探究濾泡輔助性T細胞在潰瘍性結腸炎中的作用

黃偉航，林艷芬

1.廣州市番禺區沙灣鎮社區衛生服務中心，廣東 廣州 511483；

2.廣州醫科大學附屬第二醫院檢驗科，廣東 廣州 510260

潰瘍性結腸炎（UC）作為一種累及結直腸黏膜及黏膜下層為主的慢性炎癥性腸道疾病，近年來發病率逐年上升，主要誘因包括環境因素、飲食結構、微生物影響及心理因素等，然而該病的發病機制尚不明確［1］。目前UC 的治療基本以局部直腸給藥為主，然而這種治療方式只能部分緩解病情，且存在疾病容易復發和藥物響應個體差異大的缺點，嚴重影響患者的生存質量［2-3］。因此，挖掘潰瘍性結腸炎特異性免疫標志物，尋找有效干預靶點，對于疾病的早期診斷與針對性治療具有重要意義。據文獻［4］報道，濾泡輔助T細胞（Tfh）作為一群獨立的CD4+T效應細胞亞群，定位于淋巴濾泡，主要功能是輔助B 細胞增殖產生抗體，參與體液免疫應答。該群細胞的表型特征為高表達濾泡歸巢趨化因子受體CXCR5，高表達細胞因子白介素（IL-21）和轉錄因子Bcl6。IL-21 可誘導Tfh 的分化并促進細胞表面CXCR5 的表達，Bcl6 對于Tfh 轉移到淋巴濾泡和B細胞生發中心（GC）的形成不可或缺［5］。已有研究［6］表明，Tfh 在SLE 等自身免疫性疾病患者中呈現上調，同時，狼瘡發病小鼠過程中也伴隨著Tfh 細胞數量的增加［7］。基于上述發現，Tfh 被認為在多種自身免疫性疾病的發生發展中扮演重要角色，為疾病治療提供靶向Tfh 細胞的新思路［8-9］。盡管如此，關于Tfh 細胞在UC 疾病中的作用相關報道仍較少。因此，探究Tfh 在潰瘍性結腸炎中的作用，將為闡述UC 的免疫學發病機制與疾病的針對性治療提供新的思路和靶點，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年1 月—2019 年12 月廣州醫科大學附屬第二醫院25 例UC 患者臨床外周血標本作為實驗組。參考2018年中華醫學會消化病學分會對潰瘍性結腸炎診斷與治療的共識意見中的診斷標準，納入以下患者：（1）年齡和性別不限；（2）結腸鏡檢、黏膜活檢后可確診為潰瘍性結腸炎的人群。排除標準：合并其它系統嚴重疾病。再選取25 名同年齡組健康成人（HC）外周血標本作為對照組，兩組受試者之間年齡、性別等一般資料具有可比性（P＞0.05）。本研究經廣州醫科大學附屬第二醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 主要實驗試劑

Anti-human 流 式 抗 體 CD45 （APC-Cy7）， CD3（BV421），CD4（FITC），CXCR5（PE），Bcl6（PE-Cy7）均購自美國Biolegend 公司； Trizol，逆轉錄試劑盒，qRT-PCR 試劑盒，ELISA 試劑盒（IL-21）購自Invitrogen公司；人淋巴細胞分離液Ficoll購自GE公司。

1.3 外周血單個核細胞PBMC 的分離與Tfh 細胞的流式檢測

使用含EDTA 抗凝管采集UC 患者與健康對照的外周血標本，離心后對上層血漿進行分離凍存，剩余血液中加入等體積的磷酸鹽緩沖液（PBS），充分混勻。隨后緩緩加入到人淋巴細胞分離液Ficoll 的上層（保持清晰分層界面），進行離心（離心條件為20 ℃， 升速為5 降速為0，時間20 min）。離心結束后，吸取中間白膜層細胞至50 mL離心管中，往其中加入10倍體積的PBS后進行離心，棄上清，收集細胞沉淀，此沉淀即為所需的外周血單個核細胞（PBMC）。通過流式細胞儀對獲得的PBMC 細胞進行如下檢測： Tfh的流式染色使用1×106細胞；Bcl6的流式染色使用2×106細胞，在Tfh染色的基礎上進行破核與核內轉錄因子染色。隨后進行抗體孵育，將標有抗體的細胞置于4 ℃孵育30 min，后加入PBS 進行終止。染色完成后，將吹打好的單個細胞進行流式上機檢測，最后將采集到的數據使用分析軟件Flowjo10.0進行詳細分析。

1.4 qRT-PCR實驗檢測

采集分離獲得的PBMC 樣品，使用Trizol 試劑進行總RNA 提取。按照Invitrogen 公司逆轉錄試劑盒與qRT-PCR試劑提供的使用說明書進行標準化操作。檢測基因序列如下： GAPDH （Forward: 5'-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3'；Reverse：5'-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3'）；Bcl6（Forward：5'-GGAGTCGAGACATCTTGACTGA-3'，Reverse：5'-ATGAGGACCGTTTTATGGGCT-3'）。

1.5 統計學方法

采用SPSS 25.0 軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t 檢驗。計數資料以例數和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 UC患者外周血中Tfh的比例呈顯著增加

據文獻報道，人外周血中Tfh 細胞的特征性表面分子標記為CD45+CD3+CD4+CXCR5+，在系統性紅斑狼瘡等自身免疫病患者外周血中，Tfh 細胞數量較正常人顯著增加，且伴隨Tfh 相關功能分子如ICOS、IL-21 等表達上調［10］。采集外周血分離PBMC 后，利用流式細胞術對PBMC 進行分析，發現與對照組相比，實驗組外周血PBMC 中Tfh 水平出現顯著上升，對照組（2.886±0.557 1），實驗組（10.35±1.833）。統計結果顯示，實驗組中Tfh細胞水平顯著上升，差異有統計學意義（P＜0.001）。

研究表明，Bcl6 是促進Tfh 細胞發育與功能最為關鍵的轉錄調控因子［5,11］。獲取兩組外周血PBMC 細胞后，提取細胞總RNA并進行mRNA水平的檢測，發現關鍵轉錄因子Bcl6在UC組中表達增高，采用管家基因GAPDH作為內參進行均一化數據處理。使用流式細胞術進行Tfh 細胞染色，并破核對Bcl6進行染色，檢測結果顯示，Bcl6的表達明顯右移，平均熒光強度顯著增高，這一結果說明UC 患者中Bcl6的表達同樣增加，與mRNA水平的結果相一致。

在Tfh 發揮調節功能的過程中，Bcl6 轉錄因子的表達受IL-21 的調控［12］。因此，研究者使用ELISA 試劑盒對血漿中的IL-21 進行了檢測，發現與對照組的血漿相比，結腸炎患者血漿中IL-21 的含量呈大幅度增加，差異有統計學意義（P=0.000 3）。此外，血漿中IL-21 與外周血中Tfh的細胞比例有顯著的相關性（R2=0.549，P=0.005 8）。這一結果提示，IL-21的含量或許可用于評估患者體內Tfh細胞的表達水平。

3 討論

迄今為止，潰瘍性結腸炎的免疫學發病機制尚未完全闡明，治療效果并不理想。目前認為，除了個人遺傳易感性、外部環境與腸道微生物外，免疫細胞與細胞因子等構成的腸道局部免疫調節網絡的異常是UC 發病的重要因素［13］。其中，以Th17和調節性T細胞（Treg）亞群的研究最為常見。已有文獻［14-16］表明，UC 患者外周血與腸道黏膜中發現數量明顯增多的Th17 細胞，且該細胞浸潤水平與腸炎的嚴重程度呈正相關，一定程度上可作為反映腸炎的標志物使用；而Treg 在UC 中的變化情況目前尚存在爭議，但發現其功能是減退的［17-18］。同時，炎性細胞因子IL-17 等在UC 中的表達整體出現上升趨勢，而IL-10 等抑炎因子的表達則出現明顯下降［19］。綜合上述結果，UC 患者中可能存在一定的免疫失衡，包括Th17 與Treg 之間、促炎因子與抑炎因子之間。最新研究［20］表明，免疫治療在UC 患者中，可作為一種對常規治療無效的新型治療方案。現有免疫治療包括促炎因子相應阻斷抗體、Treg 回輸等，但總的來說免疫治療的效果欠佳。導致這一現象的重要原因是目前人們對UC 相關免疫致病機理的理解還不夠充分，因此需要深入研究以闡明UC 發病相關免疫調節機制。

Tfh 作為體液免疫的重要調控細胞亞群，其在潰瘍型結腸炎中的功能研究至今仍未明確。本研究從Tfh 細胞著手，主要探究了Tfh 在UC 中的表達及作用研究。結果顯示，UC 患者中呈現出Tfh 細胞水平的明顯上升，說明Tfh可能是影響UC 發病的重要因素之一。因此，本研究進一步探索了其中的分子機制。Tfh 參與體液免疫應答的方式主要為分泌細胞因子IL-21。IL-21 在Tfh 細胞的發生和發育中起關鍵作用，可誘導Tfh 的分化并促進其表面CXCR5的表達［4］。而Bcl6 作為最關鍵的轉錄調控因子，其對于Tfh 轉移到淋巴濾泡與生發中心的形成不可或缺。在本研究中，研究者運用流式細胞術檢測了Tfh 細胞核內Bcl6 的表達情況，發現其水平在患者中呈顯著升高。同時，檢測了PBMC 細胞中Bcl6 在mRNA 水平的表達，結果顯示與蛋白水平結構一致。然而，由于PBMC 中Tfh 比例很低（約占PBMC 所有細胞的0.2%），流式分選難度較大，因此僅使用PBMC 細胞進行檢測，這一結果雖不夠準確，但也能夠在一定程度上與流式檢測的蛋白水平結果相互吻合。Bcl6 的轉錄表達主要受上游細胞因子IL-21 的調控，因此，下一步研究者檢測了UC患者血漿中IL-21的含量，結果顯示，細胞因子IL-21的含量呈顯著上調。此外， 研究者還發現在外周血中，IL-21的含量與Tfh的水平呈現顯著的正相關。上述結果提示Tfh細胞可能通過細胞因子IL-21來影響Bcl6的表達，進而促進UC的發生。

綜上所述，本研究中，UC 患者Tfh 細胞顯著增加，且Tfh中Bcl6的表達水平上升，提示Tfh可能促進了潰瘍性結腸炎的發生，該種促進作用可能與其胞內產生的大量細胞因子IL-21密切相關。本研究中Tfh的相關發現可為臨床免疫治療提供潛在的應用價值與新的思路。