基于網絡藥理學探討山奈酚-7-O-新橘皮糖苷抗前列腺癌的作用機制

張秋萍,付杰軍,程智萍,薛 薇,李巧鳳,郭宏偉,

(1. 廣西醫科大學藥學院,廣西生物活性分子研究與評價重點實驗室, 廣西 南寧 530021;2.廣西醫科大學第一附屬醫院,廣西 南寧 530021;3. 廣西醫科大學轉化醫學研究中心,長壽與老年相關疾病教育部重點實驗室 廣西 南寧 530021)

前列腺癌(prostate cancer, PCa)是老年男性常見的惡性腫瘤,GLOBOCAN 2020統計報告顯示,2020年全球范圍內新發癌癥病例中,PCa的發病率為14.1%,僅略次于肺癌[1]。我國隨著生活水平提升、人均壽命延長和人口老齡化增多等因素影響,PCa發病率呈不斷上升態勢,已逐漸成為嚴重影響我國男性生命健康的重要疾病之一[2]。目前,PCa分為雄性依賴性和非依賴性兩大類,患者早期無明顯癥狀,發現時多半已為晚期,易對治療藥物產生耐藥性,最終發展為致命的雄激素非依賴性PCa,使得PCa的治療陷入窘境[3]。近年來,傳統中藥民族藥作為PCa的臨床輔助治療手段,在減少患者毒副作用,降低腫瘤復發率和改善患者生存質量方面表現出一定優勢[4-5]。

我們課題組前期研究發現,荔枝核總黃酮(total flavonoids of litchi seed,TFLS)具有較好的抗PCa作用[6]。山奈酚-7-O-新橘皮糖苷(kaempferol-7-O-neohesperidoside,K7ON)作為TFLS的主要成分之一[7],2D結構見Fig 1,已被證實可顯著抑制肺癌、肝癌和宮頸癌細胞的增殖[8],但對PCa細胞是否具有抑制作用,其分子機制如何,尚不清楚。因此,本研究旨在探討K7ON抗PCa的作用及潛在分子機制,將選取惡性程度高、轉移潛能強的雄激素非依賴性PCa細胞,其臨床治療研究的代表細胞株為PC3、DU145和C4-2;而LNCap保留著PCa細胞學及早期分化功能的顯著特征,是早期雄激素依賴性PCa細胞的典型代表[9],故選取該四株細胞進行增殖、遷移等研究,為荔枝核抗PCa有效成分的篩選和開發提供相關研究基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞系人源PCa細胞PC3、C4-2、DU145和LNCap均由長壽與老年相關疾病教育部重點實驗室提供。

Fig 1 2D structure of K7ON

1.2 藥物及試劑K7ON(CAS:17353-03-6,純度99.89%,貨號:1387 S)購自索萊寶公司;CCK-8試劑盒(貨號:AR1199)購自珀金埃爾默公司;細胞裂解液(貨號:89900)、蛋白/磷酸酶抑制劑(貨號:A32961)購自Thermo Fisher科技公司;BCA蛋白定量試劑盒(貨號:P0006)、超敏ECL化學發光試劑盒(貨號:P0018S)購自碧云天公司;蛋白Marker 26616(貨號:S27349)購自源葉公司;細胞周期試劑盒(貨號:CCS012)購自聯科生物公司;牛血清白蛋白(貨號:A8020)、脫脂奶粉(貨號:D8340)購自索萊寶公司;S相激酶相關蛋白2(Skp2,貨號:2652T)、p27(貨號:3686T)、細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A(p21,貨號:2947T)和GAPDH(貨號:2118S)抗體均購自CST公司。

1.3 主要儀器生物安全柜,細胞培養箱,全波長酶標儀Multishan GO,美國Thermo公司;37℃恒溫孵育箱DNP-9162,中國上海精宏實驗設備有限公司;4/-20/-80℃低溫冰箱,中國海爾公司;電泳儀Powerpac Basic,美國Bio-Rad公司。

1.4 細胞培養PCa細胞(PC3、C4-2、DU145和LNCap)均在補充有10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的RMPI-1640細胞培養基中培養,放入條件為37°C,5% CO2的細胞培養箱,2～3日更換一次培養液,待細胞密度長至85%以上即可傳代。

1.6 劃痕實驗檢測PCa細胞的遷移能力將對數生長期的DU145細胞接種于6孔板,當細胞匯合度達到95%～98%時,每孔加入20 mg·L-1的絲裂霉素C繼續孵育2 h。使用無菌10 μL槍頭在細胞生長單層劃線形成劃痕,D-PBS輕洗細胞3次,分別加入含不同濃度K7ON(0、32、64 μmol·L-1)的無血清培養基,每組設置3個平行孔。在給藥后的0、12、24 h進行拍攝,各組別的每個時間點隨機選取6個視野,采用ImageJ分析處理圖片。

1.7 分子網絡的構建

1.7.1K7ON潛在靶點的獲得 從PubChem 分子庫(pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得SMLIES和2D結構,通過SuperPred(https://prediction.charite.de/)、PharmMapper(http://www.lilab.ecust.cn/pharmmapper/)和Swiss Target Predictionn(http://www.swisstarget-prediction.ch/)數據庫預測K7ON的作用靶點,再利用Uniprot數據庫(https://www.un-iprot.org/uploadlists/)進行靶點蛋白和基因信息校正,得到相應的基因名稱。

1.7.2PCa相關基因靶點的獲得 通過Therapeutic Target Databaes(https://db.idrblab.ne-t/ttd/)、KEGG(https://www.kegg.jp/)、PharmGKB(https://www.pharmgkb.org/)以及GeneCards(https://www.genecards.org/)數據庫網站檢索靶點,輸入關鍵詞為“prostate cancer”,獲得與PCa相關基因的靶點。

1.7.3K7ON與PCa共同靶點PPI網絡的構建 將K7ON與PCa篩選出的靶點通過在線繪圖工具Venny 2.1.0(https//bioinfogp. cnb. csic.es/tools/venny/)獲得共同靶點,采用String平臺(https://cn.string.db.org/)獲得共同靶點的相互作用關系,通過Cytoscape軟件進行可視化分析,根據Degree值大小建立PPI網絡圖。

1.7.4K7ON與PCa共同靶點功能和通路富集分析及“藥物-靶點-疾病-通路”網絡圖的構建通過DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)在線生物信息學平臺將篩選出的共同靶點分別進行GO功能和KEGG通路富集分析,P<0.05為閾值,篩選出Top10的生物過程和信號通路,并通過生物信息分析平臺(https://cloud.oebiotech.cn/task/detail/bub-ble-array/)繪制氣泡圖。最后運用Cytoscape軟件,構建K7ON、共同靶點、疾病及Top10信號通路的“藥物-靶點-疾病-通路”網絡模型”網絡圖,以確定網絡模型中的相互關系。

1.8 流式細胞術檢測細胞周期DU145細胞常規培養,給予K7ON(5 μmol·L-1)干預48 h。清洗后離心重懸計數,按照試劑盒說明操作,每組取5×105個細胞以1 mL Buffer Solution重懸兩次。依次加入Solution A、Solution B、Solution C,每次孵育10 min,同時設置陰性對照組。檢測前以200目的濾網過濾細胞樣品,使用BD Arial Ⅲ流式細胞儀檢測細胞周期分布情況,ModiFit LT軟件對結果進行處理分析。

1.9 Western blot檢測DU145和C4-2的周期相關蛋白的表達將對數生長期的DU145和C4-2細胞接種于6 cm培養皿,給予不同濃度的K7ON(2.5、5 μmol·L-1)干預,同時設置對照組。48 h后以RIPA裂解法提取樣品,BCA法檢測蛋白濃度,各組的濃度調至相同(2 g·L-1)后加熱變性。每組取等體積的蛋白樣品進行電泳、轉膜、封閉,而后4℃冰箱孵育一抗(Skp2、p27、p21,GAPDH; 1 ∶1 000),12～16 h后孵育二抗,1 h后洗凈以化學發光顯影系統顯影。GAPDH作為內參,ImageJ統計條帶灰度值,實驗重復3次。

1.10 分子對接驗證綜合分析網絡藥理學及體外細胞結果,采用Sybyl X2.0軟件評價Skp2與K7ON的直接結合能力。通過PDB數據庫(https://www1.rcsb.org)下載該靶蛋白晶體結構,下載pdf格式文件導入Sybyl,進行除水分子、加氫原子等結構優化后保存。應用Pubchem數據庫獲得K7ON的sdf格式結構,使用Open Bable GUI軟件將格式轉化為mol2格式,導入Sybyl X2.0。將蛋白受體與化合物配體相互作用,根據Total Score評價Skp2與K7ON的結合作用,評分值大于5.0則證明兩者具有較好的結合能力,最后利用PyMol軟件繪制最優對接結果。

2 結果

2.1 K7ON對PCa細胞增殖的影響采用CCK-8法檢測了K7ON對PCa細胞PC3、DU145、C4-2和LNCap活性的影響。結果表明,K7ON呈劑量和時間依賴性抑制PCa細胞增殖,見Fig 2。給藥K7ON處理24 h、48 h和72 h后,PC3細胞的IC50(半數抑制濃度)值分別為169.2、75.29和13.21 μmol·L-1;DU145細胞的IC50值為 172.6、37.74和13.26 μmol·L-1;C4-2細胞的IC50值分別為 55.44、22.33和21.38 μmol·L-1。LNCap細胞的IC50分別為 36.18、27.73和19.33 μmol·L-1。上述結果表明K7ON可以顯著抑制PCa細胞的增殖。

2.2 K7ON對DU145細胞遷移能力的影響采用劃痕實驗檢測了K7ON對PCa細胞DU145遷移能力的影響。結果顯示,與對照組相比,不同濃度的K7ON(32、64 μmol·L-1)作用于DU145細胞12 h和24 h后,細胞的遷移能力均顯著下降(Fig 3)。以上說明K7ON能夠抑制DU145細胞的遷移。

2.3 K7ON和PCa共同靶點的篩選及PPI網絡構建將SuperPred、PharmMapper和Swiss Target Predictionn數據庫預測到的所有K7ON潛在靶點,分別根據Probability或Norm Fit值篩選并去除重復項,導入UniProt數據庫得到74個靶標蛋白所對應基因的規范名稱。分別從Therapeutic Target Databaes、KEGG、PharmGKB以及GeneCards數據庫分得到所有PCa靶點,經篩選和去除重復項后得到1 454個靶點。將PCa相關基因與K7ON靶點基因通過Venny2.1.0映射篩選出共同靶點34個,確定為K7ON治療PCa的潛在靶點基因,見Fig 4A。

使用String數據庫對共有靶點進行蛋白互相作用分析,構建共有靶點的相互作用網絡圖,將其倒入Cytoscape軟件構建可視化分析。Fig 4B為共有靶點內部蛋白-蛋白相互作用網絡圖,節點大小及顏色深淺根據自由度從大到小變化,深橘色所示的節點如SKP2、p27、TP53等是K7ON抗PCa細胞增殖的核心靶點。

2.4 共同靶點GO功能和KEGG通路富集分析為了研究K7ON治療PCa靶點參與的生命過程,將K7ON和PCa共有的34個靶點導入David數據庫分別進行GO功能和KEGG通路富集分析。GO包括生物學過程(BP)、細胞組分(CC)和分子功能(MF)3部分,根據富集的P-Value從小到大進行排序并選取前10條進行繪圖,見Fig 5A。GO功能富集分析中高度富集的主要包括細胞溶質(cytosol)、有絲分裂細胞周期的G1/S轉換(G1/S transition of mitotic cell cycle)、ATP酶結合(ATPase binding)、細胞核(Nucleus)以及細胞周期調節(regulation of cell cycle)等。KEGG通路富集分析結果顯示,共同靶點在21條信號通路中富集(P<0.01),主要包括癌癥相關、前列腺癌以及細胞周期等多種疾病通路,見Fig 5B。最后,構建“藥物-靶點-疾病-通路”網絡模型,表明K7ON和PCa靶點之間的相互作用以及關鍵途徑,見Fig 5C。以上結果提示K7ON抑制PCa細胞的增殖可能與調控細胞周期密切相關。

Fig 2 K70N inhibited proliferation of PCa cells in vitro A-D: Cell viability of PC3,DU145,C4-2 and LNCap cells treated with K7ON.

Fig 3 Effect of K7ON on migratory ability of DU145 cells in vitro

2.5 K7ON對DU145細胞周期的影響為了驗證上述網絡藥理學預測結果,K7ON是否通過調控細胞周期抑制PCa細胞的增殖,我們通過流式細胞術檢測K7ON對PCa細胞DU145周期的影響(Fig 6)。結果發現,在使用K7ON(5 μmol·L-1)干預24 h后,與對照組相比,K7ON處理組細胞周期S期的比例升高(P<0.001),G1期比例減少(P<0.01),說明K7ON可以使DU145細胞阻滯在S期。

2.6 K7ON對PCa細胞周期相關蛋白的影響為了進一步研究K7ON對PCa細胞周期的調控機制,我們采用Western blot對網絡藥理學預測的周期調控蛋白Skp2、p27以及p21進行檢測,其中p27和p21是Skp2下游周期調控蛋白。結果顯示(Fig 7),與對照組相比,使用不同濃度K7ON(2.5、5 μmol·L-1)作用48 h后,Skp2蛋白表達水平下調,而p27和p21的蛋白表達水平上調,差異有統計學意義。提示K7ON可能通過Skp2-p27/p21調控細胞周期抑制PCa細胞的增殖。

2.7 分子對接驗證結果為了進一步研究K7ON是否通過與Skp2蛋白直接結合,進而調控其下游蛋白p27和p21的表達,我們將K7ON與核心靶點Skp2進行分子對接。對接的Result Score與結合能大小相關,結合能指示配體和受體相結合的能力。當Result Score大于5時,表示化合物與蛋白具有較好的結合能力,結合能越大則結合得越穩定[10]。分子對接Result Score為5.12,顯示Skp2蛋白與K7ON具有較好的結合能力,提示K7ON可能與Skp2蛋白存在直接結合,進而調控下游周期蛋白p27和p21表達。利用PyMol軟件對結果進行可視化,見Fig 8A。

3 討論

PCa是老年男性最常見的惡性腫瘤,隨著發病率的不斷上升,PCa已逐漸成為嚴重影響我國男性壽命和生活質量的重要疾病之一[2]。雖已有研究表明原位PCa的五年生存率較高[11],但PCa患者早期大多無明顯癥狀,發現時多半已為晚期,且易對治療藥物產生耐藥性,最終發展為致命的去勢抵抗性PCa,使得PCa的治療陷入窘境[3]。近年來,傳統中藥和民族藥在PCa治療中發揮愈加重要的作用[4],從傳統中藥或民族醫藥中,尋找有效的抗PCa藥物已成為目前研究的熱點與趨勢。具有行氣散結之功的荔枝核常被臨床中醫師配伍應用治療PCa及其引起的癌痛[12],本課題組前期研究發現,TFLS為荔枝核提取物抗PCa的主要活性成分[7],另有研究表明,TFLS中的化合物K7ON可顯著抑制肺癌、肝癌、宮頸癌細胞的增殖[8],但K7ON對PCa細胞是否有抑制作用尚不清楚。因此,在本研究中,我們首先采用CCK-8法檢測K7ON對PCa細胞活性的影響,結果顯示,K7ON對不同類型PCa細胞均具有良好的增殖抑制活性。同時K7ON還可抑制DU145細胞的遷移能力,提示K7ON可抑制PCa細胞的增殖和轉移。

Fig 5 Enrichment analysis and network of common targets

Fig 6 Effect of K7ON on cell cycle of PCa cells

Fig 7 Effect of K7ON on Skp2-p27/p21 signaling pathway related proteins in PCa cells

Fig 8 Molecular docking and mechanism graph

近年來,隨著網絡藥理學的迅速發展,其被廣泛應用于探索中藥物質基礎和作用機理的研究,已成為系統性預測疾病與藥物之間復雜關系的綜合工具。我們課題組前期已采用網絡藥理學的方法在國際學術刊物上發表多篇相關研究論文[13-14],因此,在本研究中我們采用網絡藥理學預測了K7ON抗PCa的潛在分子機制,結果提示K7ON治療PCa與細胞周期調控密切相關,周期調控蛋白Skp2、p27等可能是K7ON抗PCa細胞增殖的核心靶點。Skp2主要參與細胞周期的調控,與腫瘤的發生、發展密切相關,在腫瘤的侵襲、轉移中也扮演著重要的角色[15]。我們的研究也結果顯示,K7ON可抑制PCa細胞DU145的遷移,同時阻滯DU145細胞周期于S期,提示Skp2可能是K7ON發揮作用的關鍵靶點之一。

細胞周期是細胞生命活動的基本過程,其調控的異常與腫瘤的發生密切相關。p27和p21被廣泛認為是細胞周期的負調節因子,Skp2可通過泛素蛋白酶體途徑降解p27和p21[15]。值得關注的是p27可通過調控細胞周期蛋白A(cyclin A)和周期蛋白依賴性激酶-2(cyclin-dependent kinase,CDK2)阻滯細胞于S期[16]。這與本研究發現K7ON阻滯DU145細胞周期停滯于S期一致,提示K7ON很可能是通過Skp2/p27信號通路調節PCa細胞周期。因此,我們進一步采用Western blot 對Skp2、p21和p27蛋白表達進行驗證,結果發現K7ON可顯著下調DU145和C4-2細胞中Skp2蛋白表達水平,上調p27和p21的蛋白表達水平。

流式細胞術和Western blot實驗的藥物濃度選擇一般低于IC50,多篇文獻中采用的IC20值已取得明顯的變化[17-18]。此外,我們前期的Western blot預實驗結果顯示,當取DU145給藥48 h的IC20值5 μmol·L-1時,DU145和C4-2細胞的周期蛋白表達皆發生顯著的變化(P<0.05)。故而流式細胞術選取IC20值5 μmol·L-1檢測DU145細胞周期變化;Western blot實驗選擇IC20值為高濃度,1/2的IC20值為低濃度。最后,Sybyl X2.0進行的分子對接結果顯示Total Score值為5.12,說明配體K7ON與受體Skp2具有較好的結合能力,進一步提示Skp2可能是K7ON的潛在藥效靶點。然而K7ON對Skp2是否存在直接靶向調控,而Skp2是否是通過泛素化途徑調控p27和p21的表達尚不明確,后續我們將針對上述不足展開深入研究。

綜上所述,K7ON可抑制PCa細胞的增殖和遷移,阻滯DU145細胞停滯于S期,其機制可能與調控Skp2-p27/p21信號通路有關(Fig 8B)。本研究為探索荔枝核抗PCa的有效成分及潛在分子機制提供理論依據。