking diagrams between Tectochrysin and A PI3K B Akt C mTOR

Fig 8 Effects of different concentrations of drug and at different time periods on K562 cells )

PPI結(jié)果顯示秦巴硒菇提取物可能通過TP53、GAPDH、STAT3、CTNNB1、AKT1、VEGFA、JUN、mTOR等靶點(diǎn)治療CML。p53是腫瘤抑制因子,是細(xì)胞周期和凋亡的主要調(diào)節(jié)因子,在白血病及多種腫瘤中因突變而失活,有研究表明p53激活劑可能是治療慢性粒細(xì)胞白血病的有效方法[12]。伊馬替尼耐藥的BCR-ABL陽性細(xì)胞系中GAPDH過表達(dá),用RNA干擾的方法敲除GAPDH,可增加耐藥細(xì)胞對伊馬替尼的敏感性[13]。在CML中,細(xì)胞受到刺激后STAT3被活化,在腫瘤細(xì)胞生長增殖、對化療藥物產(chǎn)生耐藥和能量代謝失調(diào)中起關(guān)鍵作用[14]。CTNNB1也被稱為β-catenin,是Wnt/β-catenin信號通路的核心蛋白,在急性髓系白血病和CML中白血病干細(xì)胞的自我更新,增殖和分化中起重要作用[15]。在PI3K/Akt/mTOR信號通路中,Akt被認(rèn)為是PI3K的主要下游效應(yīng)分子,可使激活的糖原合成酶激酶-3β激酶阻止細(xì)胞周期蛋白D1的降解和凋亡相關(guān)因子的激活,從而加速細(xì)胞周期發(fā)育,最終促進(jìn)細(xì)胞增殖。mTOR被認(rèn)為是PI3K/Akt/mTOR信號通路下游的另一個(gè)組成部分,也可以被Akt磷酸化。mTOR不僅可以整合上游信號,還可以調(diào)節(jié)P70核糖體S6蛋白激酶和4E結(jié)合蛋白1的磷酸化,從而直接促進(jìn)細(xì)胞生長[16]。綜上所述,以上蛋白都可作為秦巴硒菇提取物治療CML的靶點(diǎn)蛋白,充分體現(xiàn)了秦巴硒菇提取物多成分多靶點(diǎn)治療疾病的特點(diǎn)。

Fig 9 Effect of drug on expression of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in K562 cells

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,PI3K/Akt信號通路富集的基因數(shù)目較多,是治療白血病的關(guān)鍵通路。研究表明,PI3K/AKT/mTOR信號通路是參與細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移的主要信號通路,該通路在CML疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。在CML中,BCR-ABL蛋白能持續(xù)激活PI3K/Akt/mTOR等下游信號通路,最終導(dǎo)致白血病細(xì)胞無限制的克隆性增殖。BCR-ABL通過兩種途徑影響PI3K/Akt/mTOR通路:直接通過PI3K的磷酸化;間接地通過下調(diào)或?qū)е略撔盘柾返奶烊灰种苿┝姿崦讣皬埩Φ鞍淄次锏墓δ苁軗p[17]。PI3K/ Akt/mTOR信號通路的失調(diào)可能導(dǎo)致下游信號分子的激活,PI3K是由兩個(gè)亞單位組成的異二聚體,包括調(diào)節(jié)亞單位和催化亞單位,當(dāng)細(xì)胞受到生長因子刺激時(shí),PI3K被激活并聚集在細(xì)胞膜上,將磷脂酰肌醇4,5-二磷酸轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸,然后磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸激活下游Akt通過磷酸化下游mTOR促進(jìn)細(xì)胞生長。PI3K/Akt/mTOR通路在CML中的失調(diào)已成為藥物研究和開發(fā)的熱點(diǎn),抑制該信號通路在各種類型的癌癥,特別是血液惡性腫瘤中表現(xiàn)出令人鼓舞的結(jié)果[16]。MAPK信號通路也與細(xì)胞增殖、分化、遷移、衰老和凋亡等多種生物學(xué)行為有關(guān)。在許多研究中,ERK和JNK的抑制劑有效地促進(jìn)了白血病細(xì)胞的凋亡,表明抑制該信號通路可治療白血病[18]。

分子對接結(jié)果顯示,秦巴硒菇提取物的主要活性成分楊芽黃素、異歐前胡素、歐前胡素與核心靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合能力,說明活性化合物與核心靶點(diǎn)存在相互作用,且可以形成結(jié)合能低、活性高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的構(gòu)象。這些靶點(diǎn)基因主要涉及參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡,免疫調(diào)節(jié)等方面。綜上所述,說明秦巴硒菇提取物可能通過與核心靶蛋白互作,作用于PI3K/Akt/mTOR等多條信號通路發(fā)揮促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等作用。

本課題組已經(jīng)對PI3K/Akt/mTOR信號通路及凋亡、細(xì)胞周期進(jìn)行了相關(guān)研究,后續(xù)研究還可選擇MAPK、JAK/STAT3通路,MicroRNAs in cancer中的ABCB1、ABCC1、ABCG2等與白血病耐藥相關(guān)的基因進(jìn)行深入研究。

中藥及提取物在治療白血病方面療效顯著,但由于其存在多成分、靶點(diǎn)不明確、作用機(jī)制復(fù)雜等問題。本研究采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析提取物中的有效成分,再結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法,揭示了秦巴硒菇提取物通過多個(gè)靶點(diǎn)、多種信號通路在白血病的治療中發(fā)揮作用。并通過CCK-8、Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證上述部分篩選結(jié)果,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明秦巴硒菇提取物可以抑制白血病K562細(xì)胞增殖,并下調(diào)p-PI3K、p-Akt、p-mTOR磷酸化蛋白的水平,對CML具有良好的抑制效果。