何首烏不定根黃酮閃式提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

國(guó)宇晴, 李晗熙, 白鈴泓, 姜 雯, 廉美蘭, 樸炫春

(延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133002)

何首烏(PolygonummultiforumThunb.)屬于蓼科蓼屬的植物,又名赤首烏、小獨(dú)根等,主要分布在黃河以南,以廣東、貴州、四川、湖北等地[1]。何首烏的主要化學(xué)成分包括黃酮類、酚類、二苯乙烯苷類、蒽醌類以及磷脂類等[2-4],這些化學(xué)成分與抗氧化、抗癌、抗炎等生物活性具有極大相關(guān)性[5-9]。有研究表明,黃酮類化合物具有抗氧化活性[10-11]。隨著何首烏需求量的增加,何首烏亂采濫挖的現(xiàn)象日益嚴(yán)重,以傳統(tǒng)的種子、塊根、扦插繁殖等方式為主,組織培養(yǎng)方式為輔,但仍存在市場(chǎng)供應(yīng)與需求量不對(duì)等的問(wèn)題[12]。根據(jù)何首烏離體培養(yǎng)的生長(zhǎng)特性,以何首烏不定根進(jìn)行懸浮培養(yǎng)以期高產(chǎn)[13]。生物反應(yīng)器是一種快速擴(kuò)繁的手段[14],因此,采用生物反應(yīng)器作為快速獲得何首烏不定根材料的途徑,以解決何首烏資源緊缺等問(wèn)題。

天然產(chǎn)物活性成分的提取是開(kāi)發(fā)天然產(chǎn)物的關(guān)鍵一步[15],傳統(tǒng)提取工藝包括超聲輔助提取法、水加熱提取、超聲波-微波協(xié)同提取法、熱水回流法等[16-20],隨著提取技術(shù)具有突破性進(jìn)展,閃式提取方法逐漸被關(guān)注。閃式提取法是一種將植物組織破碎的新型提取技術(shù),依靠高速機(jī)械剪切力和超動(dòng)分子滲透技術(shù),在室溫及溶劑存在下經(jīng)數(shù)秒把植物的各組織破碎以快速提取植物材料中活性物質(zhì)的方法[21-22]。已有研究發(fā)現(xiàn),何首烏提取過(guò)程中存在諸多問(wèn)題,例如傳統(tǒng)提取方法中耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)[23]、有機(jī)溶劑使用量高[24]等,因此,該試驗(yàn)采用閃式提取法對(duì)反應(yīng)器培養(yǎng)的何首烏不定根進(jìn)行提取。為對(duì)閃式提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,已有研究表明,響應(yīng)面法與正交法存在區(qū)別,正交法并不能對(duì)各個(gè)因素逐一詮釋并且不能對(duì)各因素間交互作用進(jìn)行分析,故無(wú)法建立函數(shù)模型,因此無(wú)法明確最優(yōu)方案,而響應(yīng)面可用于評(píng)估各種試驗(yàn)過(guò)程中的多個(gè)參數(shù)以及各個(gè)變量之間的交互作用,可經(jīng)建立函數(shù)關(guān)系確定最優(yōu)組合[25-30],故通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)閃式提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

該試驗(yàn)以生物反應(yīng)器培養(yǎng)的何首烏不定根為植物材料,利用閃式提取法對(duì)不定根中總黃酮進(jìn)行提取,以不定根提取物的總黃酮含量為指標(biāo)通過(guò)響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化,并利用體外抗氧化方法對(duì)何首烏不定根抗氧化活性做出評(píng)價(jià),以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力與2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基清除能力評(píng)價(jià)其抗氧化活性,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)何首烏不定根資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

將10 g新鮮的何首烏不定根接種于3 L反應(yīng)器內(nèi)(含有2 L培養(yǎng)液),培養(yǎng)基為MS+2 mg/L IBA+50 g/L蔗糖,pH值調(diào)節(jié)為5.8,通氣量為0.1 vvm,25 ℃條件下暗培養(yǎng)60 d,收獲后將不定根用自來(lái)水清洗,置于45 ℃恒溫干燥箱中烘干48 h,即得何首烏不定根干品。

1.2 黃酮閃式提取工藝的研究

試驗(yàn)用閃式提取儀(上海釩幟精密設(shè)備有限公司)提取。將3 g不定根干品以及提取溶劑放置于容器內(nèi),提取時(shí)閃式提取儀電壓為220 V,轉(zhuǎn)數(shù)5 000 r/min,通過(guò)對(duì)提取溶劑、閃式提取時(shí)間、提取溶劑濃度以及液料比的調(diào)控,優(yōu)化提取工藝。經(jīng)閃式提取儀提取后過(guò)300目篩,收集濾液,45 ℃烘干箱中烘干至恒重,稱重并計(jì)算提取率,利用硝酸鋁比色法測(cè)定提取物的黃酮含量,最后計(jì)算黃酮得率,以此作為確定提取條件的指標(biāo)。

黃酮得率/%=黃酮含量/(mg·g-1)×提取率/%×0.001.

1.2.1 單因素試驗(yàn)

1) 提取溶劑的篩選：提取溶劑為80%甲醇、80%乙醇及蒸餾水,液料比為40∶ 1 (mL∶g),提取時(shí)間50 s。

2) 溶劑濃度的篩選：將提取溶劑(乙醇)濃度設(shè)置為20%,40%,60%,80%和100%,液料比為40∶1 (mL∶g),提取時(shí)間為50 s。

3) 提取液料比的篩選：將液料比分別設(shè)置為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 (mL∶g),提取時(shí)間為50 s,依據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果使用60%的乙醇作為提取溶劑濃度。

4) 提取時(shí)間的篩選：將提取時(shí)間設(shè)置為30、40、50、60、70 s,依據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果使用60%的乙醇作為提取溶劑濃度,液料比為50∶1 (mL∶g)。

1.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以提取時(shí)間(A),溶劑濃度(B),液料比(C) 3個(gè)因素為自變量,以提取物中黃酮得率為響應(yīng)值,依據(jù)Box-Behnken法進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1),共計(jì)15個(gè)組合[31]。按照各組合條件進(jìn)行閃式提取,后對(duì)給予的優(yōu)化組合進(jìn)行3次重復(fù)的驗(yàn)證試驗(yàn),確定最佳提取工藝。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平

1.2.3 總黃酮的測(cè)定

根據(jù)張超等[32]測(cè)量總黃酮方法,應(yīng)用硝酸鋁比色法測(cè)定總黃酮含量,以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品。稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg置于容器內(nèi),加入70%乙醇溶解,并定容至250 mL。分別吸取0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0 mL的蘆丁溶液于試管內(nèi),用70%乙醇定容至2 mL。依次向試管中加入0.3 mL的5%NaNO2,靜置6 min后;再加入0.3 mL 10%Al(OH)3溶液,靜置6 min。最后,加入2.0 mL 4%NaOH溶液。于510 nm處測(cè)定OD值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取0.01 g不定根提取物,用70%乙醇溶解并定容至25 mL后,取0.2 mL至試管中并定容至2 mL,按標(biāo)準(zhǔn)品操作流程,分別加入等量的3種溶液,于510 nm處測(cè)定液體OD值。

總黃酮含量/(mg·g-1)=CVD/m,

式中,C為提取物溶液中總黃酮濃度/(mg·mL-1),V為樣品溶液體積/mL,D為液體稀釋倍數(shù),m為提取物樣品質(zhì)量/g。

1.3 抗氧化測(cè)定

1.3.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[33]的方法并稍作修改。將待測(cè)樣品溶解于去離子水中通過(guò)二倍稀釋法稀釋為不同濃度的待測(cè)樣液,吸取100 μL待測(cè)樣液,加入至100 μL 0.2 mmol/L DPPH溶液于96孔板中并混勻,室溫避光靜置30 min后,在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度。用去離子水代替樣液作為空白,用VC代替樣液作為陽(yáng)性對(duì)照,每個(gè)濃度平行測(cè)定3次后取平均值,根據(jù)下式計(jì)算樣品對(duì)DPPH自由基的清除率,并根據(jù)不同濃度提取物的清除能力計(jì)算得到半數(shù)抑制濃度(EC50)。

DPPH自由基清除率/%=A0/A1×100%,

式中,A0為空白吸光度;A1為樣品以及VC與DPPH溶液反應(yīng)后的吸光度。

1.3.2 ABTS自由基清除能力的測(cè)定

參考Hui[34]的方法并稍作修改。將2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀與7.0 mmol/L ABTS溶液按體積比1︰1混合均勻后,室溫避光過(guò)夜放置12～16 h,使用前用無(wú)水乙醇稀釋至波長(zhǎng)734 nm處吸光度為0.7±0.02,即為ABTS工作液。將待測(cè)樣品溶解并稀釋成不同濃度的待測(cè)樣液, 吸取50 μL待測(cè)樣液與150 μL ABTS于96孔板內(nèi)混勻,在黑暗條件下反應(yīng)30 min,在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定其吸光度。用甲醇代替樣液作為空白,用VC代替樣液作為陽(yáng)性對(duì)照,每個(gè)濃度平行測(cè)定3次后取平均值,根據(jù)下式計(jì)算樣品對(duì)ABTS自由基清除率,得到半數(shù)抑制濃度(EC50)。

ABTS自由基清除率/%=(A0-A1)/A0×100,

式中,A0為空白吸光度;A1為樣品以及VC與ABTS工作液反應(yīng)后的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次,利用SPSS 25.0軟件程序?qū)我蛩卦囼?yàn)中顯著性差異進(jìn)行分析,Design Expert 10.0進(jìn)行響應(yīng)面分析,GraphPad Prism 8.0軟件繪制單因素試驗(yàn)以及DPPH自由基、ABTS自由基清除試驗(yàn)圖,顯著水平P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 閃式提取溶劑對(duì)何首烏不定根總黃酮含量的影響

該研究通過(guò)閃式提取法進(jìn)行提取,首先對(duì)提取溶劑進(jìn)行優(yōu)化。

由圖1可知,當(dāng)溶劑為乙醇時(shí),何首烏不定根總黃酮得率達(dá)到最高,并顯著高于甲醇與水溶劑的黃酮得率,選擇有機(jī)溶劑作為提取溶劑,導(dǎo)致黃酮得率較高的原因可能是雜質(zhì)較少[35],因此,該試驗(yàn)選擇乙醇作為提取溶劑進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

注：數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)。

2.1.2 不同提取條件對(duì)何首烏不定根總黃酮含量的影響

經(jīng)上述試驗(yàn)選擇乙醇為提取溶劑后,對(duì)乙醇濃度進(jìn)行篩選。分別設(shè)置乙醇濃度為20%、40%、60%、80%和100%等5個(gè)處理,由圖2-A可知,總黃酮得率隨著乙醇濃度的升高呈先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì),當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí),黃酮得率達(dá)到最高,為15.5 %,當(dāng)乙醇濃度為80%以及100%時(shí),何首烏不定根黃酮得率反而降低,這可能與黃酮的組成有關(guān)系,由此可以推測(cè),何首烏不定根中的黃酮類物質(zhì)具有極性[36],因此,確定60%乙醇為最佳處理。

圖2 不同提取條件對(duì)黃酮得率的影響

確定使用60%乙醇為溶劑進(jìn)行提取后,對(duì)液料比條件進(jìn)行篩選。液料比為60%溶劑用量(mL)與不定根干品(g)的比值,試驗(yàn)將設(shè)置以下5個(gè)處理：20∶1、30∶1、40∶1、50∶1和60∶1 (mL∶g)。如圖2-B所示,黃酮得率隨料液比增長(zhǎng)而增長(zhǎng),在50∶1 (mL∶g)時(shí)達(dá)到最高,為22.88%,隨后在液料比達(dá)到60∶1 (mL∶g)時(shí),黃酮得率下降且達(dá)到最低,這可能是因?yàn)楦嗟娜軇?huì)降低溶解在溶劑中的活性物質(zhì)的傳質(zhì)阻力[37]。因此,選擇液料比為50∶1 (mL∶g)進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

經(jīng)上述試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),應(yīng)通過(guò)60%乙醇且液料比為50∶1 (mL∶g)進(jìn)行提取,為了探明時(shí)間對(duì)閃式提取何首烏不定根黃酮得率的影響,設(shè)置提取時(shí)間分別為：30、40、50、60和70 s。通過(guò)圖2-C可以看出,黃酮得率隨時(shí)間的增加而升高,在50 s后趨于穩(wěn)定,且與60和70 s差異不顯著,可能因?yàn)樵谶_(dá)到最優(yōu)處理時(shí)間后會(huì)存在顆粒過(guò)細(xì)等問(wèn)題導(dǎo)致時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而黃酮得率降低[38],并且由于50 s更為節(jié)省時(shí)間,因此,選擇50 s為最佳條件,進(jìn)行下一步響應(yīng)面優(yōu)化。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,擇出60%乙醇為提取溶劑,閃式提取時(shí)間50 s,液料比50∶1 (mL∶g)。

2.2 提取條件優(yōu)化研究

將上述單因素試驗(yàn)作為基礎(chǔ),通過(guò)響應(yīng)面分析法的Box-Behnken Design方法,進(jìn)行3因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表2),以溶劑濃度、提取時(shí)間及液料比為自變量,黃酮得率為響應(yīng)值,結(jié)果表明存在差異,經(jīng)多元擬合回歸分析,得到二次回歸模型方程：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

Y=24.62+1.56A+1.71B+1.24C+0.86AB-0.02AC+0.02BC-4.69A2-3.66B2-3.44C2,

式中,A、B及C分別為提取時(shí)間、溶劑濃度及液料比,Y為何首烏不定根黃酮得率的預(yù)測(cè)值。

圖3 兩因素交互作用對(duì)黃酮得率的影響

表3 方差分析結(jié)果

通過(guò)響應(yīng)面分析法,對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制多元二次回歸方程,即得最優(yōu)條件參數(shù)[39]。該試驗(yàn)通過(guò)對(duì)何首烏不定根閃式提取進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析,結(jié)果表明回歸模型充分?jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù),故應(yīng)用此模型分析結(jié)果以優(yōu)化何首烏不定根閃式提取工藝。回歸模型求解后最優(yōu)提取工藝各參數(shù)分別為：提取時(shí)間51.9 s、溶劑濃度65.1%、液料比51.8∶1(mL∶g),此時(shí)響應(yīng)值(黃酮得率)的預(yù)測(cè)值為25.1 %。

2.3 工藝條件優(yōu)化及驗(yàn)證

為驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的可靠度,該試驗(yàn)進(jìn)行3次平行試驗(yàn)對(duì)求解結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。由表4可知,3次重復(fù)試驗(yàn)的黃酮得率為28.74%、29.83%和31.91%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.66 %,表明3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定,與預(yù)測(cè)值吻合。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.4 何首烏不定根抗氧化活性測(cè)定

2.4.1 對(duì)DPPH自由基清除能力

為了評(píng)價(jià)何首烏不定根抗氧化活性,通過(guò)對(duì)DPPH清除能力判斷其抗氧化活性,當(dāng)抗氧化劑與呈紫色DPPH自由基結(jié)合時(shí),溶液由深紫色變?yōu)榈S色,說(shuō)明具備抗氧化能力[40]。由圖4可知,何首烏不定根粗提物(PMCE)對(duì)DPPH自由基清除能力隨提取物濃度增大而提高,且達(dá)到最高后趨于平穩(wěn)。通過(guò)計(jì)算可知,PMCE的EC50為25.9 μg/mL,VC的EC50則為10.8 μg/mL,與VC相差較小。

圖4 粗提物對(duì)DPPH自由基清除能力

圖5 粗提物對(duì)ABTS自由基清除能力

2.4.2 對(duì)ABTS自由基清除能力

ABTS自由基清除試驗(yàn)作為供氫抗氧化劑或斷鏈抗氧化劑用于測(cè)定抗氧化活性[41]。由圖7可知,PMCE對(duì)ABTS自由基的清除能力隨濃度增加而增強(qiáng),當(dāng)濃度為2 mg/mL時(shí),清除率最高,為99%,由此計(jì)算得出PMCE的EC50為148.5 μg/mL,具有良好的清除能力。

3 討論與結(jié)論

在閃式提取過(guò)程中被類似于提取溶劑、提取時(shí)間等因素影響提取結(jié)果,且需要考慮兩種因素間的交互作用,因此采用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)閃式提取工藝進(jìn)行優(yōu)化[42-44]。徐亞男等[45]以多糖得率為指標(biāo),通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)閃式提取狼毒大戟愈傷組進(jìn)行工藝優(yōu)化,結(jié)果表明,液料比為39.967∶1 (mL∶g),提取時(shí)間為50.128 s,提取水溫為52.034 ℃。張鋒等[46]研究發(fā)現(xiàn),響應(yīng)面優(yōu)化閃式提取無(wú)花果葉總黃酮工藝最優(yōu)方案結(jié)果為：提取時(shí)間87 s,乙醇體積分?jǐn)?shù)67%,液料比87∶1 (mL∶g)。李學(xué)峰等[47]通過(guò)調(diào)控閃式提取的幾種因素對(duì)貫葉連翹不定根黃酮提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,經(jīng)響應(yīng)面法分析后得出結(jié)論：77.46%甲醇在液料比52.13∶1 (mL∶g),提取65.44 s時(shí),黃酮得率最高。基于上述試驗(yàn)結(jié)論說(shuō)明響應(yīng)面法優(yōu)化閃式提取工藝具有可行性。

周新新等[48]對(duì)枳實(shí)總黃酮進(jìn)行提取工藝優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)閃式提取法以50%乙醇為溶劑為最優(yōu)溶劑。趙成萍等[49]經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化閃式提取山楂果肉總黃酮工藝發(fā)現(xiàn),最佳條件為66%乙醇,液料比44∶1 (mL∶g)、提取時(shí)間74 s,其提取溶劑與溶劑濃度與該試驗(yàn)研究結(jié)果相似。

閃式提取法突出特點(diǎn)為快速、簡(jiǎn)易地達(dá)到提取天然產(chǎn)物,但具體提取條件仍存在差異,例如當(dāng)料液比增高時(shí)會(huì)降低溶解在溶劑中的活性物質(zhì)的傳質(zhì)阻力,進(jìn)而提高傳質(zhì)速率,從而提高目標(biāo)化合物的產(chǎn)率,但過(guò)量的溶劑會(huì)導(dǎo)致更多的雜質(zhì)溶解使目標(biāo)產(chǎn)物得率降低[50];當(dāng)處理時(shí)間超過(guò)最佳值時(shí)會(huì)因?yàn)闊岱e累或者導(dǎo)致顆粒過(guò)細(xì),從而導(dǎo)致提取物黃酮得率在提取時(shí)間到達(dá)最佳后未出現(xiàn)顯著差異[38],上述過(guò)程會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)化合物的損失,這與該單因素試驗(yàn)趨勢(shì)相同。該試驗(yàn)結(jié)果表明,響應(yīng)面法優(yōu)化閃式提取何首烏不定根總黃酮最優(yōu)工藝為提取時(shí)間51.90 s,溶劑濃度65.1%,液料比51.8∶1 (mL∶g),當(dāng)何首烏不定根粗提物濃度為0.5 mg/mL時(shí),DPPH自由基清除率達(dá)到75%,當(dāng)濃度為2 mg/mL時(shí),對(duì)ABTS自由基清除率達(dá)到99 %。