蓖麻PIP5K1 基因克隆、生物信息學及功能分析

李明靜 袁樸芳 羅 蕊 尹明達 王志妍 戶雪妹 顧曉慧 黃風蘭，2

（1 內蒙古民族大學生命科學與食品學院，通遼 028000；2 內蒙古自治區蓖麻育種國家民委重點實驗室/內蒙古自治區蓖麻育種與綜合利用重點實驗室/蓖麻產業技術創新內蒙古自治區工程研究中心/內蒙古自治區高校蓖麻產業工程技術研究中心，通遼 028000）

蓖麻（Ricinus CommunisL.）是大戟科蓖麻屬雙子葉一年生或多年生草本植物，是一種用途廣泛、經濟效益高的非食用性作物，為世界十大油料作物之一，具有極高的附加價值[1]。蓖麻種子含油量在40%以上[2]，是一種可以替代石油應用于生產實踐的植物油，被視為可再生的“石油”資源，從中提煉出的蓖麻油也廣泛應用于國防、化工、輕紡、醫藥等多種行業[3]。在提取蓖麻油后剩余的蓖麻餅粕中，仍然含有大量的粗蛋白、粗纖維、碳水化合物和多種礦物質元素，同時還含有少量的天然毒素物質，可以用于飼料、殺蟲劑、改良土壤，具有巨大的開發潛力[4]。蓖麻既耐干旱也耐鹽堿，為目前國內不少土地問題（如可耕種區域少和土壤鹽堿化嚴重等[5-7]）開辟了新的解決途徑。蓖麻也是一種抗重金屬的植物，能抗Cu2+和Zn2+等[8]，可用于重金屬污染土壤的修復[9]。國際社會對蓖麻產品日益關注，而我國對蓖麻的研究由來已久[10]，其中以內蒙古通遼為主產區，通遼市的蓖麻種植面積約為全國的1/4。

PⅠP5K 酶（Phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase）是有機體中一種重要的磷脂質激酶，能加快1-磷脂酰-1D-肌醇環5 位羥基磷酸化和PⅠ-4-磷酸的磷酸化并生成PⅠ-4，5-二磷酸，該轉化過程在磷酸肌醇循環中屬于至關重要的環節，并且在調節多種信號通路中起著核心作用[11-13]。由此可知，PⅠP5K 酶是磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol，PⅠ）信號轉導通路中的一個重要酶類，對PⅠ信號轉導通路中的調節也在許多細胞功能中起關鍵作用[14]。王永富等[15]發現辣椒PIP5K1基因的啟動子順式作用元件主要響應激素、防御與脅迫以及低溫應答；Chakrabarti等[16]、Mikami 等[17]發現擬南芥PIP5K1基因參與擬南芥水分脅迫的響應和脫落酸（ABA）信號調控途徑；Ugalde 等[18]、Liu 等[19]在擬南芥和小麥上的試驗結果表明，PIP5K1是液泡生物合成和早期花粉發育的重要因素，而梁塔娜等[20]在蓖麻上的試驗也有類似結論。總之，PIP5K基因家族參與調控多種植物生長發育，而PIP5K1基因參與不同代謝通路的調節，同時在逆境響應過程中也發揮著重要的作用。

本文通過克隆蓖麻PIP5K1基因，對其進行了生物信息學和在不同時期雌性植株內的表達分析，為揭示PIP5K1基因參與調控蓖麻植株的生長發育機理和發掘與之相關的其他重要基因奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1試驗材料供試材料為蓖麻Lm 型雌性系aLmAB2品種，該品種由蓖麻育種國家民委重點實驗室提供。

1.2試驗方法

1.2.1PIP5K1基因的克隆蓖麻總RNA 提取隨機選取30 株蓖麻Lm 型雌性系aLmAB2品系的花序軸頂端，使用北京Takara 生物技術有限公司的植物組織RNA 提取試劑盒提取蓖麻花序總RNA。

反轉錄 取1μL的Random Primers，4μL的RNA溶液混勻。在70℃水浴鍋中加熱5min，立即冰水浴5min，離 心10s。加 入4μL 的5×React Buあer，4μL的MgCl2，1μL 的RT，1μL 的PCR Nuc mix，0.5μL 的rRNasin，進行PCR 擴增，PCR 擴增程序為70℃變性15min，25℃退火5min，42℃延伸60min，40 個循環。反應結束后，對cDNA 濃度進行測定，并將其稀釋到100ng/μL 作為后續反應的模板。

引物設計 從NCBⅠ檢索得到PIP5K1的基因序列（序列號：LOC8275135），利用網頁程序Snap Gene 進行引物設計（表1）。

表1 引物名稱與序列

PCR擴增 以反轉錄得到的cDNA作為模板進行PCR 擴增。擴增體系為：5×PS Buあer 10.0μL；dNTP 4.0μL；引物1 和引物2 各1.0μL；模板1.5μL；ddH2O 32.0μL；PrimeSTAR 0.5μL。擴增程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s；55℃退火45s，72℃復性延伸1min，72℃終延伸10min。40 個循環。反應完成后，電泳檢測。

目的基因回收 擴增完成后，采用試劑盒法進行目的基因的回收純化。

克隆載體與目的基因連接 將pUC19 載體與純化后得到的目的基因進行無縫連接，連接體系為：Mix 試劑5.00μL，目的基因0.75μL，載體1.80μL，ddH2O 2.45μL。連接過程在16℃水浴鍋（DK-8D）中進行，過夜連接。

連接產物轉化大腸桿菌與菌液PCR 鑒定 用凍融法把連接好的產物10μL 接入DH5α大腸桿菌感受態，搖菌培養，離心，涂板培養，最后挑取單斑與100μg/mL Amp（氨芐青霉素）液體混合后作為模板進行菌液PCR 鑒定，菌液PCR 體系參考王志妍等[21]的方法。PCR 反應程序與以cDNA 作為模板展開擴增的體系相同，以上步驟完成后用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR 產物進行檢測。

酶切重組載體并測序分析 利用限制性內切酶BamHⅠ和KpnⅠ對重組載體雙酶切，酶切過程于37℃水浴鍋中靜置3h，載體酶切反應體系參考王志妍等[21]的方法。酶切完成后瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定，將鑒定正確的菌液送至通用生物股份有限公司開展序列測定和分析。

1.2.2PIP5K1基因的生物信息學分析使用Protparam、Expasy-ProtScale、TMHMM、SOPMA、SWⅠSS-Model 和MEGA 等軟件對基因PIP5K1編碼蛋白的理化性質、親疏水性、跨膜區、二級結構、三級結構及同源性利用生物信息學展開分析或預測。

1.2.3PIP5K1基因表達量分析PIP5K1基因與蓖麻ACTIN基因引物序列見表1。以反轉錄獲得的cDNA 為模板，以蓖麻ACTIN基因為內參，進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析。根據北京莊盟國際生物基因科技有限公司熒光定量PCR 試劑盒說明書進行操作。反應體系包括：SYBR Premix Ex Taq 10.0μL，上下游引物各0.4μL，cDNA 2.0μL，ddH2O 7.2μL。擴增反應在ABⅠ 7500 FAST 實時熒光定量PCR 儀上進行，擴增條件為：95℃預變性5min，60℃ 10min，72℃ 35min，40 個循環。

1.3數據處理采用2-ΔΔCt法計算相對表達量，以相同的試驗方法進行3 次生物學重復，用SPSS 2016對數據進行單因素方差分析，并采用Graphpad 作圖。

2 結果與分析

2.1PIP5K1基因克隆結果對得到的蓖麻總RNA展開電泳檢測，在圖1A 能夠發現3 個明顯條帶（28S、18S、5S），可以用作反轉錄模板。以cDNA為PCR 擴增模板，擴增結果見圖1B，PCR 擴增后獲得2325bp 的明顯條帶。

圖1 蓖麻總RNA 提取及PIP5K1 基因PCR 擴增電泳檢測結果

將重組載體菌液PCR 擴增結果進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖2A。送樣進行序列測定及分析。用BamHⅠ和KpnⅠ兩種酶對重組子進行雙酶切鑒定，電泳檢測結果見圖2B，重組子經雙酶切后得到了2686bp 和2325bp 的2 條特異性片段，酶切驗證結果正確。

圖2 重組載體菌液PCR 電泳及質粒酶切產物電泳檢測結果

測序結果顯示PIP5K1基因為含有2325 個堿基的序列，通過對序列測定后的拼接結果和PIP5K1基因參考序列展開比對，發現2 個序列相同。

2.2PIP5K1基因所編碼蛋白的生物信息學分析結果

2.2.1蛋白質理化性質分析利用Protparam 軟件分析發現，PIP5K1基因編碼蛋白的氨基酸等電點是8.85，氨基酸數目是774 個，不穩定系數是31.84，分子量大小是87967.37Da，親水性系數是-0.669，屬于親水性穩定蛋白。

2.2.2蛋白質親疏水性分析用Expasy-ProtScale網站對蛋白質的親疏水性展開分析，結果見圖3。從圖中可知PIP5K1基因編碼蛋白質的親水性平均系數為負值，說明該蛋白為親水性蛋白。

圖3 PIP5K1 基因編碼蛋白親疏水性分析

2.2.3蛋白質跨膜區分析使用網頁程序TMHMM對跨膜區展開分析，結果見圖4。該圖可以表明PIP5K1基因所編碼蛋白具有774 個氨基酸，沒有具備跨膜螺旋區域，屬于非跨膜蛋白。

圖4 PIP5K1 基因編碼蛋白跨膜區分析

2.2.4PIP5K1基因編碼蛋白質的結構分析基于網頁程序SOPMA 對蛋白質的二級結構展開預測，結果見圖5。該圖表明在所測蛋白的序列中，α 螺旋包含了179 個氨基酸，占比23.13%；β 轉角中包含了66 個氨基酸，占比8.53%；伸展鏈包含了151 個氨基酸，占比19.51%；無規卷曲包含的氨基酸數目為378 個，占比48.84%。

圖5 PIP5K1 基因編碼蛋白二級結構預測

通過網頁程序SWⅠSS-Model 對PIP5K1基因編碼蛋白的三級結構展開預測，效果如圖6 所示，該圖表明PIP5K1基因編碼蛋白關鍵構成要素包括了α 螺旋、β 轉角、伸展鏈、無規卷曲等，而無規卷曲所占據的比例幾乎達到該結構的一半，和上面得到的二級結構預測保持一致。PIP5K1基因編碼蛋白特定的生物學功能取決于其空間結構的復雜性。

圖6 PIP5K1 基因編碼蛋白三級結構預測

2.2.5同源性分析用本地軟件MEGA 中的鄰接法對PIP5K1基因編碼蛋白與其他植物種類如木薯等，展開同源性比較，進行500 次的bootstrap 檢測，比較結果如圖7 所示。該圖表明，在本文所選擇的物種中和蓖麻PIP5K1基因編碼蛋白親緣關系最近的是同屬于大戟科的木薯，和其余物種的親緣關系相對較遠，親緣關系最遠的當屬高粱。

圖7 蓖麻PIP5K1 基因編碼蛋白進化樹分析

2.3PIP5K1基因在不同時期不同花序中的差異表達提取Lm 型雌性系蓖麻aLmAB2標雌系、單雌系、兩性系花序的營養生長期（4 葉期）、營養生長到生殖生長轉變期（5 葉期）、主莖穗開花期、二級分枝開花期共12 種樣品的總RNA，進行PIP5K1基因熒光PCR 檢測。由圖8 可以看出，PIP5K1基因在單雌系、標雌系2 種花序5 葉期時基因相對表達量普遍高，在3 種花序類型的主莖穗時期表達量較低；在標雌系花序的5 葉期時有最高的相對表達量，在單雌系花序主莖穗期有最低的相對表達量，最高相對表達量是最低相對表達量的16 倍左右。

圖8 蓖麻PIP5K1 相對表達量變化

3 討論與結論

磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶（PⅠP5K）是PⅠ信號轉導途徑中的關鍵酶，該基因家族在許多細胞的功能發揮方面起著關鍵作用。PIP5K1基因在植物生長發育及代謝方面和逆境響應過程中發揮著重要的調控作用。目前對于PIP5K1基因在生長發育和代謝功能方面的研究較多，文艷鵬[22]對蓖麻PIP5K基因家族的功能進行研究，結果表明PIP5K1基因是影響液泡生物合成和早期花粉發育的重要基因，而周玉瓊[23]發現了PIP5K1基因在玉米生長過程中具有促進根尖和花粉管發育成熟的作用。張高原等[24]發現PIP5K1基因在西瓜植株各組織的不同發育時期均表現出較高的表達量，說明PIP5K1基因可能參與調控西瓜不同組織形態的代謝通路。本試驗克隆得到的PIP5K1基因大小是2325bp，而梁塔娜[25]研究的蓖麻PIP5K1基因大小為3246bp，這可能是因為他們研究的是蓖麻PIP5K1基因的完整序列，而本文研究的是蓖麻PIP5K1基因的編碼序列。本研究結果表明PIP5K1基因所編碼的蛋白質是具有親水性的穩定蛋白質，對該蛋白展開二級結構預測顯示占比最大的組成成分為無規卷曲，這與前人結論一致。

本研究采用克隆技術得到全長為2325bp 的蓖麻PIP5K1基因片段。基于PIP5K1基因所編碼蛋白展開生物信息學分析，結果顯示該蛋白的氨基酸數目為774 個，分子質量是87967.37Da，分子式為C3888H6028N1112O1160S33；總平均親水性系數為-0.669，不穩定系數為31.84，所以該蛋白是一種具有親水性的穩定蛋白；無跨膜螺旋區，屬于非跨膜蛋白；在蛋白的二級結構中23.13%的比例為α 螺旋、8.53%的比例為β 轉角、19.51%的比例為伸展鏈、48.84%的比例為無規卷曲；三級結構與二級結構預測結果一致；與同屬大戟科的木薯親緣關系較近。PIP5K1基因在標雌系花序中相對表達量最高，在兩性系花序中相對表達量最低。本研究通過克隆蓖麻PIP5K1基因并對其編碼蛋白進行生物信息學和基因表達量分析，為揭示PIP5K1基因參與調控蓖麻植株的生長發育機制和深入研究奠定了理論基礎，而該基因對蓖麻生長發育的調控作用和代謝通路的調節作用有待進一步研究。