左慈丸的化學成分及治療圍絕經期聽力損失的作用機制研究：基于網絡藥理學與分子對接技術

刁翯 白文佩 趙立東

【摘要】 背景 近年來，圍絕經期聽力損失（PMS-HL）癥狀得到普遍關注，但無針對性治療。左慈丸治療耳聾已有百年歷史，但尚無該藥治療PMS-HL的相關研究。目的 在網絡藥理學和分子對接技術的基礎上，進一步通過動物實驗驗證，初步探討左慈丸對PMS-HL的作用機制及治療靶點。方法 檢索數據庫時限均為建庫至2023年2月。根據左慈丸的組方，通過TCMSP和Uniprot數據庫挖掘該藥物活性成分和作用靶點，根據GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank、PharmGKB數據庫獲取PMS-HL的蛋白靶點，取其交集，篩選左慈丸治療PMS-HL的潛在治療靶點，構建“藥物-活性成分-靶點”相互作用網絡圖。利用String數據庫的蛋白相互作用分析功能篩選核心靶點。采用Metascape數據庫對蛋白的功能及其通路進行富集分析。使用Autodock和Pymol對核心蛋白進行分子對接，確定核心靶點與左慈丸的關鍵活性成分之間的結合能力。于2022年9月—2023年1月建立絕經大鼠模型：假手術組（SHAM）組、去卵巢組（OVX）組、左慈丸（ZCW）組，并檢測血清中關鍵蛋白白介素1β（IL-1β）水平，使用SPSS 26.0進行統計分析。結果 左慈丸組方中化合物的活性成分90個，潛在蛋白靶點226個，PMS-HL相關靶點2 481個，左慈丸與PMS-HL交集靶點150個。基因本體論（GO）功能中獲得生物過程共183個條目，分子功能103個條目，細胞成分103個條目；京都基因和基因組百科全書（KEGG）前三位分別是癌癥通路、脂質與動脈粥樣硬化病變通路和化學致癌的受體激活通路。分子對接顯示，左慈丸治療PMS-HL的主要活性成分有槲皮素、山柰酚、豆甾醇、β-谷甾醇、異鼠李素、薯蕷皂苷、四氫鴨腳木堿和海風藤酮；左慈丸的活性成分與核心靶蛋白：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、細胞腫瘤抗原p53（TP53）、白介素6（IL-6）、血管內皮生長因子（VEGFA）、胱天蛋白酶3（CASP3）、IL-1β、表皮生長因子受體（EGFR）、雌激素受體1（ESR1）結合能穩定。3組大鼠血清IL-1β水平比較，差異有統計學意義（F=11.73，P<0.001）。結論 左慈丸中的槲皮素等90個活性成分通過作用于AKT1等226個潛在蛋白，實現調控組織細胞的抗氧化應激、調節血脂血糖代謝、抗腫瘤等途徑，直接或間接地起到保護圍絕經期聽力功能的作用，IL-1β可能是其中發揮作用的關鍵靶蛋白。

【關鍵詞】 圍絕經期；聽力損失；左慈丸；中藥化學成分；網絡藥理學；分子對接

【中圖分類號】 R 711.51 R 764.43 【文獻標識碼】 A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0390

Chemical Composition and Mechanism of Zuoci Pill in Treating Perimenopausal Hearing Loss Based on Network Pharmacology and Molecular Docking Technology

DIAO He1*，BAI Wenpei2，ZHAO Lidong3

1.Department of Traditional Chinese Medicine，Tianjin Central Hospital of Gynecology Obstetrics/Nankai University Maternity Hospital/Tianjin Key Laboratory of Human Development and Reproductive Regulation，Tianjin 300199，China

2.Department of Obstetrics and Gynecology，Beijing Shijitan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100038，China

3.Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery，Chinese PLA General Hospital/National Clinical Research Center for Otolaryngologic Diseases/State Key Lab of Hearing Science Affiliated to Chinese Ministry of Education/Beijing Key Lab of Hearing Impairment Prevention and Treatment，Chinese PLA Medical School，Beijing 100853，China

*Corresponding author：DIAO He，Attending? physician；E-mail：hedia@bjmu.edu.cn

【Abstract】 Background In recent years，the symptoms of perimenopausal hearing loss（PMS-HL）have received widespread attention，but there is no targeted treatment. Zuoci pill has been used clinically for a hundred years，but there is no relevant research on the treatment of PMS-HL with this drug. Objective To explore the mechanism and therapeutic targets of Zuoci pill on PMS-HL through further validation of animal experiments based on the network pharmacology and molecular docking technology. Methods The active components and action targets of Zuoci pill were obtained through TCMSP and Uniprot databases，and the protein targets of PMS-HL were obtained through GeneCards，OMIM，TTD，DrugBank，and PharmGKB databases according to the composition of Zuoci pill from inception to February 2023，the intersection was taken to screen the potential therapeutic targets of Zuoci pill for the treatment of PMS-HL，and the "drug-active ingredient-target" interaction network diagram was constructed. The protein interaction analysis function of the String database was utilized to screen core targets. The Metascape database was used for enrichment analysis of the function of the proteins and pathways. Molecular docking of the core proteins was performed using Autodock and Pymol software to determine the binding capacity between key active ingredients and core targets. The menopausal animal model was established from September 2022 to January 2023，including Sham operation group（SHAM）group，ovariectomized（OVX）group，and Zuoci pill（ZCW）group，and serum level of the key protein interleukin 1β（IL-1β）was detected and statistically analyzed using SPSS 26.0. Results There were 90 active components，226 potential protein targets，2 481 PMS-HL related targets，and 150 Zuoci pill and PMS-HL intersection targets for the compounds in the Zuoci pill formula. A total of 183 items for biological process，103 items for molecular function，and 103 items for cellular components were obtained in the Gene Ontology（GO）function. The top three Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）were cancer pathways，lipid and atherosclerotic lesion pathway，and receptor activation pathway for chemical carcinogenesis. Molecular docking showed that the main active ingredients of Zuoci pill in treating PMS-HL were quercetin，kaempferol，stigmasterol，β- Sitosterol，isorhamnetin，diosgenin，tetrahydrostilbene and kaempferone；the active components of Zuoci pill can bind to the core target proteins of serine/threonine kinase 1（AKT1），cellular tumor antigen p53（TP53），interleukin 6（IL-6），vascular endothelial growth factor（VEGFA），cystatinase 3（CASP3），IL-1β，epidermal growth factor receptor（EGFR），and estrogen receptor 1（ESR1）stably. Comparison of serum IL-1β level among the three groups of rats showed statistically significant difference（F=11.73，P<0.001）. Conclusion The 90 active ingredients in Zuoci pill，such as quercetin，act on 226 potential proteins such as AKT1 to regulate the antioxidant stress of tissues and cells，metabolism of blood lipids and glucose，and anti-tumor pathway，directly or indirectly protect the perimenopausal hearing function，IL-1β may be one of the key target proteins.

【Key words】 Perimenopause；Hearing loss；Zuoci pill；Chemical compositions；Network pharmacology；Molecular docking

女性的卵巢功能會伴隨衰老而逐漸減弱，導致激素水平的變化，進而引發下丘腦-垂體-卵巢軸的一系列臨床表現，稱為圍絕經期綜合征（perimenopausal syndrome，PMS）［1］。臨床研究發現，女性圍絕經期間存在聽力損失（hearingloss，HL）的情況［2-3］，屬于PMS的癥狀之一。雌激素對聽力的保護機制具有多種途徑，比如：雌激素可維持內耳神經、血流及代謝的水平，保持耳內微循環平衡，從而保護聽力功能；雌激素能夠對聽覺的上皮細胞進行修復，進而減少HL；雌激素可以調節腦源性神經營養因子相關基因的表達、抑制細胞凋亡和調節鈣離子濃度平衡進而保護聽神經細胞等［4-5］。臨床上對于PMS大多采用絕經激素治療（menopausal hormone therapy，MHT），本質是彌補年齡增長導致的卵巢功能衰竭。但雌激素屬于多種功能的類固醇激素，其受體在人類組織器官上分布較為廣泛，故圍絕經期聽力損失（PMS-HL）使用MHT針對性欠佳。

PMS-HL屬于中醫婦科學絕經前后諸證的范疇，其病機以腎虛為主，腎的陰陽平衡失調，處于“陰常不足，陽常有余”的狀態。《靈樞·脈度篇》中有“腎氣通于耳，腎和則耳能聞五音矣”的記載。腎精不足則出現HL的癥狀。左慈丸是中醫治療耳聾的經典名方，出自《飼鶴亭集方》，在2020版《中國藥典》［6］中錄入的名稱為“耳聾左慈丸”，處方中中藥的組成包括熟地黃、茯苓、山藥、煅磁石、山茱萸、丹皮、柴胡、澤瀉共八味，主治功能為滋腎平肝，治療肝腎陰虛的耳聾、耳鳴等癥。目前研究證實，左慈丸對藥物性耳聾、突聾、老年性耳聾以及中耳炎導致HL均有確切療效［7-8］。此外，動物實驗研究提示，左慈丸可能對耳蝸內組織的水通道蛋白4以及血清氧自由基產生影響，從而減少HL［9］。目前，關于左慈丸治療PMS-HL的研究鮮見報道，因此，左慈丸治療PMS-HL的具體作用靶點和組織生物學途徑有待進一步闡明。

網絡藥理學可系統闡釋多組分中藥的靶標蛋白及其生物學作用［10-11］。分子對接技術可以通過化學計量學科支持，模擬化學分子的幾何結構，通過兩分子之間的作用關系，闡明藥物與靶蛋白或活性位點的相互作用，預測其結合模式與親和力［12］。因此，本研究使用網絡藥理及分子對接技術，對左慈丸的有效成分及其治療PMS-HL的生物學機制進行研究并進行動物學驗證，為其臨床應用奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 網絡藥理學

本文數據庫檢索時限均為建庫至2023-02-28。

1.1.1 左慈丸有效成分與作用靶點的收集與篩選：使用TCMSP數據庫［13］對煅磁石、柴胡、熟地黃、山茱萸、丹皮、山藥、茯苓、澤瀉的相關活性成分進行篩選，推算作用靶點。活性成分滿足以下條件：類藥性（oral bioavailability，OB）≥30%；藥物相似性（drug likeness，DL）≥0.18［14］。刪除重復的靶點后，使用Uniprot數據庫［15］（http：//www.uniprot.org/）進行分析，限定物種為人（已驗證），對靶點名稱進行標準化。

1.1.2 PMS-HL疾病靶點獲取：使用GeneCards［16］（https：//www.genecards.org/）、OMIM［17］（https：//omim.org/）、TTD［18］（http：//db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank［19］（https：//go.drugbank.com/）、PharmGKB［20］（https：//www.pharmgkb.org/）數據庫，以“climactic syndrome”“primenopause syndrom”“menopause syndrome”“menopausal syndrome”“deaf”和“hearingloss”作為檢索詞，篩選PMS-HL的靶點基因集，刪除交集靶點后得到PMS-HL的靶點，導入Uniprot數據庫，對靶點名稱進行標準化。

1.1.3 繪制“藥物-活性成分-靶點”網絡圖：分別整理左慈丸的藥物靶點以及PMS與HL的疾病靶點，導入Jvenn網站［21］（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/），進行映射取交集，繪制韋恩圖；采用Cytoscape 3.9.1軟件［22］導出藥物關聯活性成分與治療靶點的網絡圖，利用內置工具Network Analyzer篩選核心活性成分。

1.1.4 構建左慈丸治療PMS-HL的蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡：利用String數據庫［23］（https：//string-db.org/）研究左慈丸相關靶點與靶點間的相互作用。將交集靶點導入數據庫，物種設置為“Homo Sapiens”，構建PPI網絡。利用Cytoscape 3.9.軟件繪制PPI網絡圖。使用Network Analyzer推算拓撲參數分析，根據Betweenness Centrality（中心度值）、Closeness Centrality（緊密中心度值）、Degree（節點連接度值）篩選核心靶蛋白。

1.1.5 基因本體論（GO）功能與京都基因和基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析：將左慈丸治療PMS-HL的靶基因上傳至Metascape數據庫［24］（http：//metascape.org/gp/index.html），物種：“Homo Sapiens”，得出GO功能和KEGG信號通路的富集結果（以P<0.01為差異有統計學意義）。GO富集分析包含3個方面：細胞組分（cellularcomponent，CC）、生物過程（biologicalprocess，BP）和分子功能（molecularfunction，MF）。結果設置：值截止<0.01，最小重疊>3，最小富集>1.5。使用Bioinformatic平臺（http：//bioinformatics.com.cn/）繪制GO和KEGG前20個結果的氣泡圖，數據可視化處理，使用Cytoscape 3.9.1繪制“藥物-活性成分-靶點-疾病-信號通路”圖。

1.2 分子對接驗證

1.2.1 建立有效化合物配體及受體：在建立配體時，選擇核心小分子化合物。Pubchem數據庫［25］（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索化合物并保存其3D結構。經PyMOL 2.6.1處理后，該化合物能量最小化，保存為mol2格式。在PDB數據庫［26］（https：//www.rcsb.org/）中搜索核心靶點的三維結構（PDB格式），篩選原則：人類來源、具有高分辨率并且具有原始配體。以核心靶點作為受體。

1.2.2 分子對接驗證：核心靶點蛋白經過PyMOL 2.6.1軟件處理，將其水分子剝離，去除原始配體。采用AutoDock Tools［27］軟件處理核心靶點和小分子化合物。利用AutoDock 1.5.7［28］和PyMOL 2.6.1軟件進行分子對接和結果可視化，轉化為三維圖形，導出熱圖分析結果。

1.3 白介素1β（IL-1β）血清水平檢測

1.3.1 研究對象：雌性SD大鼠［動物合格證號：SCXK（京）2019-0008，均由北京華阜康生物有限公司提供］，10周齡，SPF級，室溫恒溫（16～24℃），濕度45%～55%，日光照12 h，去豆粕飼料，自由飲水。本方案已通過南開大學實驗動物倫理委員會批準。

1.3.2 造模及分組：將60只大鼠編號，采用隨機數字表法分為3組：假手術（SHAM）組、去卵巢（OVX）組、左慈丸（ZCW）組，每組20只。10周齡時，SHAM組進行假手術、OVX組與ZCW組進行去卵巢手術。手術5～10 d后，進行陰道涂片巴氏染色，判斷大鼠動情周期。12～16周齡時，ZCW組進行左慈丸湯劑（自制）灌胃，SHAM組、OVX組等同劑量生理鹽水灌胃。大鼠用藥劑量遵循鼠-人劑量折算公式：大鼠劑量=人臨床劑量×70 kg（人均體質量）×0.018/200 g（大鼠體質量）。

1.3.3 藥物制備：左慈丸湯劑（熟地黃24 g、山茱萸12 g、山藥12 g、茯苓9 g、澤瀉9 g、丹皮9 g、柴胡3 g、鍛磁石3 g），原料藥物均一次性購于天津中醫藥大學第一附屬醫院，并由該院煎藥室煎制，湯液密封裝袋。后水煎液制備濃縮至0.3 g/mL。

1.3.4 標本采集：連續干預給藥4周，麻醉狀態下腹主動脈取血，血液室溫條件下靜置30 min，使用低溫離心機（4 ℃，3 000 r/min，離心10 min）處理，取上清液，-20 ℃保存。

1.3.5 指標檢測：血清中白介素1β（IL-1β）蛋白使用酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測。

1.4 統計學分析

采用SPSS 26.0統計學軟件進行數據處理。本研究計量資料均符合正態分布，以（x-±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 左慈丸與作用靶點

通過TCMSP數據庫篩選出活性成分90個，其中柴胡17個，山茱萸20個，熟地黃2個，山藥16個，茯苓15個，丹皮10個，澤瀉10個。該數據庫未收錄煅磁石的活性成分，根據文獻補充的錳、銅、鋅以及四氧化三鐵4種化合物均未達到篩選條件，所以刪除。刪除活性成分中交集項目，刪除Uniprot數據庫無法找到official-symbol活性成分的化合物，得到活性成分52個，其中，有4種化合物是左慈丸內不同中藥共有的活性成分，見表1。利用TCMSP數據庫中的“Related Targets”模塊，獲得左慈丸活性成分對應的靶蛋白226個。導入Uniprot標準化名稱，刪除重復及非人類靶蛋白，導出靶蛋白216個，對應基因506個。

2.2 PMS-HL疾病相關靶點基因與藥物靶點映射

通過利用檢索GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank及PharmGKB數據庫，刪除重復靶點后，疾病相關基因靶點分別為：PMS 3 700個，HL 10 602個，取交集后導出PMS-HL基因2 481個，再與左慈丸治療靶點取交集，最終獲得左慈丸治療PMS-HL藥物靶點150個。通過Cytoscape 3.9.1軟件構建“左慈丸-活性成分-藥物靶點”的可視化網絡圖，經過篩選共獲得左慈丸藥物包含的52種化學成分，靶蛋白148個，相應靶基因150個（圖1）。

2.3 “左慈丸-活性成分-藥物靶點”網絡圖分析

將150個靶蛋白通過Cytoscape軟件繪制“左慈丸-活性成分-藥物靶點”網絡圖，獲得網絡節點206個，其中藥材節點7個、化合物節點50個、靶點節點150個，邊642條，見圖2。通過Network Analyzer軟件對網絡中的拓撲參數進行計算，并對中心度值、緊密中心度值、節點連接度值較大的節點進行篩選，得到藥物作用的關鍵樞紐靶點。每個靶點平均與化合物相互作用的個數為13.1，每個化合物平均與靶點相互作用的個數為3.9。提示了左慈丸組方內多種化合物成分與多治療靶點具有共同作用，體現了左慈丸治療MPS-HL疾病的組方具有整體性和聯系性的特點。通過篩選得出節點連接度值前8位的活性成分：槲皮素、山柰酚、豆甾醇、β-谷甾醇、異鼠李素、薯蕷皂苷、四氫鴨腳木堿、海風藤酮。左慈丸的4種共有活性成分（槲皮素、山柰酚、豆甾醇、β-谷甾醇）均在前8位，見表2。網絡中靶基因的面積大小依據degree設定，由圖2可知PTGS2、PGR、NR3C2、HSP90AA1、TOP2A、F2R、ADRB2、DPP4、F10、PPARG、CHRM2等靶基因度值較大。

2.4 左慈丸治療PMS-HL潛在作用靶點互作網絡構建與分析

將靶基因導入String數據庫獲取左慈丸治療PMS-HL靶點間相互作用關系數據，下載TSV文件，導入Cytoscape 3.9.1進行可視化及并使用Mcode進行基因連通性分析，得到PPI網絡，以Mcode分數定義靶點基因大小，分數越高者為位于調控網絡中心連通性較高的靶基因，兩種靶基因相互關系證據程度分數（combine score）以邊的顏色表示（圖3A）。在該網絡中具有節點150個，邊2 770條。緊密中心度值平均值為0.544 944 496、節點連接度值平均值為36.93、中心度值平均值為0.005 950。以節點連接度值73.86、中心度值≥0.011 9作為條件篩選得出核心網絡圖（圖3B）。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、細胞腫瘤抗原p53（TP53）、白介素6（IL-6）、血管內皮生長因子（VEGFA）、胱天蛋白酶3（CASP3）、IL-1β、表皮生長因子受體（EGFR）、雌激素受體1（ESR1）、腫瘤相關性蛋白（MYC）、缺氧誘導因子（HIF1A）為節點連接度值排名前10位靶蛋白，見表3。

2.5 GO功能和KEGG信號通路富集分析

GO功能富集分析：生物過程（biological process，BP）分析獲得183個條目，其中排名前3位的分別為：response to xenobiotic stimulus（對異種刺激的反應）、response to hormone（對激素的反應）、response to inorganic substance（對無機化合物的反應）；細胞組分（cell component，CC）分析獲得78個條目，其中排名前3位的分別為：membrane raft（膜筏）、vesicle lumen（囊泡腔）、transcription regulator complex（轉錄調節復合體）；分子功能（molecular function，MF）分析獲得103個條目，其中排名前3位的分別為：kinase binding（蛋白激酶結合）、DNA-binding transcription factor binding（DNA結合轉錄因子結合）、protein domain specific binding（蛋白質結構域特異性結合）。分別選取BP、CC、MF結果排名前20位的過程繪制GO功能氣泡圖，見圖4。

KEGG信號通路富集分析共獲得161條信號通路，選取最為顯著的20個過程繪制KEGG信號通路富集氣泡圖，見圖5。使用Cytoscape 3.9.1繪制KEGG信號通路富集制“藥物-活性成分-靶點-疾病-信號通路”圖，見圖6。

2.6 分子對接

利用AutoDock軟件將槲皮素、山柰酚、豆甾醇、谷甾醇、異鼠李素、薯蕷皂苷、四氫鴨腳木堿、海風藤酮（即“左慈丸-活性成分-藥物靶點”網絡圖節點連接度值最高的8個活性成分）與AKT1、TP53、IL-6、VEGFA、CASP3、IL-1β、EGFR、ESR1（PPI網絡圖中8個核心蛋白）進行分子對接。以上核心蛋白PDB數據庫編號分別為：7nh5、4rg2、1aIu、3qtk、3kjf、3ltq、8a27、5aav。其中二者結合能≤0 kcal/mol說明兩者可以結合，結合能≤-2.0 kcal/mol說明有較好的結合能力［10］，結合能越低，即結合越穩定。結果顯示，化合物與靶蛋白的結合能如熱圖（圖7）所示，提示左慈丸中的8種化學成分與靶點蛋白與化合物綜合結合能力較強的蛋白為IL-1β與ESR1。利用PyMOL軟件對結果進行三維圖轉化，圖中可展示活性成分與蛋白的分子對接，見圖8。

2.7 模型檢測

大鼠去勢后5～10 d，經陰道脫落細胞巴氏染色（圖9）發現，SHAM組大鼠的脫落細胞中有被染成粉紅色、鱗狀脫落的角質細胞及膨大的橢圓形上皮細胞，提示大鼠可能處于動情期及動情前期。OVX組與ZCW組只有透明藍黑色核深染的白細胞和少量較小的扁平上皮細胞，提示OVX組與ZCW組大鼠均無動情周期。

2.8 IL-1β檢測及分析

給藥4 周后，大鼠主動脈取血檢測血清IL-1β。3組大鼠血清IL-1β水平比較，差異有統計學意義（P<0.05）；其中OVX組、ZCW組大鼠血清IL-1β水平均高于SHAM組，而ZCW組大鼠血清IL-1β水平低于OVX組，差異有統計學意義（P<0.05），見表4。

3 討論

目前研究發現雌激素能夠減少聽力的損失，絕經期使用MHT能夠減緩女性絕經時帶來的HL［2-4］。但由于雌激素是具有多種功能的類固醇激素，在身體的其他組織和器官的細胞內也有受體，因此臨床上并沒有針對PMS-HL的癥狀而使用MHT。

左慈丸是治療腎虛類耳聾的名方，臨床研究數據表明，左慈丸可治療感音性耳聾、老年性耳聾以及慢性分泌性中耳炎導致聽力下降等疾病；研究發現左慈丸可能通過抗氧化應激以及影響細胞的自噬與凋亡通路，進而緩解年齡相關的HL［6-8］。但目前沒有針對左慈丸治療PMS-HL的相關研究。本研究創新性地將圍絕經期與HL的疾病靶點進行匯總導出并取得交集，從而獲得PMS-HL的潛在治療靶點。

通過網絡藥理學對左慈丸中藥成分進行研究，根據“左慈丸-活性成分-藥物靶點”網絡圖，發現其活性成分排名靠前的為槲皮素，山柰酚、豆甾醇、β-谷甾醇、異鼠李素、薯蕷皂苷、四氫鴨腳木堿和海風藤酮。其中，槲皮素、山柰酚、豆甾醇和β-谷甾醇均為左慈丸中多味中藥共同含有的活性成分。進一步對其活性成分的治療靶點與PMS-HL靶點取交集，篩選潛在靶基因，并進行富集分析。GO富集結果提示，靶蛋白主要集中在細胞的細胞膜筏、囊泡腔以及轉錄調節復合體等位置，生物過程主要表現為對異種刺激的反應、對激素的反應和對無機化合物的反應，其生物功能表現為蛋白激酶結合、DNA結合轉錄因子結合以及蛋白質結構域的特異性結合。KEGG分析提示，在基因靶點富集的疾病通路中，前3名分別是：癌癥通路、脂質與動脈粥樣硬化病變通路和化學致癌的受體激活通路。

既往研究表明，耳聾的發病與伴隨衰老出現的代謝異常明顯相關；血黏度、血脂增高以及動脈粥樣硬化和糖尿病等可作為獨立因素導致聽功能異常的發生［29-30］。左慈丸中的黃酮類活性成分：槲皮素、山柰酚、異鼠李素以及海風藤酮具有顯著的抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降血脂以及免疫保護等藥理作用和生物活性［31-32］；有研究發現，該類化合物能緩解慢性中耳炎、氧化應激等導致的HL［33-34］。左慈丸中植物甾醇類活性成分：β-谷甾醇和豆甾醇具有抗氧化、降血糖、降低膽固醇的作用［35-36］，但目前沒有研究發現該類化合物與聽力直接相關，提示該類活性化合物可能通過血糖、血脂的調節及抗氧化應激等途徑間接保護聽力功能。左慈丸中多種中藥共有的活性成分具有一致性，這也體現了中藥配伍中的“相須”和“相使”原則，即性能相似者以增強療效；作用在同一生物學通路者，一種藥物可以輔助另一種藥物來提高其原有的療效。

PPI網絡中排名前8位的靶基因AKT1、TP53、VEGFA、IL-6、CASP3、IL-1β、EGFR、ESR1等，體現了中藥復方多靶點治療的特點。通過分子對接結合能數據發現，核心蛋白與核心活性成分之間的結合能均≤-2.0 kcal/mol，說明藥物和靶蛋白之間具有較好的結合能力，相互作用穩定。其中，綜合結合能最為穩定的是IL-1β和ESR1。IL-1β是IL-1家族中最為重要的成員，IL-1家族在生物體先天性免疫中發揮著重要作用。有動物研究發現，當胰島素生長因子1缺乏時，在噪聲暴露環境下的衰老大鼠血清IL-1β水平增多，HL更為明顯［37］，這可能是造成糖尿病HL的病理機制。并有研究發現，衰老、噪聲以及耳毒性藥物導致的HL都會引起血清IL-1β水平增多［38］。本研究建立去勢模型，驗證了雌激素缺失可導致血清IL-1β水平升高，而左慈丸治療能夠降低其血清IL-1β水平。該結果提示，左慈丸可能是通過IL-1β調控其下游，進而減少HL。ESR1是雌激素受體α，在前期研究中發現，該蛋白在內、外毛細胞和螺旋神經節上均有分布；雌激素的減退會影響外毛細胞中的動力蛋白含量，并會導致大鼠高頻聽力聽閾升高［39］。本研究結果顯示，左慈丸中的活性成分可能與ESR1結合，發揮雌激素樣作用，從而減少雌激素導致的HL。但由于沒有對雌激素通路下游的蛋白進行檢測，左慈丸是否具有雌激素同樣的分子生物學功能仍有待驗證。

綜上所述，本研究利用網絡藥理學和分子對接技術，初步研究左慈丸治療PMS-HL的作用機制，闡述左慈丸可能通過其活性成分槲皮素、山柰酚、豆甾醇、β-谷甾醇、異鼠李素、薯蕷皂苷、四氫鴨腳木堿和海風藤酮，作用于AKT1、EGFR、TP53、VEGFA、IL-6、CASP3、IL-1β、ESR1等靶點，通過癌癥通路、脂質代謝與動脈粥樣硬化病變通路以及化學致癌的受體激活等通路，多靶點、多通路協同保護聽力。研究結果體現了中藥復方配伍的嚴謹性和實用性，為闡明PMS-HL生理病理過程以及左慈丸對該癥的治療作用及其機制奠定理論基礎。但本研究受實驗條件影響，未能對左慈丸入血的有效成分進行進一步探索，僅利用分子結合能推理出關鍵蛋白，并進行動物實驗驗證。可能會忽略其他化合物，從而錯失更為關鍵的靶蛋白。此外，期待未來的研究能夠對動物進行測聽驗證，進一步完善實驗。

作者貢獻：刁翯負責設計文章思路與框架，繪制圖表，動物實驗，數據結果和可視化呈現，撰寫論文，對文章整體負責；白文佩、趙立東負責論文終稿審校及質量控制。

本文無利益沖突。

參考文獻

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