血府逐瘀湯對肺動脈內皮細胞間質轉化的影響及機制

曾作梅,王昕玥,田雷瑜,崔力丹,郭 健,陳俞材

(北京中醫藥大學中醫學院,北京 100050)

肺動脈高壓(pulmonary hypertension, PH)是一種肺血管疾病,由遠端肺小血管致病性重構誘發,導致肺動脈阻力和肺動脈壓力持續性升高,最終出現右心衰竭甚至死亡[1]。PH最為關鍵的病理特征是肺血管重構,涉及到肺動脈內皮細胞功能障礙,平滑肌細胞異常增殖,以及成纖維細胞的過度激活和細胞外基質的沉積[2]。其中內皮細胞功能障礙在PH形成過程中扮演了重要角色,除了內皮血管活性介質釋放導致的血管收縮和舒張的不平衡外,內皮細胞還通過向間充質細胞轉化(endothelial-mesenchymal transition, EndMT)這一重要的生物學過程參與肺血管重構[3]。多項研究表明,在PH患者和動物模型的病變肺血管中發現了EndMT的存在[4-5]。目前臨床治療PH的方法主要針對肺血管收縮而非肺血管重構,雖然在短期內取得了一定的成效,但由于并沒有解決肺血管重構這一關鍵問題,患者的長期預后依舊不良。通過抑制肺血管EndMT以減輕肺血管重構可能是PH治療的可行性選擇,尋找以EndMT為靶點的藥物對治療PH具有十分重大的意義。

依據PH患者呼吸困難、活動后氣促、喘咳、胸痛等臨床癥狀,中醫將其歸屬于“肺脹”范疇。本病的病機主要表現為氣血水三者合而為病,血瘀貫穿于疾病的始終,活血化瘀法是其治療的重要手段[6]。血府逐瘀湯具有活血化瘀、行氣止痛的功效,是治療“胸中血府血瘀”諸癥的名方。現代藥理研究表明,本方可以保護血管內皮功能、改善微循環、抗炎、抗氧化應激、抑制血管重構[7]。多項臨床研究證實,血府逐瘀湯已被用于治療PH并且取得了較好的臨床療效,它可以顯著降低患者平均肺動脈壓力、中醫證候評分,改善患者氧合指數和血液高凝狀態[8-9]。目前對于血府逐瘀湯治療PH尚無深入的機制研究,血府逐瘀湯對PH的治療是否與干預EndMT有關尚不明確。

轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)經多研究證實可誘導EndMT的發生,故本研究將TGF-β1作為刺激劑誘導大鼠肺微血管內皮細胞(pulmonary microvascular endothelial cells, PMVECs)發生間質轉化構建EndMT細胞模型,觀察血府逐瘀湯對肺動脈EndMT的影響,探究其具體作用機制,以期為血府逐瘀湯臨床治療PH提供相應的理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞系PMVECs購自北納生物(BNCC)。

1.2 藥物與試劑血府逐瘀湯由桃仁、紅花、當歸、生地黃、牛膝、赤芍、枳殼、甘草、川芎、桔梗、柴胡,按8 ∶6∶6∶6∶6∶4∶4∶4∶3∶3∶2比例組成,藥材顆粒劑購自北京康仁堂藥業有限公司。TGF-β1(HY-P7118)和SB 431542(HY-10431)購于美國MedChemExpress公司;DAPI(G1012)購于Servicebio公司;抗體CD31(11265-1-AP)、β-actin(66009-1)、二抗(SA00001-2、SA00001-1)均購于Proteintech公司;抗體α-SMA(19245)、Snail(3879)、p-Smad2(18338)、p-Smad1/5(9516)、RIPA(9806)均購于美國Cell Signaling Technology公司;蛋白酶抑制劑(CW2200S)、磷酸酶抑制劑(CW2383S)、BCA蛋白定量試劑盒(CW0014S)、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(CW0022S)、電泳液(CW0045S)、TBST(CW0043S)、TBS(CWOO42S)、化學發光檢測試劑盒(CW0049S/M)均購于康為世紀;DMEM培養基(C12430500BT)、胎牛血清(10099-141C)、胰酶(25200-056)、青-鏈霉素雙抗(15140-122)均購于美國Gibco公司;PBS(21-040-CVC)購自康寧公司;Hoechst 33342染色液(ab228551)和鬼筆環肽染色液(ab176753)均購于Abcam公司;CCK-8檢測試劑盒(CK04)購于日本同仁化學研究所。

1.3 儀器二氧化碳培養箱(賽默飛世爾科技有限公司)、垂直層流潔凈工作臺(青島海爾特種電器有限公司);iMark酶標儀(美國BIO-RAD公司);化學發光成像系統(上海勤翔科學儀器有限公司);B032熒光倒置生物顯微鏡(尼康)。

1.4 方法

1.4.1血府逐瘀湯藥液制備 用DMSO作為溶劑,將血府逐瘀湯顆粒劑與DMSO充分混勻,渦旋震蕩溶解,配置成3×103g·L-1的母液,過濾除菌后于-20℃保存。加藥前用DMEM培養基將母液分別稀釋成所需要的濃度。

1.4.2PMVECs的培養 復蘇PMVECs,使用含有體積比1%青-鏈霉素雙抗和10%的胎牛血清的高糖DMEM培養基,在含有5%CO2的37℃恒溫細胞培養箱中培養。實驗所用PMVEC為第3～6代。每間隔24～48 h更換一次培養基,待細胞融合度到達80%～90%時,按照實驗需要,采用胰酶進行消化,加入DMEM培養基配置成一定比例的細胞混懸液,進行相應的傳代、種板或種皿。

1.4.3 CCK8細胞活力檢測將PMVECs用DMEM完全培養基稀釋至3×107·L-1,加入到96孔板中,每孔接種100 μL PMVEC混懸液。待細胞生長貼壁融合至80%左右后,加入不同濃度的血府逐瘀湯(0、1 、3、10、30、100、300 mg·L-1、1 g·L-1, 3 g·L-1)。放置培養箱內培養48 h后,分別在每孔加入CCK-8溶液(10 μL/孔)后繼續培養1～2 h,然后在酶標儀450 nm處測量各孔的吸光值。

1.4.4 細胞分組與給藥設置空白組和模型組(5 μg·L-1TGF-β1)。根據“2.3”CCK-8細胞活力檢測和文獻研究結果將血府逐瘀湯給藥濃度設定為3、10、30 mg·L-1。血府逐瘀湯低濃度組(DMEM培養基+3 mg·L-1XFZYD+5 μg·L-1TGF-β1),血府逐瘀湯中濃度組(DMEM培養基+10 mg·L-1XFZYD+5 μg·L-1TGF-β1),血府逐瘀湯高濃度組(DMEM培養基+30 mg·L-1XFZYD+5 μg/L TGF-β1)。SB 431542陽性藥(DMEM培養基+5 μmol·L-1SB 431542+5 μg·L-1TGF-β1)。

1.4.5細胞免疫熒光實驗 將PMVECs用DMEM完全培養基稀釋至1×108·L-1,加入到96孔板中,每孔接種100 μL PMVECs細胞混懸液。待細胞貼壁融合至80%左右,按以上分組加入相應濃度的藥液,并給予TGF-β1刺激劑造模,置于培養箱內培養。48 h后去除培養基,PBS洗2次,4%多聚甲醛室溫固定20 min,PBS洗2次。使用0.1% TritonX-100破膜處理15 min,去除Triton,3%BSA在37℃環境下封閉30 min,將一抗按照(CD31, 1 ∶200; α-SMA, 1 ∶200)稀釋,去除封閉液后,加入一抗4℃孵育過夜。棄一抗,PBS洗3次后,加入按1 ∶200配制的Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 555偶聯二抗。37℃環境下避光孵育2 h。棄二抗,PBS洗3次,最后加入按1 ∶1 000配制的Hoechst 33342染液染細胞核15 min,PBS洗滌5遍后于倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.4.6鬼筆環肽染色實驗 細胞分組與種板同細胞免疫熒光實驗,每孔加入0.2% TritonX-100于室溫環境下破膜15 min。吸棄Triton,每孔加入100 μL的Phalloidin 1×染液,37℃避光孵育1 h。加入按1 ∶1000配制的Hoechst 33342染液染細胞核15 min,然后使用PBS洗滌5遍,最后于倒置熒光顯微鏡下觀察每組細胞骨架改變情況。

1.4.7形態學觀察 取PMVECs細胞混懸液,以1×108個/L細胞密度,每孔100 μL接種于96孔板中。待細胞貼壁生長融合至80%左右時,按1.4.4項下方法分組給藥,并給予TGF-β1刺激劑,于培養箱內培養。48 h后將培養板取出,于光鏡下觀察PMVECs形態改變。

1.4.8Western blot 棄掉培養皿中的培養基,用生理鹽水清洗2次,加入配置好的蛋白裂解液80 μL,細胞刮板刮下細胞收集到離心管中,冰上裂解30 min后,在4℃,1000 r·min-1離心10 min。取上清液,使用BCA檢測試劑盒進行蛋白定量,后加入5×蛋白上樣緩沖液渦旋混勻。將混勻后的樣品于100℃沸水中加熱10 min使蛋白充分變性,然后進行分裝儲存于-80℃冰箱。每孔上樣10 μL進行10%SDS-PAGE凝膠電泳,將蛋白以200 mA電轉到PVDE膜上,采用5%BSA在37℃環境下封閉1 h。給予相應一抗于4℃冰箱孵育過夜,TBST洗膜5次后,給予相應二抗在37℃恒溫搖床中孵育1 h 30 min,TBST洗膜5次后,配置顯影液顯影,采用ImageJ圖像分析系統對各組細胞蛋白的相對密度進行檢測分析。

2 結果

2.1 血府逐瘀湯對PMVECs生長活力的影響采用CCK-8法檢測了不同濃度的血府逐瘀湯對PMVECs細胞活力的影響。與血府逐瘀湯0濃度組相比,隨著血府逐瘀湯濃度的上升,PMVECs細胞活力逐漸降低。血府逐瘀湯1～30 mg·L-1濃度對細胞活力無較大影響,在100 mg·L-1濃度時細胞活力有了明顯的降低,差異具有統計學意義,故選擇了將3、10、30 mg·L-1作為血府逐瘀湯藥效學檢測的最終低、中、高給藥濃度。

2.2 血府逐瘀湯對TGF-β1誘導的PMVECs內皮間質轉化的抑制作用為了探討血府逐瘀湯是否能抑制EndMT過程,采用TGF-β1構建了內皮細胞EndMT模型,并通過免疫熒光和Western blot方法對PMVEC內皮細胞標志物CD31和間充質細胞標志物α-SMA進行了相關檢測。SB 431542是TGF-β1的受體激酶抑制劑,被用作陽性藥。在免疫熒光的實驗結果中顯示,給予TGF-β1刺激劑后,模型組相較于空白組CD31的紅色熒光表達明顯降低,血府逐瘀湯給藥后,紅色熒光表達較模型組顯著升高;α-SMA的綠色熒光表達在模型組中明顯升高,血府逐瘀湯高濃度組α-SMA的綠色熒光表達降低較為明顯。蛋白免疫印跡法檢測實驗結果表明,模型組與空白組相比,CD31表達下調,α-SMA表達上調,在血府逐瘀湯給藥后,CD31蛋白表達明顯升高,α-SMA蛋白表達雖然沒有統計學差異,但是存在較為明顯的下降趨勢。這說明血府逐瘀湯可以通過上調內皮細胞標志蛋白CD31,下調間充質細胞標志蛋白α-SMA的表達,對TGF-β1誘導的肺動脈內皮細胞間質轉化具有抑制作用。

Fig 1 Effect of Xuefu Zhuyu decoction on viability of PMVECs (n=6)

2.3 血府逐瘀湯對TGF-β1誘導PMVEC細胞形態學的影響EndMT伴隨著細胞骨架的改變,鬼筆環肽染色是研究細胞內肌動蛋白微絲分布的有力工具。染色結果表明,TGF-β1刺激劑組相較于空白組出現了明顯的細長微絲分布,血府逐瘀湯用藥組則有所改善。正常組細胞呈鋪路鵝卵石樣,規則排列,細胞間的連接緊密。而TGF-β1刺激后細胞形態轉變為細長梭形,可見類似于平滑肌樣的細胞并有絲狀偽足伸出,細胞間的連接明顯松散。血府逐瘀湯能夠顯著抑制這一轉變趨勢,用藥后細胞形態可不同程度的接近正常組。

2.4 血府逐瘀湯對TGF-β1誘導的PMVECs細胞TGF-β1/Smad信號通路的影響TGF-β1/Smad信號通路是誘導EndMT的常見信號傳導通路,Snail是Smad下游參與EndMT形成的重要轉錄因子。為了探究血府逐瘀湯抑制EndMT的具體機制,采用Western blot檢測了TGF-β1誘導的PMVEC中p-Smad2、p-Smad1/5和Snail蛋白的表達。實驗結果顯示,與空白組相比,TGF-β1提升了模型組中PMVEC細胞Smad2的磷酸化水平,降低了Smad1/5的磷酸化水平。與模型組比較,血府逐瘀湯能夠降低p-Smad2,提高p-Smad1/5的蛋白表達,高濃度組的干預效果尤為顯著。模型組中Snail蛋白的表達明顯高于空白組,而血府逐瘀湯和SB 431542用藥組Snail的蛋白表達則顯著弱于模型組。綜上所述,血府逐瘀湯能夠調控TGF-β1/Smad信號通路,還能顯著降低EndMT重要轉錄因子Snail蛋白的表達。血府逐瘀湯對EndMT的改善作用,可能與它對TGF-β1/Smad信號通路的調控密切相關。

Fig 2 Xuefu Zhuyu decoction inhibited EndMT of TGF-β1 induced PMVECs (n=3～4)

Fig 3 Xuefu Zhuyu decoction inhibited cell morphological changes of TGF-β1-induced endothelial mesenchymal transformation of PMVECs

Fig 4 Effect of Xuefu Zhuyu decoction on expression of TGF-β1 signaling pathway related proteins in TGF-β1-induced PMVECs (n=3～4)

3 討論

PH被稱為心血管系統的“癌癥”,在發病過程中伴隨著肺血管細胞不可逆的損傷。常見缺氧、炎癥、機械力等刺激可引起肺血管內皮細胞損傷,導致內皮細胞功能障礙,血管收縮[10]。除此之外,內皮細胞還通過向間充質細胞轉化,參與肺血管重構[11]。EndMT是內皮細胞在多種因素的作用下失去其特征表型而向間充質細胞表型轉變的生物學過程。在這一過程中,內皮細胞間的緊密連接喪失,內皮細胞標志蛋白減少,如CD31、血管內皮粘連蛋白,轉而獲得間充質細胞標志蛋白和纖維細胞特異性蛋白,如α-SMA、波形蛋白和纖連蛋白[4]。除此之外,其結構也從鋪路鵝卵石樣轉變為了細長的梭形。EndMT可以被多種信號通路調控,其中TGF-β1和TGF-β1/Smad信號通路是誘導EndMT最重要的分子和信號通路之一[12]。因此,本研究采用了TGF-β1誘導PMVEC向間充質細胞轉變來建立EndMT細胞模型。實驗結果顯示,經TGF-β1誘導48 h后,PMVEC細胞骨架改變,其結構從原來的鵝卵石樣轉變為梭形。免疫熒光法和Western blot實驗結果提示經TGF-β1刺激后PMVECs的CD31表達下調,α-SMA表達上調。以上結果說明EndMT細胞模型建立成功。在血府逐瘀湯藥物干預后,上述結果均發生改變,血府逐瘀湯低、中、高濃度組細胞形態不同程度接近于正常組,呈鵝卵石鋪路樣排列,其中以高濃度組轉變最為明顯。除此之外,CD31的蛋白表達和熒光強度明顯提高,α-SMA的熒光強度則相應減弱。由此可見,血府逐瘀湯可改善TGF-β1誘導的肺動脈內皮細胞EndMT。

TGF-β1誘導EndMT的具體分子機制與Snail轉錄因子相關,而TGF-β1使Snail表達上調依賴于Smad蛋白的激活[13]。TGF-β1與膜受體結合并使受體相關的Smad2和Smad3磷酸化。被激活的Smad2/3與通用型Smad(Co-Smad)相互作用,形成異源二聚體Smad-復合物后進入細胞核,啟動Smad介導的轉錄事件[14]。在Smad靶基因中,Snail轉錄因子與EndMT相關。簡而言之,TGF-β1可以通過激活Smad2/3上調Snail的表達,誘導EndMT[15]。Smad1/5參與調節骨形成蛋白信號通路,在EndMT過程中其磷酸化水平被抑制。本研究結果顯示,經TGF-β1刺激后,PMVECs細胞p-Smad2和Snail蛋白表達上調,p-Smad1/5的蛋白水平下調,證實了在TGF-β1刺激劑的作用下TGF-β1/Smad信號通路被激活,并誘導了PMVECs細胞EndMT。而血府逐瘀湯則逆轉了這些蛋白的表達。因此可以表明血府逐瘀湯可以調節TGF-β1/Smad信號通路,并能通過此通路來影響肺動脈內皮細胞EndMT。

在本研究中,我們將TGF-β的受體抑制劑SB 431542作為陽性對照藥物,以期它可以通過TGF-β1信號通路抑制EndMT這一病理過程。從實驗結果中可以看出,SB 431542可以顯著上調內皮細胞標志物CD31的表達,以及內皮間質轉化抑制因素Smad1/5的磷酸化,對間質細胞標志物α-SMA和TGF-β下游Smad2磷酸化有一定降低趨勢,但沒有表現出統計學差異。EndMT是一個復雜的生物學過程,TGF-β1是其中經典的影響通路之一,包括TGF-β1/Smad及TGF-β1/non-Smad,除此之外其他通路如Wnt/β-catenin,Notch信號通路也參與EndMT的發生[4]。基于此,我們推測在SB 431542單一因素的作用下,Smad2磷酸化過程發生的同時,會受到部分相關信號分子的影響,產生表達水平的變化。PH在發病初期即有肺血管損害,其病變部位主要在脈,以血瘀為主要病理因素,活血化瘀法應該貫穿于PH各階段、各證型的治療之中。血府逐瘀湯是《醫林改錯》中的經典名方,它可以起到活血化瘀,行氣止痛的作用,主要治療胸中血瘀,血行不暢引起的多種病癥。該方由桃紅四物湯(桃仁、紅花、川芎、當歸、生地、赤芍)結合四逆散(柴胡、枳殼、甘草、芍藥),再加上桔梗和牛膝組合而成。方中用桃仁、紅花、川芎、牛膝活血化瘀,治療血分瘀滯。血液運行通暢,除了有賴于心氣推動以外,還需要肺氣宣降和肝氣疏調,故配伍桔梗開宣肺氣,柴胡、枳殼疏肝調氣,治療氣分郁結。用當歸、地黃補血滋陰,以求活血不耗血,理氣不傷陰。同時配伍芍藥、甘草,柔和經脈,緩急止痛。諸藥合用,活血藥行脈內瘀血,行氣藥疏脈外氣滯,柔肝緩急藥解脈絡痙攣,體現了脈內脈外與脈管同治之法[16]。現代藥理研究表明,血府逐瘀湯的主要化學成分包括甾體皂苷、黃酮類、有機酸以及萜類,不管是其中的單味藥還是復方,均顯示出了一定的抗PH作用[17]。

本研究表明,血府逐瘀湯可以減輕TGF-β1誘導的PMVECs細胞形態學改變,并且能上調內皮細胞標志物CD31,下調間質細胞標志物α-SMA的表達,說明血府逐瘀湯可以改善PMVECs向間充質細胞轉化。除此之外,血府逐瘀湯還可以降低PMVEC的p-Smad2和Snail的蛋白表達,上調p-Smad1/5的蛋白表達,說明血府逐瘀湯可以調控TGF-β1/Smad信號通路。血府逐瘀湯改善肺血管內皮細胞EndMT,其作用機制可能與影響TGF-β1/Smad信號通路密切相關。