北蒼術(shù)與朝鮮蒼術(shù)健脾作用及機制研究

崔名楊,丁奕輝,曲 揚,徐志立,才 謙

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,遼寧 大連 116600)

北蒼術(shù)[Atractylodeschinensis(DC.) Koidz.]與朝鮮蒼術(shù)[Atractylodescoreana(Nakai) Kitam.]均為蒼術(shù)屬植物,藥用部位是其干燥根莖[1]。北蒼術(shù)與茅蒼術(shù)被2020年版《中國藥典》收錄作為蒼術(shù)藥材使用。朝鮮蒼術(shù)雖未被《中國藥典》收錄,但《中藥大辭典》等書中對其有所記載[2]。經(jīng)課題組前期調(diào)查確認,朝鮮蒼術(shù)因其長勢好、抗病蟲害等優(yōu)勢,在一些地區(qū)常做北蒼術(shù)使用,前期研究也表明,北蒼術(shù)和朝鮮蒼術(shù)均具有健脾作用,但朝鮮蒼術(shù)作為北蒼術(shù)使用是否合理,仍待進一步的實驗驗證。現(xiàn)代研究表明,采用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)可以準確高效地定性、定量分析不同生物品種內(nèi)小分子化合物的差異,該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食品、植物、微生物等研究領(lǐng)域[3-5]。鐘薏文等[6]通過非靶向代謝組學(xué)的方法,分析篩選參苓白術(shù)散給藥前后脾虛大鼠的潛在生物標志物,明確了參苓白術(shù)散治療脾虛所涉及的代謝通路。因此,本研究從非靶向代謝組學(xué)的角度闡述北蒼術(shù)與朝鮮蒼術(shù)的健脾機制,并驗證兩者的健脾作用,為合理應(yīng)用朝鮮蒼術(shù)提供研究思路與實驗參考。

1 材料

1.1 藥材北蒼術(shù)(采自湖北省羅田中藥種植基地)、朝鮮蒼術(shù)(采自遼寧省鳳城市大梨樹村種植基地)及番瀉葉(購自國藥控股國大藥房有限公司,生產(chǎn)批號:20190501),均由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室許亮教授鑒定分別為菊科植物北蒼術(shù)Atractylodeschinensis(DC.) Koidz.的干燥根莖、菊科植物朝鮮蒼術(shù)Atractylodescoreana(Nakai) Kitam.的干燥根莖,以及豆科植物狹葉番瀉CassiaangustifoliaVahl的干燥小葉。

1.2 實驗動物SPF級♂ SD大鼠40只,6周齡,體質(zhì)量160～200 g,購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證號:SCXK(遼)-2021-0004],在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心適應(yīng)性喂養(yǎng),室溫20～23 ℃、相對濕度55%。實驗經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準,倫理批準號:2019YS(DW)-028-01。

1.3 試劑白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)ELISA試劑盒(批號:21102850N)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)ELISA試劑盒(批號:21102835N)、胃動素(motilin,MTL)ELISA試劑盒(批號:21102859N)、淀粉酶(amylase,AMS)ELISA試劑盒(批號:21102840N)、血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)ELISA試劑盒(批號:21102842N)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)ELISA試劑盒(批號:21102852N),均購自上海科興商貿(mào)有限公司;甲醇(貨號:67-56-1)、乙腈(貨號:75-05-8),均購自CNW Technologies公司;氨水(貨號:1336-21-6)購自Fisher Chemical公司;乙酸銨(貨號:631-61-8)購自Sigma-Aldrich。

1.4 儀器十萬分之一電子天平(德國Sartorius,型號:CP225D);高速萬能粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司,型號:DFT-200);隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司,型號:GNP-9080);酶標儀(芬蘭Labsystems Multiskan MS,型號:352型);微量高速離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司,型號:TG16W);超高效液相(Thermo Fisher Scientific公司,型號:Vanquish);高分辨質(zhì)譜(Thermo Fisher Scientific公司,型號:Q Exactive HFX)。

2 方法

2.1 藥液的制備取北蒼術(shù)與朝鮮蒼術(shù)的干燥粉末,根據(jù)大鼠與人之間每千克的體質(zhì)量劑量的換算系數(shù)為6.25,加入蒸餾水,分別制成濃度為0.375 kg·L-1的北蒼術(shù)混懸液與朝鮮蒼術(shù)混懸液,臨用現(xiàn)配[7]。將番瀉葉清洗干凈,加入8倍量的水后,沸騰煎0.5 h,過濾掉濾渣,將濾液濃縮成番瀉葉水煎液,其濃度為0.125 kg·L-1[8]。

2.2 動物分組、造模及給藥大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,根據(jù)隨機對照原則分為4組,每組10只,分別為正常對照組、模型組、北蒼術(shù)組和朝鮮蒼術(shù)組。正常組大鼠正常飼養(yǎng),保持自由進食和飲水,其余組大鼠使用飲食不當(dāng)、疲勞過度加苦寒瀉下的復(fù)合因素法造成脾虛癥模型[8]。造模方法為:單日灌胃豬油,雙日游泳到力竭并給予甘藍進食,保持游泳的水溫與大鼠體溫基本一致,2 d為1個周期,共進行7個周期。從15 d開始灌胃番瀉葉水煎劑(10 mL·kg-1),每天1次,共7 d,完成造模。造模成功后,兩個給藥組分別灌胃北蒼術(shù)混懸液和朝鮮蒼術(shù)混懸液(10 mL·kg-1),每天1次,共7 d。

2.3 血漿樣品采集各組大鼠禁食不禁水24 h,吸入乙醚麻醉后,進行腹主動脈取血,4 000 r·min-1離心10 min,取上清血漿在-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 血漿生化指標檢測采用ELISA法檢測各組大鼠血漿中胃腸道指標AMS、MTL、VIP,以及免疫學(xué)指標IgG、IL-6、TNF-α的變化情況,嚴格按照試劑盒說明書操作。

2.5 血漿代謝組學(xué)樣品處理將采集后得到的血漿樣品在室溫下解凍,吸取200 μL于1.5 mL EP管中,加入600 μL甲醇,渦旋震蕩30 s,12 000 r·min-1離心10 min,轉(zhuǎn)移上清液于40 ℃下氮氣吹干,用100 μL甲醇將剩余殘渣溶解,并渦旋震蕩1 min,12 000 r·min-1離心10 min,轉(zhuǎn)移上清液于進樣小瓶中待檢測。等量吸取各組中每個血漿樣本,混合后作為質(zhì)控(quality control,QC)樣本。

2.6 色譜條件使用Vanquish超高效液相色譜儀,通過Waters ACQUITY UPLC BEH Amide (2.1 mm×100 mm,1.7 μm)液相色譜柱對目標化合物進行色譜分離。液相色譜由含有25 mmol·L-1乙酸銨、25 mmol·L-1氨水的水相(A相),以及乙腈(B相)組成。樣品盤溫度為4 ℃,進樣量為2 μL。

2.7 質(zhì)譜條件通過Thermo Xcalibur軟件控制的Thermo Q Exactive HFX質(zhì)譜儀收集一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)。具體參數(shù)為:鞘氣流速:30 Arb;輔助氣流速:25 Arb;毛細管溫度:350 ℃;全毫秒分辨率:60 000;MS/MS分辨率:7 500;碰撞能量:在NCE模式下10/30/60;噴霧電壓:3.6 kV(正極)或-3.2 kV(負極)。

2.8 數(shù)據(jù)處理本實驗對正、負離子模式下的血漿樣本進行分析,原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard軟件轉(zhuǎn)成mzXML格式后,使用自主編寫的R程序包(內(nèi)核為XCMS)進行峰識別、峰提取、峰對齊和積分等處理,然后與BiotreeDB(V2.1)自建二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配,進行物質(zhì)注釋,算法打分的Cutoff值設(shè)為0.3。數(shù)據(jù)經(jīng)標準化處理后,導(dǎo)入SIMCA(16.0.2)軟件進行主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA)。

2.9 潛在生物標志物分析在血漿樣本進行OPLS-DA分析后,對結(jié)果進行200次置換檢驗,評估OPLS-DA模型是否存在過擬合現(xiàn)象。在驗證模型不存在過擬合現(xiàn)象后,采取OPLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度(VIP)和P值相結(jié)合的方法,篩選差異代謝物。篩選標準:選取同時滿足P<0.05和VIP>1的離子。以模型組與空白組的組間差異代謝物作為與脾虛相關(guān)的潛在生物標志物,同時分析北蒼術(shù)和朝鮮蒼術(shù)對潛在生物標志物的調(diào)節(jié)作用。采用京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)Pathway數(shù)據(jù)庫(http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)對以上潛在生物標志物進行代謝途徑分析。

3 結(jié)果

3.1 對胃腸道指標AMS、MTL、VIP的影響Tab 1結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組大鼠血漿中MTL、VIP水平明顯升高(P<0.01),AMS水平明顯降低(P<0.01)。與模型組相比,北蒼術(shù)組和朝鮮蒼術(shù)組大鼠血漿中MTL、AMS水平均明顯升高(P<0.01),VIP水平明顯降低(P<0.01)。朝鮮蒼術(shù)組大鼠血漿中MTL水平明顯高于北蒼術(shù)組(P<0.05),AMS水平明顯低于北蒼術(shù)組(P<0.01)。

3.2 對免疫學(xué)指標IgG、TNF-α和IL-6的影響與正常組相比,模型組大鼠血漿中IL-6、TNF-α水平明顯升高(P<0.01),IgG水平明顯降低(P<0.05)。與模型組相比,北蒼術(shù)組和朝鮮蒼術(shù)組大鼠血漿中IgG水平均明顯升高(P<0.01或P<0.05),TNF-α水平均明顯降低(P<0.01),IL-6水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。朝鮮蒼術(shù)組大鼠血漿中TNF-α水平明顯高于北蒼術(shù)組(P<0.01),IgG水平明顯低于北蒼術(shù)組(P<0.05)。見Tab 2。

3.3 血漿樣品的總離子流圖血漿樣品采用超高效液相色譜串聯(lián)Q Exactive質(zhì)譜儀(UPLC-QE-MS)分析,Fig 1為正、負離子模式下各組樣本的總離子流圖(total ion chromatogram,TIC)。

3.4 PCA分析PCA是一種統(tǒng)計方法,通過正交變換將觀測到的一組可能有關(guān)聯(lián)的變量轉(zhuǎn)變成線性不相關(guān)的變量(即主成分)。Fig 2為正負離子模式下大鼠血漿的PCA得分散點圖,圖中呈現(xiàn)的樣本基本處于95%置信區(qū)間之內(nèi),各組樣本組內(nèi)聚集較集中,組間分離程度較好,說明各組的血漿代謝物間存在明顯差異,QC樣本聚集較好,說明儀器穩(wěn)定,實驗結(jié)果可靠。

3.5 OPLS-DA分析通過OPLS-DA可以過濾出與分類變量無關(guān)的正交變量,進而分開分析正交與非正交變量,以獲得更確切的代謝物組間差異以及實驗組相關(guān)程度的信息。正、負離子模式下的各組大鼠血漿的OPLS-DA得分散點圖如Fig 3所示,正常組和模型組的樣本點完全分開,說明脾虛會導(dǎo)致大鼠潛在生物標志物發(fā)生改變。北蒼術(shù)組和朝鮮蒼術(shù)組的樣本點與模型組完全分開,說明北蒼術(shù)和朝鮮蒼術(shù)都可以通過調(diào)節(jié)脾虛大鼠的潛在生物標志物來改善脾虛。北蒼術(shù)組與朝鮮蒼術(shù)組的樣本點完全分開,說明二者對脾虛大鼠代謝通路的調(diào)節(jié)存在差異。從OPLS-DA得分圖的結(jié)果可以看出,兩組樣本區(qū)分非常明顯,并且全部處于95%置信區(qū)間之內(nèi)。

置換測試隨機模型的Q值都低于原始模型的Q值;Q的回歸線與縱軸之間的截距低于0;同時,隨著置換保留度的逐漸減小,置換的Y變量的比率增加,隨機模型的Q逐漸減小。結(jié)果表明,原始模型具有良好的穩(wěn)健性,不存在過擬合現(xiàn)象。Fig 4為正、負離子模式下正常組/模型組的OPLS-DA分析模型驗證圖。

3.6 潛在生物標志物篩選依據(jù)OPLS-DA模型結(jié)果,以VIP>1且P<0.05為標準,篩選正、負離子模式下的組間血漿差異代謝物。其中模型組與正常組相比,共篩選出180個血漿差異代謝物,作為與脾虛相關(guān)的潛在生物標志物;經(jīng)北蒼術(shù)與朝鮮蒼術(shù)給藥干預(yù)后,分別回調(diào)了70個和82個潛在生物標志物,其中共同調(diào)節(jié)的潛在生物標志物為52個。通過將北蒼術(shù)與朝鮮蒼術(shù)調(diào)節(jié)的潛在生物標志物聚類層次分析繪制的聚類熱圖,可以使結(jié)果更具可視化,見Fig 5。

Tab 1 Determination of AMS, MTL and VIP contents in plasma of rats in each

Tab 2 Determination of IgG, TNF-α and IL-6 contents in plasma of rats in each

Fig 1 Total ion flow chart of plasma in positive and negative ion modes of rats in each group

Fig 2 Scatter plot of PCA scores in plasma positive and negative ion modes of rats in each group

Fig 3 Scatter plot of OPLS-DA scores in plasma positive and negative ion modes of rats in each group

Fig 4 200 corresponding ranking test charts for blank/model groups in positive and negative ion modes

Fig 5 Regulatory effects of Atractylodes chinensis (A) and Atractylodes coreana (B) on different metabolites in rats with spleen deficiency

3.7 代謝通路分析將篩選出的差異代謝物名稱輸入Pathway數(shù)據(jù)庫進行代謝通路分析,以Impact>0.1且-ln(p)>1為條件,篩選關(guān)鍵代謝通路。結(jié)果表明,北蒼術(shù)的代謝途徑涉及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝及硫胺素代謝;朝鮮蒼術(shù)的代謝途徑涉及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,嘧啶代謝,丁酸代謝,核黃素代謝及硫胺素代謝,見Tab 3。

Tab 3 Key metabolic pathways of spleen deficiency regulated by Atractylodes chinensis/Atractylodes coreana

4 討論

中醫(yī)臨床通常根據(jù)癥狀來判斷脾虛,脾虛患者會表現(xiàn)出食欲減弱、脘腹隱痛、倦怠乏力、畏寒肢冷等癥狀[9],大多數(shù)是由于飲食失調(diào)、體虛勞累、憂思過度或者久病不愈等原因引起的[10]。本實驗通過綜合脾虛的臨床癥狀與病因、朝鮮蒼術(shù)和北蒼術(shù)的功效作用等多方面因素,選取飲食不節(jié)、疲勞過度加苦寒瀉下的復(fù)合方法制備脾虛大鼠模型。已有文獻證明,該方法所造成的的脾虛模型癥狀與中醫(yī)脾虛臨床癥狀基本相符[11]。

本課題組前期研究表明,北蒼術(shù)和朝鮮蒼術(shù)均可以用于治療脾虛,脾虛癥常伴隨胃腸功能紊亂。MTL是一種重要的腦腸肽和胃腸激素,可以促進胃腸蠕動,增強胃腸收縮力和張力,加速胃排空[12]。AMS是機體內(nèi)重要的消化酶,當(dāng)AMS分泌減少時,大鼠的消化功能會隨之下降,故可以間接反映脾虛大鼠的消化功能[13-14]。VIP是存在于腸道神經(jīng)系統(tǒng)中的一種神經(jīng)遞質(zhì),它會刺激胃腸道黏膜,增多水和電解質(zhì)分泌,導(dǎo)致患者出現(xiàn)腹瀉或者黏液便的情況[15]。以上3個指標均可反映胃腸功能的變化。本研究發(fā)現(xiàn),與正常組相比,模型組大鼠血漿中MTL、VIP水平明顯升高,AMS水平明顯降低。VIP和AMS水平的變化說明造模成功,但正常情況下脾虛造模后MTL水平應(yīng)降低。因此,本研究推測可能是脾虛大鼠過度虛弱產(chǎn)生了代償機制,代償性地加快胃腸蠕動來促進消化,從而導(dǎo)致模型組MTL水平異常升高。當(dāng)北蒼術(shù)和朝鮮蒼術(shù)給藥后,MTL和AMS水平均明顯升高,VIP水平明顯降低,從以上各組指標的回調(diào)趨勢可以說明給藥后緩解了脾虛癥狀,改善了胃腸道代償,從而導(dǎo)致MTL水平進一步升高,這一升高屬于正向調(diào)節(jié)作用,表明兩種蒼術(shù)都能夠調(diào)節(jié)脾虛大鼠的消化系統(tǒng)紊亂,改善脾虛引起的腹瀉癥狀。

有研究表明脾虛癥會影響免疫器官的發(fā)育,導(dǎo)致腸道免疫功能下降[16]。IgG是一種重要的免疫球蛋白,其含量可反映機體免疫功能的高低[17]。TNF-α和IL-6作為細胞因子,不僅與免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān),而且TNF-α可以引發(fā)炎癥等多種生理和致病現(xiàn)象,IL-6的水平可反映腸道炎癥的程度[18]。本研究發(fā)現(xiàn),與正常組相比,模型組大鼠血漿中IL-6、TNF-α水平明顯升高,IgG水平明顯降低,證明造模成功。北蒼術(shù)和朝鮮蒼術(shù)給藥后,IgG水平均明顯升高,TNF-α水平明顯降低,IL-6水平未出現(xiàn)明顯變化,表明兩種蒼術(shù)都能夠緩解脾虛大鼠的炎癥反應(yīng),提高機體免疫能力。

進一步基于UHPLC-QE-MS技術(shù),研究北蒼術(shù)與朝鮮蒼術(shù)對脾虛大鼠的干預(yù)作用機制,共篩選出與脾虛相關(guān)的差異代謝物180個,經(jīng)北蒼術(shù)與朝鮮蒼術(shù)給藥干預(yù)后,分別回調(diào)了其中70個和82個血漿差異代謝物,證實了北蒼術(shù)和朝鮮蒼術(shù)可以通過調(diào)節(jié)脾虛大鼠的潛在生物標志物來改善脾虛。利用Pathway數(shù)據(jù)庫對這些差異代謝物進行代謝通路的歸屬,發(fā)現(xiàn)北蒼術(shù)和朝鮮蒼術(shù)對脾虛大鼠代謝通路的調(diào)節(jié)存在差異。本研究發(fā)現(xiàn),與正常組相比,模型組大鼠血漿中肌氨酸、蘇氨酸、硫胺素水平明顯下降,經(jīng)北蒼術(shù)與朝鮮蒼術(shù)給藥后均明顯回調(diào),提示北蒼術(shù)與朝鮮蒼術(shù)均能通過調(diào)節(jié)“甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝” “硫胺素代謝”治療脾虛。模型組大鼠血漿中胞苷、尿嘧啶、脫氧尿苷、丙酮酸水平明顯下降,琥珀酸半醛水平明顯上升,經(jīng)朝鮮蒼術(shù)給藥后明顯回調(diào),提示朝鮮蒼術(shù)能通過調(diào)節(jié)“嘧啶代謝” “丁酸代謝”治療脾虛,而北蒼術(shù)對以上兩個通路雖有調(diào)節(jié)作用,但差異無顯著性。模型組大鼠血漿中核黃素水平明顯下降,經(jīng)朝鮮蒼術(shù)給藥后明顯回調(diào),提示朝鮮蒼術(shù)能通過調(diào)節(jié)“核黃素代謝”治療脾虛,而北蒼術(shù)不能調(diào)節(jié)“核黃素代謝”,即“核黃素代謝”是朝鮮蒼術(shù)特有的代謝通路。

綜上,北蒼術(shù)與朝鮮蒼術(shù)均能夠調(diào)節(jié)胃腸道與免疫學(xué)指標,具有一定的健脾作用,其作用機制可能與調(diào)節(jié)“甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝”與“硫胺素代謝”等代謝通路有關(guān)。目前研究結(jié)果可以看出,在健脾方面,朝鮮蒼術(shù)可以作為北蒼術(shù)應(yīng)用,但兩者略有差異,其中朝鮮蒼術(shù)在改善胃腸功能紊亂和代償機制方面更強,北蒼術(shù)在免疫調(diào)節(jié)方面更強。