CIN Ⅲ級患者陰道菌群改變及其與LEEP術后復發的關系分析

姚遠，趙志如，宋嬈

（鄭州市金水區總醫院 婦科，河南 鄭州 450000 ）

宮頸上皮內瘤變（CIN）是一組與宮頸浸潤癌密切相關的癌前期病變的統稱，可分為CIN Ⅰ級、CIN Ⅱ級、CIN Ⅲ級，其中CIN Ⅰ級為低級別的癌前病變，癌變率低，絕大多數CIN Ⅰ級患者可自行恢復正常，少部分發展為CIN Ⅱ～Ⅲ級，而當發展至CIN Ⅲ級時患者進展為浸潤性宮頸癌的風險將增大12%，嚴重威脅患者的生命健康［1-2］。目前，外科手術是治療CIN Ⅲ級的重要方式，其中宮頸環形電切術（LEEP）因具有操作方便、創傷小等優勢已廣泛應用于治療該類患者［3］。然而不足的是，部分CIN Ⅲ級患者經LEEP 治療后仍存在病變殘留、復發的情況，極易進展為宮頸癌，影響患者預后。因此，臨床應盡早識別和控制CIN Ⅲ級患者LEEP 術后復發的危險因素，以降低宮頸癌發生風險，改善患者預后。女性陰道微環境中存在多種細菌定植，這些微生物菌群是維持陰道微生態平衡的關鍵［4］。因女性生理結構特殊，宮頸上皮細胞直接暴露于陰道微環境中，容易受到病毒、細菌等多種病原體的侵襲，極易發生病變［5］。有研究顯示［6］，CIN 的發生與陰道微生物菌群變化有關。但關于CIN Ⅲ級患者陰道菌群改變及其與LEEP 術后復發的關系研究較為少見。因此，本研究通過探討CIN Ⅲ級患者陰道菌群改變及其與LEEP 術后復發的關系，以期為臨床防控提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年3 月至2020 年8 月于鄭州市金水區總醫院行LEEP 治療的432 例CIN Ⅲ級患者為疾病組，年齡22～55 歲，平均（40.78±6.72）歲；體重指數（BMI）為19.41～28.04 kg/m2，平均（23.45±2.33）kg/m2；孕次0～3 次，平均（1.89±0.53）次；產次0～3 次，平均（1.58±0.32）次；首次性生活年齡18～29 歲，平均（23.26±3.38）歲。另選取同期體檢的健康女性420 例為對照組，年齡20～60 歲，平均（41.23±6.28）歲；BMI 為19.12～28.34 kg/m2，平均（23.32±2.15）kg/m2；孕次0～3 次，平均（1.93±0.41）次；產次0～3 次，平均（1.62±0.35）次；首次性生活年齡18～29歲，平均（23.55±3.12）歲。本研究經倫理委員會審核批準。兩組年齡、BMI、孕次、產次、首次性生活年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

納入標準：①疾病組均經細胞學及組織病理學確診為CIN，術后經病理學檢查證實；②CIN 病理學分級均為Ⅲ級；③年齡≥18 歲；④疾病組均接受LEEP 治療；⑤近3 個月內未使用過抗生素及陰道藥物；⑥月經規律，1 周內無性生活；⑦對照組經體檢均身體健康；⑧受試者均知情同意，且術后隨訪方便。

排除標準：①合并宮頸糜爛、陰道潰瘍、陰道炎、盆腔炎、尿道炎；②月經期、妊娠期、哺乳期女性；③宮頸病變史者；④合并其他部位惡性腫瘤；⑤合并重要臟器功能不全、免疫系統疾病、造血系統疾病、凝血功能障礙；⑥既往接受子宮全切術治療者。

1.2 方法

1.2.1 陰道分泌物采集及菌群檢測 ①陰道分泌物采集：患者取截石位，使用窺器暴露患者陰道，采用兩支無菌棉簽輕拭陰道壁上1/3 段位置，將無菌棉簽旋轉4～5 周，檢查棉簽上是否附著分泌物，若棉簽上可見清晰的分泌物附著，則表示采集成功；②陰道菌群檢測：將其中一支棉簽分泌物制成玻片，常規革蘭氏染色后在顯微鏡下進行觀察菌群密集度、菌群多樣性、霉菌、滴蟲、乳酸桿菌的檢出情況，另一支棉簽分泌物用于檢測Nugent 評分、pH 值、白細胞酯酶（LE）、過氧化氫（H2O2）、唾液酸苷酶（SNA）、β-葡萄糖醛酸苷酶（GUS）、乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）。其中菌群密集度以顯微鏡下細菌計數分級，Ⅰ級：細菌計數1～99 個；Ⅱ級：細菌計數100～999 個；Ⅲ級：細菌計數＞1 000 個；Ⅳ級：滿視野；Ⅰ、Ⅳ級為異常菌群密度構成，Ⅱ、Ⅲ為正常菌群密度構成。菌群多樣性以顯微鏡下細菌種類分級，Ⅰ級：細菌種類1～3 種；Ⅱ級：細菌種類4～6 種；Ⅲ級：細菌種類7～9 種；Ⅳ級：細菌種類＞10 種；Ⅰ、Ⅳ級為異常菌群多樣性構成，Ⅱ、Ⅲ為正常菌群多樣性構成。Nugent 評分［7］以半定量評估法對乳桿菌、加德納菌以及普雷沃菌、動彎桿菌進行評分，細菌性陰道病（BV）為＞7 分、BV 中介為4～6 分、正常為0～3 分。乳酸桿菌陽性：在顯微鏡下，5 個視野中乳酸桿菌的平均數量為＞5 個；pH 值正常范圍為3.8～4.5。

1.2.2 術前檢查及手術方法 患者均行陰道鏡活檢、經液基薄層細胞學檢查（TCT），活檢組織送病理檢查，確診后行LEEP 治療。術前行高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）檢查，采用2 代雜交捕獲法，一次檢測13 種高危型HPV 亞型。采用待檢樣本的相對光單位（RLU）和標準陽性對照（PC）之比判斷HPV 陽性，其中RLU/PC≥500 為病毒高負荷狀態，RLU/PC＜500 為病毒低負荷狀態。CINⅢ級患者均于月經結束后1 周行LEEP 治療。術前排空膀胱，患者取截石位，進行常規消毒、鋪巾，使用窺器充分暴露宮頸，對陰道、宮頸進行消毒后，在宮頸3、6、9、12 點方向局麻后將復方碘溶液涂至宮頸表面，明確病變區域，再根據病變大小對病灶進行切除。將LEEP 刀調整至電切模式，混切50 W，電凝25 W，距碘不著色范圍3～5 mm外進行環切，深度根據CIN 范圍約為5～20 mm，以1 cm 三角刀自宮頸9 點方向沿宮頸外口順時針旋轉360°，一次環切切除病灶，切除過程中盡量減少停頓，以確保切除標本的完整性，術中創面若出現活動性出血需采用球形電極凝固止血，并填塞含血凝酶紗布壓迫止血，24 h 后取出。

1.2.3 術后隨訪及分組 術后通過復查的形式對患者進行兩年的隨訪，每半年進行1 次復查，復查內容包括陰道鏡、TCT 和HR-HPV 檢查。術后半年內無CIN 病變存在為痊愈，術后1 年內有CIN 病變存在為病變殘留，術后≥1 年后重新出現CIN 病變為復發［8］。將LEEP 術后復發的CIN Ⅲ級患者納入復發組，LEEP 術后未復發的CIN Ⅲ級患者納入未復發組。

1.3 資料收集

收集患者一般資料，包括年齡、BMI、孕次、產次、首次性生活年齡、吸煙、絕經狀態、術前TCT 結果、術前HR-HPV 載量、是否累及腺體、手術切緣狀態、病變累及象限等。

1.4 觀察指標

①疾病組術前與對照組陰道菌群指標比較；②術后隨訪情況及復發組與未復發組手術前及術后6 個月時陰道菌群改變比較；③復發組與未復發組一般資料比較；④CIN Ⅲ級患者LEEP 術后復發的影響因素分析，包括比值比（O^R）、95% 可信區間（95%CI）。

1.5 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料均符合正態分布，用均數±標準差（）描述，以獨立樣本t檢驗組間差異；計數資料用百分率（%）描述，以χ2檢驗，若任一理論頻數＞1且＜5 需對檢驗校正，等級分布資料采用秩和檢驗組間差異；采用Logistic 多元回歸分析探討CIN Ⅲ級患者LEEP 術后復發的影響因素。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 疾病組術前與對照組陰道菌群指標比較

疾病組術前菌群密集度異常、菌群多樣性異常、霉菌（+）、滴蟲（+）、Nugent 評分＞7 分、pH值＞4.6、LE（+）、H2O2（+）、SNA（+）、GUS（+）占比均高于對照組（P＜0.05），乳酸桿菌（+）占比低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；兩組NAG（+）比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 疾病組術前與對照組陰道菌群指標比較 ［n(%)］

2.2 術后隨訪情況及復發組與未復發組術前及術后6 個月時陰道菌群改變比較

LEEP 術后對432 例CIN Ⅲ級患者隨訪兩年，有41 例患者術后復發，復發率為9.49%。復發組與未復發組術前、術后6 個月NAG（+）占比比較差異均無統計學意義（P＞0.05），術后6 個月菌群密集度異常、菌群多樣性異常、霉菌（+）、滴蟲（+）、Nugent 評分＞7 分、pH 值＞4.6、LE（+）、H2O2（+）、SNA（+）、GUS（+）占比均低于術前（P＜0.05），乳酸桿菌（+）占比均高于術前；術后6 個月復發組菌群密集度異常、菌群多樣性異常、Nugent 評 分＞7 分、pH 值＞4.6、LE（+）、SNA（+）、GUS（+）占比均高于未復發組（P＜0.05），乳酸桿菌（+）占比低于未復發組（P＜0.05）。見表2。

表2 復發組與未復發組術前及術后6 個月時陰道菌群改變比較 ［n(%)］

2.3 復發組與未復發組一般資料比較

復發組與未復發組年齡、BMI、孕次、產次、首次性生活年齡、吸煙、術前TCT 結果、病變累及象限比較差異無統計學意義（P＞0.05），復發組絕經、術前HR-HPV 載量高負荷、累及腺體、手術切緣陽性占比均高于未復發組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 復發組與未復發組一般資料比較

2.4 CIN Ⅲ級患者LEEP 術后復發的影響因素分析

經Logistic 回歸分析可知，術后6 個月的菌群密集度異常、菌群多樣性異常、Nugent 評分＞7分、pH 值＞4.6、LE（+）、SNA（+）、GUS（+）、絕經、術前HR-HPV 載量高負荷、累及腺體、手術切緣陽性均為影響CIN Ⅲ級患者LEEP 術后復發的危險因素（P＜0.05），乳酸桿菌（+）為CIN Ⅲ級患者LEEP 術后復發的保護因素（P＜0.05）。見表4。

表4 多因素Logistic 回歸分析

3 討論

宮頸癌在女性惡性腫瘤中最為多見，發病率呈逐年上升趨勢，且逐漸趨于年輕化，對女性生命健康造成嚴重威脅［9］。CIN 是宮頸癌的癌前病變之一，研究顯示［10］，CIN Ⅱ～Ⅲ級具有較高的癌變率，故需積極治療以降低風險。LEEP 是臨床治療CIN Ⅲ級的常用方法，能夠有效切除病灶，但部分患者仍存在術后復發的風險，且復發病灶進展至浸潤性癌的風險更高。本研究中CIN Ⅲ級患者LEEP 術后復發率為9.49%，與既往司馬琴［11］研究結果相近，均證實CIN Ⅲ級患者LEEP 術后有較高的復發風險。因此，需積極探討CIN Ⅲ級患者LEEP 術后復發的相關危險因素，并及早采取有效的防治措施，以降低宮頸癌的發生風險。

本研究結果顯示，術前疾病組菌群密集度異常、菌群多樣性異常、霉菌（+）、滴蟲（+）、Nugent 評分＞7 分、pH 值＞4.6、LE（+）、H2O2（+）、SNA（+）、GUS（+）占比均高于對照組，乳酸桿菌（+）占比低于對照組，提示與健康女性相比，CIN Ⅲ級患者陰道菌群失衡，有害菌呈不同程度定植，優勢菌減少。陰道生態系統由多種類、多數量的微生物構成并形成與宿主、環境相互制約、相互協調的一種動態平衡，對維護陰道自凈及身體健康具有重要意義［12］。有研究顯示［13］，陰道內致病菌數量增多、乳酸桿菌數量減少將會影響pH值及陰道清潔度的改變，從而擾亂陰道微生態平衡，破壞局部免疫細胞功能，由于女性生理結構特殊，宮頸上皮細胞直接暴露于陰道微環境中，易發生病理改變，最終導致各種陰道疾病的發生。由此可見，陰道微生物菌群失調與女性生殖疾病密切相關。

本研究Logistic 回歸分析發現，術后6 個月的菌群密集度異常、菌群多樣性異常、Nugent 評分＞7 分、pH 值＞4.6、LE（+）、SNA（+）、GUS（+）均為影響CIN Ⅲ級患者LEEP 術后復發的危險因素，乳酸桿菌（+）為CIN Ⅲ級患者LEEP 術后復發的保護因素。正常情況下，宮頸陰道菌群種類、數量繁多，以乳酸桿菌為優勢菌，乳酸桿菌能夠通過分解引導上皮糖原產生乳酸維持酸性環境，從而維持正常菌群密集度及多樣性；此外乳酸還能夠分泌H2O2、細菌素等，不僅能夠直接殺滅細菌或病毒，還能夠激活免疫細胞，提高陰道局部免疫功能［14-15］。乳酸桿菌（+）占比少提示患者陰道微生態平衡被破壞，陰道菌群失調、清潔度異常，在堿性條件下陰道鱗狀上皮內化生延長，產生丙酸、丁酸等有害物質損害上皮細胞，對HPV感染具有協同作用。曾江忠等［16］研究顯示，陰道菌群密集度異常、菌群多樣性異常均為導致HPV感染或感染持續的高危因子，增加CIN Ⅲ級患者LEEP 術后復發的風險；Nugent 評分＞7 分提示患者存在BV，BV 是一類微生物疾病，該病易導致流產、胎膜早破、HPV 感染等，病原菌進入陰道后，機體會產生炎癥介質，有利于增加局部血流和血管通透性，從而達到清除病原微生物的目的，但持續的刺激可逐漸進展為慢性炎癥反應，局部創傷使新生癌細胞增加，從而導致術后復發；pH值＞4.6 提示陰道內優勢菌為乳酸桿菌的數量減少，陰道自潔功能減弱，微生物菌群失調，術后復發風險增加；LE、SNA、GUS 均為陰道菌群代謝產物，能夠反映陰道炎癥水平或致病菌增殖水平［17］。LE 是白細胞在炎癥狀態下分泌的一種特異性酶類，SNA 是厭氧菌產生的代謝物，GUS 是參與腫瘤細胞侵襲或轉移過程中的基質降解酶，LE（+）、SNA（+）、GUS（+）均提示患者存在XU 等［18］研究顯示，BV 是HPV 感染的高危因素，BV 能夠導致陰道及宮腔黏膜屏障被破壞，使HPV 進一步感染，從而導致術后復發。

另本研究結果還顯示，絕經、術前HR-HPV載量高負荷、累及腺體、手術切緣陽性均為影響CIN Ⅲ級患者LEEP 術后復發的危險因素，與既往研究結果一致［19-20］。女性絕經后會發生宮頸萎縮，從而使移行帶內移入宮頸管內，且隨著年齡的增大，患者免疫功能逐漸下降，術后再次感染HPV的風險增大，故更易復發；HR-HPV 是引起CIN的主要原因，術前HR-HPV 載量越高，HPV 復制越活躍，引起宮頸炎癥損傷，誘發上皮內瘤變，不僅如此，HR-HPV 載量高負荷使手術難度增加，病灶切除后易出現殘留，從而導致術后復發風險高；宮頸腺體一旦被化生的上皮覆蓋，手術切除難度會增加，易出現殘留，增加復發風險；手術切緣陽性說明切緣周圍仍存在病灶殘留組織，切除效果不理想，術后殘留癌細胞能夠再次增殖，易導致術后復發。

綜上所述，陰道菌群改變與CIN Ⅲ級患者LEEP 術后復發密切相關，陰道菌群失衡能夠增加術后復發的風險，此外，絕經、術前HR-HPV 載量高負荷、累及腺體、手術切緣陽性均為影響CIN Ⅲ級患者LEEP 術后復發的危險因素，CIN Ⅲ級患者LEEP 術后應規范隨訪、積極預防，以有效控制CIN 復發，臨床可根據上述因素開展針對性的防治措施，減少疾病復發，改善患者預后。